Perfusable rede Vascular com um modelo de tecido em um dispositivo Microfluidic

O objetivo geral deste procedimento é usar uma plataforma microfluídica para construir uma rede vascular perfusível em um agregado multicelular, ou esferóide. Este método pode ajudar a abordar questões-chave na forma alternativa dos campos da medicina regenerativa, como a importância de uma rede vascular em modelos de tecidos in vivo e in vitro. A principal vantagem dessa técnica é que a via de administração de medicamentos e suplementos pode ser simulada in vitro por meio da entrega de regiões de interesse diretamente nos esferoides.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à dificuldade em introduzir as células na área-alvo no dispositivo microfluídico. Depois de fundir o pré-polímero PDMS, desgaseifique o material em uma câmara de vácuo por duas horas, seguido de cura noturna a 80 graus Celsius em um forno ventilado. Na manhã seguinte, retire o PDMS do wafer de silício e use um furador de dois milímetros de diâmetro para criar furos no material nas posições indicadas.

Use um punção de um milímetro de diâmetro para criar o poço esferóide e use fita adesiva para limpar a laje PDMS e uma lamínula de vidro de 24 por 24 milímetros. Trate a placa limpa com plasma de ar por 40 segundos e cole a placa PDMS na lamínula. Em seguida, cure o PDMS a 80 graus Celsius por pelo menos 12 horas.

Dois a três dias antes de semear o dispositivo microfluídico, adicione três vezes 10 ao quinto hLF, RFP-HUVECs e GFP-HUVECs recém-descongelados a 10 mililitros de meio endotelial fresco em um prato de 10 milímetros. Quando os hLFs e RFP-HUVECs atingirem a subconfluência, suspenda os hLFs e RFP-HUVECs no meio endotelial até as concentrações finais em 1,0 vezes 10 elevado à quinta e 2,5 vezes 10 elevado à quarta células por milímetro, respectivamente. Após dois dias em cultura em suspensão, em um gabinete de biossegurança, adicione uma gota de 99 microlitros de solução master mix recém-preparada no centro de uma placa de Petri de 35 milímetros no gelo.

Para carregar o dispositivo microfluídico, use uma ponta de micropipeta modificada de 100 microlitros para transferir um esferóide e 100 microlitros de meio para uma segunda placa de Petri em temperatura ambiente. Em seguida, aspire o esferóide em uma quantidade mínima de meio e gire a pipeta na vertical para que o esferóide se mova para o fundo da ponta da pipeta por gravidade. Toque a ponta da pipeta no menisco da gota da mistura principal para ejetar o esferóide na solução sem pressionar o êmbolo da pipeta.

Em seguida, adicione rapidamente um microlitro de trombina recém-preparada à gota e misture suavemente a trombina na solução. Com a pipeta ajustada para sete microlitros, transfira lentamente o esferóide para o poço esferóide da placa PDMS. A etapa mais crítica do procedimento é injetar o esferóide com gel suficiente para permitir que o esferóide se acomode na parte inferior do dispositivo.

Após o carregamento, remova a ponta da pipeta com cuidado para evitar vazamentos entre os micropostes. Incube o esferóide a 37 graus Celsius por 15 minutos. Quando a fibrina estiver solidificada, injete lentamente 20 a 30 microlitros de meio endotelial nos orifícios um A e três A para carregar os canais um e três, respectivamente.

Em seguida, transfira o dispositivo para um lenço umedecido em um prato de 100 milímetros e incube o dispositivo a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 horas para facilitar a remoção de quaisquer bolhas na interface entre o meio e a fibrina. No dia seguinte, adicione dois mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA aos GFP-HUVECs subconfluentes e interrompa a reação de tripsina com quatro mililitros de meio completo quando as células estiverem completamente descoladas. Coletar as células endoteliais por centrifugação e ressuspender o pellet em meio endotelial fresco a uma concentração de cinco vezes 10 elevado ao sexto células por mililitro.

Em seguida, injete 20 microlitros de HUVECs no orifício um B para carregar o canal um e coloque o dispositivo a 37 graus Celsius por 30 minutos, inclinado em um ângulo de 90 graus para garantir que os HUVECs adiram à fibrina no canal dois. Depois de carregar o canal três da mesma maneira, coloque o dispositivo em um novo prato de 100 milímetros contendo um pano úmido de laboratório na incubadora de cultura de células por sete a 14 dias, substituindo metade do meio nos canais um e três diariamente. Essas imagens representativas tiradas no dia zero do carregamento do HUVEC mostram o gel de fibrina carregado apenas no canal dois, sem qualquer vazamento nos canais um ou três e com os HUVECs fixados com sucesso à parede lateral do gel de fibrina.

O esferóide também pode ser observado devidamente acomodado na parte inferior do dispositivo. Os brotos angiogênicos são observados desde o primeiro dia, com o broto mais longo atingindo o esferóide no terceiro dia deste experimento, e com a maioria dos brotos angiogênicos atingindo o esferóide no sétimo dia. Idealmente, após quatro dias no dispositivo, o fluxo pode ser observado através dos lúmens vasculares com o ângulo vascular definido como a direção da ponta vascular e o centro do esferóide a partir da raiz vascular.

Os ângulos vasculares diminuem de maneira dependente do tempo, indicando a migração dos brotos angiogênicos em direção ao esferoide. RFP e GFP-HUVECs podem formar coordenadamente um único lúmen vascular, indicando claramente como os brotos angiogênicos dos canais um e três se anastomosam para RFP-HUVECs no esferóide para formar uma rede vascular contínua. Além disso, o FITC-dextrano injetado no canal um flui para a rede vascular construída e para o interior do esferóide, eventualmente atingindo o canal três, o que implica que a rede vascular integrada poderia fornecer nutrientes e remover resíduos do esferóide.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área elétrica orgânica explorarem a eficácia de medicamentos ou suplementos de interesse em modelos de tecidos in vitro.