Imagem de Neuroinflammation usando [¹¹C] DPA-713 em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico do animal de estimação

O objetivo geral deste experimento é quantificar com precisão a distribuição espacial e a extensão da neuroinflamação em um modelo de camundongo de AVC isquêmico usando imagens TSPO-PET e RM e validar esses achados in vivo usando autorradiografia ex vivo. Estou muito animado para compartilhar com vocês este guia passo a passo sobre como usar imagens PET para visualizar a neuroinflamação em um sujeito vivo. Aqui estamos usando um modelo de mouse de traço como exemplo.

Agora, por que você pode querer usar essa técnica? Existem algumas razões. A primeira é que a neuroinflamação, que é apenas uma inflamação que ocorre no sistema nervoso central, é considerada intimamente associada e realmente algo que está por trás de muitas, muitas doenças cerebrais, incluindo acidente vascular cerebral, mas também doença de Alzheimer, esclerose múltipla, Parkinson e a lista continua.

Portanto, é extremamente importante que tenhamos essas técnicas que realmente nos permitam estudar esses fenômenos biológicos. Em segundo lugar, a imagem PET oferece uma série de vantagens sobre algumas das técnicas mais tradicionais. Por exemplo, a maioria dessas técnicas tradicionais depende muito do uso de tecido cerebral post-mortem humano e de camundongo e, embora tenham proporcionado uma série de insights importantes, essas técnicas são estáticas por natureza, o que significa que elas só podem realmente nos dizer informações sobre um momento no tempo.

Como sabemos que tanto o cérebro quanto o sistema imunológico são altamente dinâmicos, faz sentido que queiramos ter uma técnica que nos permita realmente capturar esses processos moleculares em sistemas vivos e intactos, em seu ambiente nativo em tempo real, e é exatamente isso que a imagem PET faz. Aqui, mostraremos como usamos um radiotraçador PET específico, o DPA-713, que é conhecido por se ligar à proteína TSPO ou translocadora. Mostraremos especificamente como injetamos uma imagem não apenas em um mouse, mas em quatro mouses ao mesmo tempo dinamicamente, e por que isso é tão importante é que realmente ajuda a aumentar o número de mouses que você pode criar imagens em um determinado dia com o mesmo lote de rastreador, simplificando assim seus experimentos.

Embora isso seja tecnicamente desafiador, espero que este vídeo possa ajudar a guiá-lo para que você possa fazer isso em seu próprio laboratório. Comece posicionando os camundongos anestesiados de bruços na cama do scanner PET/CT, garantindo que estejam endireitados e seguros nos cones do nariz. Prenda a cabeça e o corpo de cada camundongo na cama com fita cirúrgica macia, garantindo que a respiração não seja restringida pela colocação da fita.

Quando os animais estiverem seguros na cama e a respiração estiver estável, ligue a mira do laser e mova a cama de varredura para que eles se alinhem com o cérebro de todos os quatro camundongos. Mova a base do scanner para a posição de aquisição com os cérebros dos camundongos o mais próximo possível do centro do campo de visão. Adquira uma imagem de visualização de reconhecimento dos mouses para verificar sua posição e ajuste a posição arrastando a caixa de campo de visão na interface, se necessário.

Por fim, clique em Iniciar fluxo de trabalho no software do scanner para iniciar a tomografia computadorizada, certificando-se de selecionar exibir prompts interativos do usuário, para que a varredura PET possa ser iniciada manualmente antes da injeção do traçador. Assim que os camundongos avançarem automaticamente da TC para a PET, configure a parte traseira do scanner para a injeção do radiotraçador. Coloque um acolchoamento protetor e absorvente em uma borda e certifique-se de que uma tesoura e um isqueiro estejam à mão.

Corte o tubo selado do cateter com uma tesoura. Verifique se as linhas do cateter estão livres de bolhas e confirme se a cânula ainda está dentro da veia realizando uma lavagem de solução salina de 10 a 20 microlitros e, em seguida, carregue seringas de dose previamente medidas em cada um dos quatro cateteres, mantendo o controle de qual dose foi administrada a cada camundongo. Clique em OK quando o PET scan estiver pronto para iniciar e, ao mesmo tempo, iniciar um cronômetro de 10 segundos.

Tenha dois pesquisadores na parte de trás do scanner com as seringas de dose na mão para injetar todos os quatro camundongos simultaneamente quando o cronômetro chegar a zero. Lave cada cateter com 50 a 100 microlitros de solução salina para garantir que a dose completa entre na veia da cauda e feche novamente o tubo usando um isqueiro. Em seguida, meça as seringas de dose usando um calibrador de dose para obter um valor de radioatividade residual.

Anote os valores e a hora em que são registrados. Quando a digitalização estiver concluída, retorne a cama PET à posição original usando o botão Horizontal Home no painel Motion Control. Remova os mouses do scanner e remova cuidadosamente o cateter.

Aplique pressão suavemente no local da canulação para evitar sangramento excessivo. Em seguida, meça a atividade residual no cateter usando um calibrador de dose. Por fim, reconstrua os dados abrindo o software de gerenciamento de pós-processamento, que reconstruirá automaticamente cada varredura usando os dados do histograma gerados a partir do primeiro arquivo.

Para análise de PET, comece abrindo o software de análise de imagem, clicando no ícone Dados abertos para carregar a imagem de TC e selecionando o ícone Anexar dados para carregar o PET dinâmico. Execute um controle de qualidade visual dos dados por meio do operador de série temporal no menu suspenso. Selecione referência e global e aplique um mínimo e um máximo apropriados para a escala de cores.

Visualize os dados PET dinâmicos quadro a quadro, verificando a captação de radioatividade e verificando se há confusão de movimento na varredura. Em seguida, crie uma imagem PET média usando a função Aritmética. Escolha a média selecionada, desmarque Referência e certifique-se de que Entrada 1, Entrada 2 e Entrada estejam selecionadas para criar uma média de todos os quadros PET.

Vá para a guia Gerenciador de dados e arraste a imagem média até a posição Entrada 1 para permitir a visualização do sinal PET usando a imagem PET média. Em seguida, redistribua a escala de cores clicando no cálculo automático na ferramenta Mín/Máx. Em seguida, registre o CT no arquivo PET médio usando a função 3D automática no menu suspenso Registro de reorientação.

Selecione Ref e Input 1 e escolha Rigid, Fast, Input 1 para Ref registration. Verifique visualmente o registro em todas as três dimensões e ajuste manualmente, se necessário, na guia Manual 3D usando as funções de Translação e Rotação. Quando estiver satisfeito com o registro, selecione Entrada 2 e Entrada e aplique a todos os quadros PET clicando na marca de seleção.

Clique com o botão direito do mouse nos arquivos CT e PET no DM e salve como raw. Em seguida, selecione Corte no menu suspenso e arraste os limites da imagem para cortar a cabeça de um mouse de cada vez abaixo do tronco cerebral. Reoriente manualmente as imagens PET e CT para que o crânio fique reto em todas as dimensões.

Carregue a imagem MR para esse mouse usando o botão Anexar dados no canto superior esquerdo da interface. Mova o MR usando a reorientação 3D manual e ajuste-o ao crânio dentro da imagem de TC. Em seguida, desative a visualização PET desmarcando-a na guia Visual Controller e use apenas o MR e o CT para desenhar a região de interesse ou ROI.

Na ferramenta ROI 3D, clique no botão Adicionar ROI para criar um novo ROI e nomeie-o Infarto. Selecione a ferramenta Spline, clique com o botão esquerdo do mouse para desenhar a borda do ROI e clique com o botão direito do mouse para fechá-la. Depois disso, crie um novo ROI e rotule-o como contralateral.

Clique com o botão direito do mouse no ROI do infarto e selecione Exportar. Em seguida, mova o ROI para a posição 2, Entrada 1, para permitir a visualização e a reorientação manual do novo ROI. Com apenas a Entrada 1 selecionada, marque a caixa ROI e escolha View Only para permitir a visualização do ROI do infarto sem reorientá-lo.

No menu Registro de reorientação, aplique uma inversão esquerda-direita usando a função Operador e mova manualmente o novo ROI para a região idêntica no lado contralateral. Em seguida, selecione o operador Aritmética e aplique uma multiplicação escalar de dois ao novo ROI, permitindo a quantificação independente dos ROIs. Retorne à ferramenta ROI 3D.

Vá para a guia Especialista e Experimental e clique no botão Importar ROI. Selecione Entrada 1 na caixa de diálogo para carregar o novo volume como o ROI contralateral. Por fim, clique com o botão direito do mouse na imagem PET média, descarregue-a e ligue o PET novamente.

Gere os resultados de aceitação quantitativa usando o ícone Exportar Resultados na ferramenta ROI 3D. As imagens PET/CT resultantes e as curvas de atividade de tempo exibem maior captação de radiotraçador nos hemisférios ipsilateral versus contralateral. A quantificação de imagens cerebrais dinâmicas de PET usando dados somados de 50 a 60 minutos revelou um aumento significativo na captação do traçador no hemisfério ipsilateral em comparação com o hemisfério contralateral em dMCAO, mas não em camundongos simulados usando a abordagem ROI desenhada manualmente.

Depois de assistir a essa técnica, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar com precisão e eficiência a neuroinflamação em um modelo de camundongo de AVC isquêmico via TSPO-PET, usando métodos de análise de imagem automática e manual. É importante ressaltar que você também deve ser capaz de confirmar esses achados in vivo usando autorradiografia digital ex vivo. Como a meia-vida do Carbon 11 é tão curta, é fundamental mapear um plano experimental claro e um cronograma antes de tentar esse procedimento, a fim de maximizar a quantidade e a qualidade de seus dados.

Após este procedimento, outros métodos, como a imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a correlação entre a ativação glial e a expressão de TSPO. Lembre-se de que o uso de radioatividade pode ser extremamente perigoso. Para minimizar sua exposição, utilize roupas de proteção, protetores de chumbo e aumente sua distância ao realizar este procedimento.