Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição²

O objetivo geral desta metodologia é identificar as moléculas sinérgicas, que amplificam a atividade umas das outras, quando combinadas por meio de triagem de alto rendimento. Pares de medicamentos sinérgicos são uma estratégia promissora para combater infecções resistentes a medicamentos, mas são difíceis de identificar. Este método pode identificar moléculas que interagem com medicamentos antimicrobianos existentes usados para tratar doenças infecciosas.

A longo prazo, essas combinações podem entrar na avaliação pré-clínica e, eventualmente, melhorar o atendimento ao paciente. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser feita com qualquer organismo de interesse e com qualquer biblioteca de pequenas moléculas. As implicações desta técnica se estendem à terapia de múltiplas doenças infecciosas, pois funciona com qualquer organismo de interesse.

Use uma planilha padrão para calcular a pontuação média de crescimento e o desvio padrão para todos os mutantes, na presença de uma concentração específica da pequena molécula adicionada. Em seguida, calcule as pontuações Z para cada uma das concentrações de moléculas pequenas. Em seguida, destaque os mutantes genéticos com escores Z significativos.

Primeiro, cultive uma cultura de E.coli em meio mínimo M9, durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, dissolva as pequenas moléculas em sulfóxido de dimetila em alta concentração acima de 10 miligramas por mililitro. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio M9 a cada poço em uma placa de 96 poços.

Pipetar mais 100 microlitros de meio M9 na coluna um, de modo que o volume nessa coluna seja de 200 microlitros. Em seguida, adicione aproximadamente 10 microlitros da solução concentrada de moléculas pequenas, na coluna um. Depois de adicionar as pequenas moléculas, comece a diluí-las no eixo X da placa.

Continue diluindo até que haja 100 microlitros na coluna 11. Depois de misturar a coluna 11, descarte 100 microlitros dessa coluna. Que haja apenas meio na coluna 12 para normalizar os dados.

Em seguida, registre o valor da densidade óptica em 600 nanômetros da cultura noturna cultivada em meio mínimo M9. Em seguida, adicione dois microlitros da cultura em cada poço. De modo que existem 1000 células por poço.

Em seguida, agite o prato suavemente. E observe a leitura da densidade óptica em 600 nanômetros para o ponto de tempo de zero hora. Uma vez registrada a leitura, incube a placa a 37 graus Celsius por um dia.

Novamente, meça o valor da densidade óptica em 600 nanômetros para um ponto de tempo de 24 horas. Para realizar o ensaio quadriculado, cultive uma cultura de E.coli em meio mínimo M9 durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio M9 a cada poço e adicione 100 microlitros extras do mesmo meio na coluna um de uma placa de 96 poços.

Em seguida, adicione as pequenas moléculas de teste, em cada poço na coluna um. E adicione o dobro da concentração no poço A1. Em seguida, crie um gradiente de diluição ao longo do eixo X transferindo 100 microlitros, da coluna um para a coluna dois. Continuar o processo de diluição até serem adicionados 100 microlitros na coluna 11.

Depois de misturar a coluna 11, descarte 100 microlitros dessa coluna e deixe a coluna 12 apenas com meio sem drogas. Crie outro gradiente para a segunda diluição do medicamento. Para fazer isso, adicione 100 microlitros do meio contendo dois X, concentração inibitória mínima da molécula de entrada na linha A.Em seguida, transfira 100 microlitros da linha A para B.Continue o processo de diluição, até que 100 microlitros sejam adicionados na linha G.Depois de misturar a linha G, descarte 100 microlitros do poço.

Em seguida, inocule a placa com dois microlitros da cultura em cada poço. De modo que existem 1000 células por poço. Em seguida, meça a leitura da densidade óptica em 600 nanômetros para o ponto de tempo de zero hora.

Uma vez registrada a leitura, incube a placa a 37 graus Celsius por 24 horas. E então, meça o valor da densidade óptica em 600 nanômetros para um ponto de tempo de 24 horas. Para realizar triagem de alto rendimento, para drogas sinérgicas, cultive células mutantes de predição de sinergia e tipo selvagem em meio mínimo M9.

Em seguida, adicione os medicamentos da biblioteca ao meio. Em seguida, inocule uma placa de medicamentos de biblioteca com o tipo selvagem e outra placa com bactérias mutantes de predição de sinergia. Esta placa representa o ensaio quadriculado usado para investigar combinações sinérgicas de medicamentos.

Nesta placa, o poço F9 com a pontuação FICI mais baixa de 0,07 indica que o par de moléculas pequenas é sinérgico. Esta placa representa o ensaio quadriculado para investigar a combinação de medicamentos que não interagem. Nesta placa, o poço C3 com a menor pontuação FICI de 1,0 indica que o par de pequenas moléculas não interage entre si.

Esta placa representa o ensaio quadriculado usado para investigar combinações de drogas antagônicas. Nesta placa, o poço A1 com a menor pontuação FICI de 8,0 indica que a interação entre as moléculas do fármaco é antagônica. Em seguida, Befeldin A, um medicamento de molécula pequena no fluconazol, é usado para estudar o crescimento de Forminas C e U.

O gráfico mostra que o crescimento do mutante de previsão de sinergia e do tipo selvagem é ligeiramente inibido e na mesma medida. Isso indica que o befeldina A e o fluconazol são parceiros não sinérgicos de medicamentos. Pelo contrário, o crescimento do mutante de predição de sinergia de C e U Formins é inibido significativamente, na presença de Refromisyn e Fluconazol.

Indicando que os medicamentos são parceiros sinérgicos. Curiosamente, o crescimento do tipo selvagem não é inibido de forma alguma. Aqui, observa-se a maior diferença de crescimento, entre 32 e 49 horas após a inoculação.

Uma vez dominada, essa técnica pode encurtar o tempo para identificar interações medicamentosas sinérgicas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de não combinar medicamentos na última coluna da última linha do ensaio quadriculado. Após este procedimento, outros métodos de identificação sinérgica de moléculas podem ser realizados para identificar interações medicamentosas sinérgicas adicionais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a metodologia O2M para identificar marcadores de sinergia putativos, a fim de encontrar interações medicamentosas sinérgicas com seu organismo de interesse. Não se esqueça de que, embora trabalhar com algumas moléculas pequenas possa ser perigoso e quaisquer precauções na FISPQ devem ser seguidas durante a execução deste protocolo.