Name: Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda a identificar combinações de drogas sinérgicas por triagem de alta produtividade para combater infecções resistentes. Este método permite avaliação pré-clínica e melhora o tratamento de doenças infecciosas.

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Este trabalho foi apoiado por uma concessão de inicialização do departamento de patologia, Universidade de Utah para J.C.S.B.

1. identificar o Synergy mutantes de previsão do conjunto de dados químico-genética pelo método de2 sobreposição (O2M)
Nota: Este é o método para a identificação de mutantes de predição de sinergia usando o conjunto de dados publicado de Nichols et al. 17 em e. coli. No entanto, isso pode ser feito em qualquer produto químico-genética dataset e microorganismo. Estes conjuntos de dados contém uma biblioteca de mutantes de nocaute cultivados na presença de mais de 100 pequenas moléculas, dando uma pontuação de crescimento quantitativo para cada mutante em cada pequena molécula. Um par de sinergia deve ser conhecido, e deve haver partituras de crescimento para ambas as pequenas moléculas incluídas no dataset.
<ol><li>
Calcule a pontuação média de crescimento e desvio-padrão dos mutantes cultivados na presença de uma concentração única de cada molécula pequena. Nota: Isto pode ser feito usando qualquer software de planilha eletrônica. O laboratório marrom usa o Excel e as funções =AVERAGE(B3:B3981) e =STDEV(B3:B3981) para os cálculos de cada coluna da pequena molécula.<ol>
<li>Calcule a médias e desvios-padrão de cada coluna de pequena molécula, embora esta orientação pode diferir se usando um conjunto de dados diferente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule escores Z para cada concentração de pequena molécula usando o mesmo conjunto de dados de Nichols et al. 17 em um programa de planilha. Para isso, escores z negativo será Z(2.5) = dizer - 2.5 * desvio padrão e escores z positivo será Z(2.5) = média + 2,5 * desvio padrão.</li>
	<li>Determine quais genes mutantes contêm significativos escores Z em pequenas moléculas que compõem o conhecido par sinérgico, certificando-se de olhar para todas as concentrações dessas moléculas. Se o crescimento é resultado de um mutante menos do que o Z negativo (2.5) marca ou é maior que o resultado positivo do Z (2.5) para essa pequena molécula, é considerado significativo.</li>
	<li>Determine se qualquer um dos mutantes do gene significativo pertencem a um operon. Nota: Para Escherichia coli, os autores recomendam verificar "Ecoli wiki" para obter informações sobre se os genes são transcritos como parte de um policistrônico do RNA.</li>
	<li>Identificar os mutantes do gene/operon que são comuns à maioria das pequenas moléculas de interesse em diferentes concentrações (ex., quando à procura de moléculas que sinergia com o antibiótico sulfametoxazol, identificar os mutantes que mostram uma significativa Z marca quando crescido na presença de trimetoprim e seus parceiros sinergéticos conhecidos como sulfamethizole ou sulfametoxazol). Estas são mutantes de predição de sinergia putativo.</li>
</ol>2. prevendo o Synergizers dentro do Dataset químico-genética por O2M
<ol><li>Retornando para o dataset17, identifica cada concentração de pequenas moléculas que provoca uma pontuação de crescimento significativo do mutante de predição de sinergia. Isso é feito examinando os escores Z calculados para cada concentração de pequenas moléculas. Novamente, uma pontuação de crescimento significativo é menor que o escore Z negativo ou maior que o escore Z positivo para essa concentração de pequenas moléculas. Nota: Se uma molécula aparece em nem uma das suas concentrações, a molécula é considerada um synergizer previsto. Qualquer molécula que não eliciam uma pontuação de crescimento significativo é um não-synergizer previsto.</li>
</ol>3. validação das interações sinérgicas previstas
<ol><li>Encontrar a concentração inibitória mínima (CIM) de synergizers previstos.
	<ol>
<li>Cultivar uma cultura de uma noite de e. coli na M9 media mínimos a 37 ° C. Nota: Qualquer cultura durante a noite pode ser cultivada em meios adequadamente definidos para o organismo de interesse. O laboratório marrom não recomenda a mídia rica como LB ou YPD. M9 media mínimos consiste de 10,5 g/L caldo M9, 0,2% casamino ácidos, 0,1 M CaCl2, 0,4% de glicose, 1m MgSO4, ácido nicotínico de 0,25% e 0,33% de tiamina em H2O.</li>
		<li>Se nenhum dado do MIC para patógeno de interesse é encontrado na literatura ao receber as moléculas pequenas, dissolver em dimetilsulfóxido (DMSO) em uma concentração elevada (&gt; 10 mg/mL).</li>
		<li>Usando uma placa de 96 poços, adicione 100 µ l de mídia M9 para cada poço. Adicione um extra 100 µ l de mídia M9 na coluna 1, então ele contém um total de 200 µ l.</li>
		<li>Adicione uma quantidade arbitrária (~ 10 µ l) de solução concentrada de pequena molécula na coluna 1. Uma pequena molécula por alvéolo da coluna 1 (8 pequenas moléculas por placa). Nota: Estas são as pequenas moléculas de interesse, que estão previstas para a sinergia. O laboratório marrom geralmente adiciona 10 µ l de solução altamente concentrada pequena molécula, que é inferior ao montante de 100% DMSO que pode inibir a Escherichia coli.</li>
		<li>Uma vez que foram adicionadas as pequenas moléculas, dilua as moléculas pequenas através do eixo x da placa. Pegue 100 µ l de solução da coluna 1, coloque na coluna 2 e misture. Pegue 100 µ l de coluna 2, coloque na coluna 3 e misture. Continue esse processo até 100 µ l são colocados na coluna 11. Misture a coluna 11, então tome 100 µ l de coluna e descarte. Deixe a coluna 12 com mídia apenas para normalizar os dados.</li>
		<li>Semear a placa. Obter a densidade óptica (OD600) de uma cultura durante a noite. Preparar uma solução com a cultura e mídia M9 para uma OD600 de 0,002 (ou apropriado a concentração que representa 500 células / µ l para o organismo desejado de interesse). Pipete 2 µ l da solução de cultura para cada poço da placa, então há 1.000 células por poço.</li>
		<li>Homogeneizar a placa e obter o OD600 para o h 0 lendo. Deixe a placa cresce a 37 ° C por 24 h. obter o OD600 para as 24 horas de leitura. Nota: Uso apropriado condições para outros organismos de interesse de crescimento.</li>
		<li>Calcule o crescimento líquido para cada poço usando um programa de planilha.</li>
		<li>Média do crescimento líquido da coluna 12 para obter a média de crescimento sem drogas. Normalize os outros poços para a média de nenhum crescimento de drogas usando um software de planilha eletrônica. Olhe para qualquer bem com menos de 10% crescimento para identificar a MIC90. Qualquer bem com menos de 50%, o crescimento indica o MIC50. Calcule a concentração de pequena molécula nesses poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios de quadriculado para interações sinérgicas
	<ol>
<li>Cresce uma cultura durante a noite de e. coli em media mínimos M9 como antes. Nota: Uso adequado crescimento condições para outros organismos.</li>
		<li>Adicione 100 µ l de mídia M9 a cada poço de um prato bem 96 e um extra de 100 µ l na coluna 1.</li>
		<li>Adicionar a teste pequena molécula (~ 8 x MIC) para cada um bem na coluna 1 e adiciona o dobro da concentração (~ 16 x MIC) para poço A1 (uma pequena molécula testada por placa). Nota: Este valor é determinado a partir o prévio teste completada do MIC e difere para cada potencial synergizer.</li>
		<li>Crie uma gradiente diluição no eixo x, tendo 100 µ l de coluna 1 e transferir para a coluna 2. Continue esse processo até 100 µ l é adicionado à coluna 11. Misturar, então tome 100 µ l de coluna 11 e descarte. Não adicione qualquer droga a coluna 12 (figura 1A).</li>
		<li>Configure o segundo gradiente de drogas do outro lado do eixo y para a droga de entrada. Adicione 100 µ l de mídia contendo 2 x MIC da molécula de entrada na linha r. Mix e diluído como antes, tendo 100 µ l de linha A e colocação em B. Continue até 100 µ l é colocado na linha G. Mix, leva 100 µ l e dispose, garantindo não para adicionar qualquer droga de entrada na linha H. Isso permite que a linha H e coluna 12 para conter microfones individuais do par drogas testadas (figura 1B).</li>
		<li>Semear a placa. Adicione 2 µ l de uma cultura de e. coli de OD600 0.002 a cada poço (1.000 células por poço).</li>
		<li>Medir o OD600 de cada poço da placa para a leitura de 0 h.</li>
		<li>Incubar a placa por 24 h a 37 ° C.</li>
		<li>Medir o OD600 de cada poço a 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcular o índice de concentração inibitória fracional (FICI) de xadrez
	<ol>
<li>Calcule o crescimento líquido para cada poço da placa subtraindo o OD600 às 0h o OD600 a 24 h em um programa de planilha.</li>
		<li>Normalize o crescimento no software, dividindo cada H12 bem por bem, que não contém nenhuma molécula pequena.</li>
		<li>Encontrar a MIC90 da molécula de entrada na coluna 12 e a MIC90 do potencial sinérgico na linha H.</li>
		<li>Procure todos os poços que inibem a 90% de crescimento.</li>
		<li>Calcular o FICI90 para o bem é também o mais baixo abaixo (sinérgico) ou mais elevado acima (antagônicas) ambos os valores de MIC90, usando a equação: <img alt="Fórmula do índice FIC, equação para análise de interação medicamentosa, método de quantificação de sinergia." src="/files/ftp_upload/57241/57241eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1">
</li>
		<li>Considerar qualquer FICI ≤ 0.5 como sinérgico e FICI ≥ 4 como antagônicas (Figura 2). Nota: Isto também pode ser feito com MIC50 (50% de inibição do crescimento) para obter um FICI50 baseado sobre esses valores MIC.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de independência Bliss Nota: Bliss independência é executada com qualquer potencial sinérgico que não tinha um microfone por conta própria.<ol>
<li>Cultivar uma cultura de uma noite de e. coli na mídia M9 a 37 ° C, como antes. Nota: Novamente, adequadas condições de crescimento para outros organismos de interesse podem ser utilizadas nesta etapa.</li>
		<li>Prepare-se para testar a potencial sinérgica molécula, a molécula de entrada, a combinação e um controle não tratados placas de 96 poços.</li>
		<li>Crie a placa sinérgico potencial pela adição de 50 µ l de mídia M9 para cada poço. Adicione 50 µ l de mídia contendo um conjunto de concentração (10 µM ou 100 µM) do potencial sinérgico para cada poço de uma linha. Teste 8 moléculas por placa.</li>
		<li>Crie o prato de entrada molécula pela adição de 50 µ l de mídia para cada poço. Adicionar 50 µ l contendo 4 x MIC da droga entrada a cada poço na coluna 1. Crie uma gradiente diluição ao longo do eixo x semelhantes às placas MIC, tomando 50 µ l da coluna 1, dispersão e mistura na coluna 2. Continue esse processo até a coluna 12, eliminação de 50 µ l de coluna 12. Adicione um adicional 50 µ l de mídia para cada poço, então o total final para cada poço é 100 µ l.</li>
		<li>Criando a placa de combinação usando uma placa bem 96, adicione 50 µ l de mídia para cada poço. Adicionar 50 µ l contendo 4 x MIC da droga entrada a cada poço na coluna 1. Diluído ao longo do eixo x semelhante às placas MIC, tomando 50 µ l da coluna 1, dispersão e mistura na coluna 2. Isto continue todo o caminho para a coluna 12, eliminação de 50 µ l de coluna 12. Adicione 50 µ l de mídia que contém o potencial sinérgico em 10 µM ou 100 µM para cada poço de uma linha. Novamente, deve haver uma concentração ou drogas por linha.</li>
		<li>Crie o controle não tratados adicionando-se 100 µ l de mídia M9 a todas as cavidades da placa.</li>
		<li>Inocule todos os pratos, adicionando 2 µ l de cultura bacteriana com uma OD600 de 0,002 ou 1.000 células para cada bem como antes.</li>
		<li>Medir o OD600 de cada poço em 0 e 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcular a pontuação de independência Bliss
	<ol>
<li>Calcule o crescimento líquido para cada poço da placa subtraindo o OD600 às 0h do crescimento em 24 h, usando um programa de planilha.</li>
		<li>Normalize os poços para o crescimento médio sem placa de drogas em um programa de planilha.</li>
		<li>Usando o software de planilha, calcule a inibição subtraindo-se o crescimento líquido de 1.</li>
		<li>Média das colunas na placa de controle contendo apenas o gradiente de entrada do software de planilha.</li>
		<li>Calcule a pontuação de felicidade para cada poço pela equação: Pontuação de Bliss = (X bem + coluna de entrada X) – combinado bem X
</li>
		<li>Olhe para os escores negativos em poços abaixo a MIC90 da entrada. Nota: Resultados negativos em várias concentrações indicaria uma interação sinérgica.</li>
	</ol></li>
</ol>4. elevado-throughput tela com Synergy mutantes de predição para identificar novos pares sinérgicos
<ol><li>
Identificar os mutantes de predição de sinergia Nota: Passo 1.5 identificado mutantes de predição de sinergia putativo. Aqui, podemos determinar que esses mutantes irá funcionar melhor em uma tela de alta produtividade para drogas sinérgicas. Realizamos este ensaio numa máquina Bioscreen, mas 96 leitores de placa bem também devem ser aceitáveis.<ol>
<li>Cresce cada mutantes de previsão putativo sinergia e o selvagem-tipo pilhas em media mínimos M9.</li>
		<li>Configurar o 100 bem favo de mel placa (ou chapa bem 96) com o meio de cultura apropriado, meio de crescimento + entrada de drogas, meio de crescimento + conhecido parceiro sinérgico da entrada de drogas e meio de crescimento + droga não-sinérgico. Certifique-se de incluir controles do veículo. Nota: Recomendamos que quatro replicar poços de cada estirpe / / concentração do fármaco.</li>
		<li>Inocule a 1.000 células por poço, incluindo poços de controle em branco.</li>
		<li>48 h a 37 ° C, com agitação, de crescer e ler OD600 a cada 20 min.</li>
		<li>Determine o ponto de concentração e tempo drogas que mostra a maior diferença de crescimento entre o selvagem-tipo e sinergia as células mutantes previsão na presença da entrada de drogas e seus parceiros conhecidos e sinérgicos. No ponto ideal de tempo e concentração, não deve haver muita diferença de crescimento entre o selvagem-tipo e sinergia previsão as células mutantes quando crescido na presença de drogas conhecido que não actuam de forma sinérgica com a droga de entrada (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tela de alto rendimento para drogas sinérgicas
	<ol>
<li>Cresce selvagem-tipo células e as células mutantes previsão sinergia em media mínimos M9. Nota: Uso adequado meio de crescimento de organismo de interesse.</li>
		<li>Adicione drogas da biblioteca de mídia de cada bem que contém 100 µ l mídia com pequenas moléculas para definir concentração que foi determinado na etapa anterior. Incluem poços em branco (sem pilhas) e poços com controles do veículo (evértice., DMSO) para contabilizar qualquer inibição do crescimento pelo veículo de diluição de drogas.<ol>
<li>Prepare pelo menos quatro poços de controle do veículo por placa, idealmente espalhados por toda a placa a conta para efeitos de posição bem. Se os ensaios são variável, então inclua pelo menos um controle de veículo bem por linha/coluna e usar cada linha/coluna de controle bem como o controle para calcular escores Z para cada linha/coluna em vez de para um prato inteiro (etapa 4.2.5).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicione 2 µ l de cultura para cada bem como antes. (Um prato por bactérias de tipo selvagem e uma placa de bactérias mutantes sinergia previsto).</li>
		<li>Avalie o OD600 em 0 e 18 h para Escherichia coli ou 48 h para c. neoformans.</li>
		<li>Usando o software de planilha, calcule o crescimento líquido subtraindo o OD600 de poços em branco dos poços de controle do veículo. Identificar os poços com um Z-score de-2.5 (escore Z = média - 2,5 * desvio padrão). Esses poços contenham uma molécula de pequeno potencial sinérgico.</li>
		<li>Valide a tela sucessos usando os métodos descritos na etapa 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Spitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+discovery+of+syncretic+drug+combinations+that+potentiate+the+antifungal+fluconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole.</a> Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Pares sinérgicos pequena molécula podem ser uma ferramenta poderosa no tratamento de infecções microbianas, ainda não chegaram a seu potencial clínico completo porque pares sinérgicos são difíceis de identificar. Este artigo descreve um método para identificar pares sinérgicos muito mais rápidos do que a simples combinações emparelhadas. Usando conjuntos de dados químico-genética, O2M identifica mutantes com nocautes de gene que podem ser usados como uma leitura de grandes bibliotecas de tela de pequenas moléculas para p...

Bactérias resistentes a antibióticos causam infecções mais de 2 milhões e 23.000 mortes anualmente nos Estados Unidos de acordo com o CDC1. Novos tratamentos são necessários para superar essas infecções. Estratégias para identificar esses novos tratamentos incluem o desenvolvimento de novas drogas antimicrobianas ou a redefinição de pequenas moléculas aprovadas para outras condições tratar infecções microbianas2,3,4. No entanto, a descoberta de novas drogas é muito dispendioso e demorado. Redefinição dos objetivos de drogas não pode identificar novos medicamentos ou drogas alvo5,6. Nosso laboratório centra-se em uma terceira estratégia conhecida como terapias de combinação sinérgica. Combinações sinérgicas ocorrem quando duas moléculas pequenas, juntos, têm uma eficácia maior do que o efeito aditivo de suas eficácias individuais7. Além disso, combinações sinérgicas podem ser eficazes contra um patógeno resistente a uma das pequenas moléculas do par, além de ter menos efeitos indesejados de fora do alvo, tornando-os grandes potenciais8,9, 10.
Pares sinérgicos são raras, ocorrendo em aproximadamente 4-10% das combinações de drogas11,12,13. Assim, técnicas tradicionais, tais como telas emparelhadas são desafiadores e demorado, com milhares de combinações possíveis de uma pequena biblioteca de 100 moléculas. Além disso, interações sinérgicas geralmente não podem ser previstas da atividade dos compostos14. No entanto, os autores desenvolveram uma abordagem de alto rendimento para triagem de pares sinérgicos, chamado a sobreposição2 método (O2M)12. Este método, descrito aqui, permite a identificação mais rápida e mais eficiente desses pares sinérgicos. O2M requer o uso de um par de sinérgico conhecido e um conjunto de dados de produto químico-genética. Química-genética conjuntos de dados são gerados quando uma biblioteca de mutantes nocaute é cultivada na presença de muitas moléculas pequenas diferentes. Se uma molécula em um par de sinérgica conhecido induz o mesmo fenótipo de um mutante de nocaute particular como a segunda molécula sinérgica, qualquer outra pequena molécula que provoca o fenótipo daquele mutante mesmo deve também sinergia com cada membro do conhecido par sinérgico. Esta lógica tem sido usada no laboratório marrom para identificar sinérgicas pares antibióticos ativos contra Escherichia coli (e. coli) e pares de drogas antifúngicas sinérgica ativos contra o fungo patogênico Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M não só é adaptável para diversos patógenos, mas permite a seleção de grandes bibliotecas de moléculas para identificar pares sinérgicos facilmente e rapidamente. Triagem com o mutante genético identificado por O2M nos permite validar apenas essas pequenas moléculas previstas para a sinergia. Assim, uma biblioteca de 2.000-molécula de teste pairwise levaria meses, Considerando que se havia apenas 20 moléculas nessa biblioteca prevista a sinergia, testes de sinergia agora leva uma questão de dias. O2M não requer conhecimentos de programação, e o equipamento necessário está disponível na maioria dos laboratórios ou instalações do núcleo. Além de pesquisadores interessados em combinações de drogas, análise O2M é de interesse para alguém que concluiu um teste de drogas e quer expandir seus sucessos identificando interações medicamentosas importantes. Abaixo está o protocolo para identificação de moléculas pequenas sinérgicas em bactérias, bem como validando as interações sinérgicas previstas em conhecidos ensaios15,16.

<table><tbody><tr><td>Instrumento Bioscreen C</td><td></td><td>Curvas de crescimento EUA</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1</td><td>instrumento</td><td>Reagente de caldo BioTek</td><td></td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td>Amresco</td><td>J863-500G</td></tr><tr><td>Reagente de ácidos Casamino</td><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP1424-500</td></tr><tr><td>Reagente de glicose</td><td></td><td>Sigma</td><td>G7021-10KG</td></tr><tr><td>Reagente</td><td></td> <td>de ácido nicotínicoAlfa Aesar</td><td>A12683</td></tr><tr><td>Reagente de tiamina</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>148991000</td></tr><tr><td>CaCl2 Reagente di-hidratado</td><td></td><td>Fisher</td><td>C79-500</td></tr><tr><td>MgSO4 Reagente hidratado</td><td>Fisher</td><td></td><td>M63-500 exemplos de</td></tr><tr><td>conjuntos de dados de conjuntos de dados de genética química</td><td></td><td>incluem Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014 e outros citado no texto.</td><td></td></tr><tr><td>trimetoprima (exemplo de medicamento de entrada; qualquer pode ser usado)</td><td>reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19552701</td></tr><tr><td>sulfametoxazol (exemplo de medicamento de teste; qualquer um pode ser usado)</td><td>reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15671125</td></tr></tbody></table>

identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição2

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Embora antimicrobianos aumentaram drasticamente a expectativa de vida e qualidade de vida noséculo 20 , resistência aos antimicrobianos ameaça a capacidade da nossa sociedade inteira para tratar infecções sistêmicas. Nos Estados Unidos sozinho, infecções resistentes aos antibióticos matam cerca de 23.000 pessoas por ano e custo de cerca de USD 20 bilhões na área da saúde suplementar. Uma abordagem para combater a resistência antimicrobiana é a terapia de combinação, que é particularmente útil em fase crítica inicial da infecção, antes que o organismo infectante e seu perfil de resistência de droga foram identificados. Muitos tratamentos antimicrobianos usam terapias de combinação. No entanto, a maioria destas combinações são aditivo, significando que a eficácia combinada é igual a soma da eficácia individual aos antibióticos. Algumas terapias de combinação são sinérgicas: a eficácia combinada é muito maior do que o aditivo. Combinações sinérgicas são particularmente úteis porque eles podem inibir o crescimento de cepas resistentes aos medicamentos antimicrobianos. No entanto, estas combinações são raros e difíceis de identificar. Isto é devido o grande número de moléculas que precisava ser testado de forma emparelhada: uma biblioteca de 1.000 moléculas tem 1 milhão de combinações possível. Assim, os esforços foram feitos para prever as moléculas de sinergia. Este artigo descreve o nosso método de alta produtividade de previsão pares sinérgicos pequena molécula conhecidas como a sobreposição2 método (O2M). O2M usa padrões de conjuntos de dados químico-genética para identificar os mutantes que são hipersensíveis a cada molécula em um par sinérgica, mas não a outras moléculas. O laboratório marrom explora esta diferença de crescimento através da realização de uma tela de alta produtividade para moléculas que inibem o crescimento do mutante, mas não selvagem-tipo pilhas. O trabalho do laboratório anteriormente identificadas moléculas que sinergia com o antibiótico sulfametoxazol e o fluconazol antifúngico usando esta estratégia. Aqui, os autores apresentam um método para a tela para romance combinações sinérgicas, que pode ser alterada para vários microorganismos.

Ensaios de xadrez são um método semiquantitativo para medir interações sinérgicas. O placar final de saída, FICI, determina se uma combinação de drogas é considerada sinérgicos (FICI ≤ 0.5), não-interagindo (0.5 &lt; FICI &lt; 4), ou antagônicas (FICI ≥4.0). A Figura 1 ilustra como configurar os gradientes de drogas em um ensaio do tabuleiro de damas. A Figura 2 ilustra os resultados comuns. Considere o crescimento (poços roxos),...

Combinações de drogas sinérgica são difíceis e demorados identificar empiricamente. Aqui, descrevemos um método para identificar e validar sinérgicas pequenas moléculas.

Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

O objetivo geral desta metodologia é identificar as moléculas sinérgicas, que amplificam a atividade umas das outras, quando combinadas por meio de triagem de alto rendimento. Pares de medicamentos sinérgicos são uma estratégia promissora para combater infecções resistentes a medicamentos, mas são difíceis de identificar. Este método pode identificar moléculas que interagem com medicamentos antimicrobianos existentes usados para tratar doenças infecciosas.A longo prazo, essas combinações podem entrar na avaliação pré-clínica e, eventualmente, melhorar o atendimento ao paciente. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser feita com qualquer organismo de interesse e com qualquer biblioteca de pequenas moléculas. As implicações desta técnica se estendem à terapia de múltiplas doenças infecciosas, pois funciona com qualquer organismo de interesse.Use uma planilha padrão para calcular a pontuação média de crescimento e o desvio padrão para todos os mutantes, na presença de uma concentração específica da pequena molécula adicionada. Em seguida, calcule as pontuações Z para cada uma das concentrações de moléculas pequenas. Em seguida, destaque os mutantes genéticos com escores Z significativos.Primeiro, cultive uma cultura de E.coli em meio mínimo M9, durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, dissolva as pequenas moléculas em sulfóxido de dimetila em alta concentração acima de 10 miligramas por mililitro. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio M9 a cada poço em uma placa de 96 poços.Pipetar mais 100 microlitros de meio M9 na coluna um, de modo que o volume nessa coluna seja de 200 microlitros. Em seguida, adicione aproximadamente 10 microlitros da solução concentrada de moléculas pequenas, na coluna um. Depois de adicionar as pequenas moléculas, comece a diluí-las no eixo X da placa.Continue diluindo até que haja 100 microlitros na coluna 11. Depois de misturar a coluna 11, descarte 100 microlitros dessa coluna. Que haja apenas meio na coluna 12 para normalizar os dados.Em seguida, registre o valor da densidade óptica em 600 nanômetros da cultura noturna cultivada em meio mínimo M9. Em seguida, adicione dois microlitros da cultura em cada poço. De modo que existem 1000 células por poço.Em seguida, agite o prato suavemente. E observe a leitura da densidade óptica em 600 nanômetros para o ponto de tempo de zero hora. Uma vez registrada a leitura, incube a placa a 37 graus Celsius por um dia.Novamente, meça o valor da densidade óptica em 600 nanômetros para um ponto de tempo de 24 horas. Para realizar o ensaio quadriculado, cultive uma cultura de E.coli em meio mínimo M9 durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio M9 a cada poço e adicione 100 microlitros extras do mesmo meio na coluna um de uma placa de 96 poços.Em seguida, adicione as pequenas moléculas de teste, em cada poço na coluna um. E adicione o dobro da concentração no poço A1. Em seguida, crie um gradiente de diluição ao longo do eixo X transferindo 100 microlitros, da coluna um para a coluna dois. Continuar o processo de diluição até serem adicionados 100 microlitros na coluna 11.Depois de misturar a coluna 11, descarte 100 microlitros dessa coluna e deixe a coluna 12 apenas com meio sem drogas. Crie outro gradiente para a segunda diluição do medicamento. Para fazer isso, adicione 100 microlitros do meio contendo dois X, concentração inibitória mínima da molécula de entrada na linha A.Em seguida, transfira 100 microlitros da linha A para B.Continue o processo de diluição, até que 100 microlitros sejam adicionados na linha G.Depois de misturar a linha G, descarte 100 microlitros do poço.Em seguida, inocule a placa com dois microlitros da cultura em cada poço. De modo que existem 1000 células por poço. Em seguida, meça a leitura da densidade óptica em 600 nanômetros para o ponto de tempo de zero hora.Uma vez registrada a leitura, incube a placa a 37 graus Celsius por 24 horas. E então, meça o valor da densidade óptica em 600 nanômetros para um ponto de tempo de 24 horas. Para realizar triagem de alto rendimento, para drogas sinérgicas, cultive células mutantes de predição de sinergia e tipo selvagem em meio mínimo M9.Em seguida, adicione os medicamentos da biblioteca ao meio. Em seguida, inocule uma placa de medicamentos de biblioteca com o tipo selvagem e outra placa com bactérias mutantes de predição de sinergia. Esta placa representa o ensaio quadriculado usado para investigar combinações sinérgicas de medicamentos.Nesta placa, o poço F9 com a pontuação FICI mais baixa de 0,07 indica que o par de moléculas pequenas é sinérgico. Esta placa representa o ensaio quadriculado para investigar a combinação de medicamentos que não interagem. Nesta placa, o poço C3 com a menor pontuação FICI de 1,0 indica que o par de pequenas moléculas não interage entre si.Esta placa representa o ensaio quadriculado usado para investigar combinações de drogas antagônicas. Nesta placa, o poço A1 com a menor pontuação FICI de 8,0 indica que a interação entre as moléculas do fármaco é antagônica. Em seguida, Befeldin A, um medicamento de molécula pequena no fluconazol, é usado para estudar o crescimento de Forminas C e U.O gráfico mostra que o crescimento do mutante de previsão de sinergia e do tipo selvagem é ligeiramente inibido e na mesma medida. Isso indica que o befeldina A e o fluconazol são parceiros não sinérgicos de medicamentos. Pelo contrário, o crescimento do mutante de predição de sinergia de C e U Formins é inibido significativamente, na presença de Refromisyn e Fluconazol.Indicando que os medicamentos são parceiros sinérgicos. Curiosamente, o crescimento do tipo selvagem não é inibido de forma alguma. Aqui, observa-se a maior diferença de crescimento, entre 32 e 49 horas após a inoculação.Uma vez dominada, essa técnica pode encurtar o tempo para identificar interações medicamentosas sinérgicas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de não combinar medicamentos na última coluna da última linha do ensaio quadriculado. Após este procedimento, outros métodos de identificação sinérgica de moléculas podem ser realizados para identificar interações medicamentosas sinérgicas adicionais.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a metodologia O2M para identificar marcadores de sinergia putativos, a fim de encontrar interações medicamentosas sinérgicas com seu organismo de interesse. Não se esqueça de que, embora trabalhar com algumas moléculas pequenas possa ser perigoso e quaisquer precauções na FISPQ devem ser seguidas durante a execução deste protocolo.

high-throughput-identification-synergistic-drug-combinations-overlap2

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

A fosforilação de proteínas é uma característica central de como as células interpretam e respondem às informações em seu meio extracelular. Aqui, apresentamos um protocolo de triagem de alto rendimento usando quinases purificadas de células de mamíferos para identificar rapidamente quinases que fosforilam um (s) substrato (s) de interesse.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

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Método diagonal medida sinergia entre qualquer número de drogas

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Potenciação da eficácia de anticorpos anticâncer por fármacos antineoplásicos: deteção de sinergismo de anticorpo-droga usando a equação de índice de combinação

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Antimicrobiana sinergia testes pela impressora jato de tinta-assistida matriz Checkerboard automatizado e o método Manual de tempo-kill

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Aprenda a identificar combinações de drogas sinérgicas por triagem de alta produtividade para combater infecções resistentes. Este método permite avaliação pré-clínica e melhora o tratamento de doenças infecciosas.

Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição²

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