Custom Engineered moldes de cultura de tecidos de Masters gravados a Laser

Este método pode facilitar a pesquisa no campo da engenharia de tecidos relacionada ao desenvolvimento de tecidos, alinhamento celular e análise mecânica de polímeros e tecidos projetados. A principal vantagem dessa técnica é que ela é de baixo custo, fácil de usar e rápida. Desenvolvemos essa técnica em meu laboratório porque o controle geométrico de tecidos projetados na escala de milímetro a centímetro não estava sendo feito em campo, e vimos uma necessidade crítica de pensar translacionalmente sobre o aumento do tamanho dos tecidos projetados.

Essa técnica nos permite aproveitar os benefícios das filas geométricas na fisiologia celular e nos tecidos projetados por meio de técnicas de fabricação usando postes e uma variedade de formas. Este método pode fornecer informações sobre a produção de tecidos projetados com tamanho, forma e alinhados controlados. Também pode ser aplicado a vários modelos de doenças, medicina regenerativa personalizada e para a tradução de tecidos projetados para estudos pré-clínicos.

Comece abrindo um programa de gráficos vetoriais em um computador. Para preparar a geometria do molde e o formato vetorial desejados, abra uma nova tela de dimensões apropriadas com o formato de cor RGB. Em seguida, selecione a ferramenta de forma no painel esquerdo e crie a geometria desejada inserindo as dimensões na parte superior da janela para definir com precisão os tamanhos das formas.

Projete as geometrias do molde para permitir pelo menos uma borda de seis milímetros da borda das características mais externas e a linha de corte para permitir o corte do menisco PDMS após a fundição do molde. Isso permitirá que o molde acabado fique nivelado com o fundo do prato de cultura. Em seguida, abra o seletor de cores no canto superior esquerdo da janela e defina novas amostras de cores compatíveis com o software de corte a laser.

Selecione cada caminho e atribua a ele uma cor apropriada da amostra de corte. Quando terminar, atribua Nenhum para a cor de preenchimento. Da mesma forma, atribua cores de amostra a caminhos de gravação selecionando o objeto e, em seguida, selecionando o caminho de gravação para a cor de preenchimento e Nenhum para a cor do caminho no seletor de cores.

Salve designs como formatos de arquivo ai or. pdf, dependendo de qual é apropriado para o programa de gráficos vetoriais e cortador a laser. Prepare o cortador a laser para cortar de acordo com as especificações do fabricante e certifique-se de que haja ventilação suficiente.

Em seguida, coloque uma folha de acrílico de 1/4 de polegada na base do laser. Ajuste a altura da cama para que fique devidamente calibrada para o acrílico. Em seguida, abra o arquivo de design no computador conectado ao cortador a laser e abra o menu Imprimir.

Certifique-se de que o cortador a laser esteja definido como a impressora e que a opção Não dimensionar esteja selecionada no menu suspenso Dimensionamento para evitar distorção do design. Em seguida, clique no botão Imprimir na parte inferior da caixa de diálogo Impressão. No utilitário de impressão do cortador a laser, clique no botão de configuração para definir os parâmetros de gravação de corte para cada um dos recursos de design.

Aqui, defina os parâmetros de potência, velocidade e pulsos por polegada para cada uma das cores escolhidas anteriormente. Depois que as configurações forem inseridas, clique no grande botão verde no software do cortador a laser. Isso fará com que o cortador a laser comece a gravar e cortar os moldes mestres negativos.

Por fim, use uma pequena escova ou ar comprimido para remover quaisquer detritos residuais dos moldes mestres negativos. Isso preparará a superfície para a fundição PDMS. Prepare uma mistura de fundição PDMS de acordo com as especificações do fabricante.

Desgaseifique o PDMS preparado em uma câmara de vácuo conectada a um laboratório de vácuo de linha padrão por uma hora ou até que todas as bolhas tenham sido eliminadas. Enquanto o PDMS está sendo desgaseificado, pegue a borda externa do molde com vinil ou fita adesiva, de modo que a fita se estenda pelo menos três milímetros acima da face gravada do molde mestre negativo. Certifique-se de pressionar a fita firmemente contra a lateral do molde para evitar vazamentos mais tarde.

Em seguida, despeje aproximadamente 0,35 mililitros por centímetro quadrado de PDMS no molde mestre para que o PDMS atinja uma espessura mínima de 1,5 milímetros. Coloque o molde mestre negativo revestido com PDMS em uma câmara de vácuo e desgaseifique novamente por uma hora ou até que todas as bolhas tenham sido eliminadas. Em seguida, coloque o molde mestre negativo revestido com PDMS desgaseificado em uma prateleira nivelada em um forno a 60 graus Celsius por pelo menos seis horas para curar o PDMS.

Depois de curado, use uma lâmina de barbear para separar os moldes individuais enquanto eles ainda estão no molde mestre negativo. Em seguida, retire lenta e cuidadosamente cada molde PDMS do molde mestre negativo. Apare todas as regiões com um menisco de fundição, o que evitaria que o molde ficasse plano, bem como qualquer excesso de material ou detritos.

Finalmente, autoclave os moldes usando um ciclo de autoclave padrão para esterilizá-los para cultura de tecidos. Para começar, cole os moldes em placas de plástico não tratadas. Prepare as soluções de fibrinogênio, trombina e colágeno neutralizado e colha as células desejadas conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Combine o fibrinogênio, o colágeno neutralizado e a suspensão celular para criar uma mistura de fundição. Mantenha a mistura de fundição no gelo. Em seguida, use um gerador portátil de alta frequência para tratar as superfícies do molde que serão expostas à mistura de fundição para mitigar a hidrofobicidade do PDMS.

Exponha as superfícies ao tratamento com plasma de três a cinco segundos, cerca de cinco minutos antes de moldar o material. Imediatamente antes de fundir a mistura de células proteicas, adicione a trombina à mistura de fundição e pipete para cima e para baixo suavemente sem introduzir bolhas. Trabalhando rapidamente, pipete a mistura de fundição nos moldes com cuidado para depositar a mistura em todos os cantos e fendas do molde.

Evite ejetar a mistura além da primeira parada da pipeta para evitar a formação de bolhas dentro das construções. Em seguida, coloque as amostras em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por 45 minutos. Após 45 minutos, devolva as construções ao capô e cubra-as com mídia celular antes de retornar à incubadora.

Altere a mídia da célula a cada 48 a 72 horas, conforme necessário para o tipo de célula e construção. Finalmente, acompanhe o protocolo de texto que acompanha a quantidade das propriedades de compactação e tração do tecido das construções, bem como para preparar várias técnicas de coloração e medir o alinhamento celular. Com o tempo e a cultura, as construções celularizadas se compactam devido à remodelação da matriz.

Isso ocorre por meio da reorganização e degradação da matriz circundante e geralmente está associado a um aumento na rigidez mecânica. A compactação direcionada também pode induzir campos de estresse dentro do tecido, que podem ser manipulados em construções celularizadas para estimular o alinhamento celular. Essas duas imagens foram tiradas de construções de tecido cardíaco que foram cultivadas em moldes retangulares de três milímetros por 17 milímetros com postes em cada extremidade.

E essas duas imagens são construções de tecido cardíaco que foram cultivadas sem restrições. As duas construções que foram restritas só foram capazes de compactar nas duas direções restantes e levaram ao alinhamento celular induzido por estresse. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para projetar, fabricar e implementar moldes de tecido personalizados em menos de um dia.

Após a formação do tecido, outros métodos, como testes mecânicos e histologia, podem ser realizados para entender melhor os efeitos do alinhamento na morfologia celular e na função do tecido. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar moldes de tecido PDMS personalizados a partir de mestres de acrílico cortados a laser.