Isolamento e caracterização de cardíacas células estromais mesenquimais de endomiocárdica Bioptic amostras de pacientes Arrhythmogenic cardiomiopatia

Os objetivos gerais deste protocolo são isolar células estromais mesenquimais cardíacas de pacientes com cardiomiopatia arritmogênica, testar sua aptidão para diferenciação adipogênica e fenótipo de seus marcadores de superfície. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da cardiomiopatia arritmogênica, como o envolvimento das células estromais cardíacas na adipo-substituição e mecanismos moleculares sublinhados. A principal vantagem dessa técnica é que o isolamento das células do estoma pode ser realizado com poucas passagens simples de espécimes cardíacos muito pequenos.

Embora este método possa fornecer informações sobre o estudo da cardiomiopatia arritmogênica. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como o estudo de doenças cardiovasculares, para as quais uma biópsia endomiocárdica é indicada. Estudamos a ideia desse método pela primeira vez quando entendemos que poderíamos reduzir o procedimento de isolamento de células do estoma para aplicá-lo a biópsias cardíacas e à eletrofisiologia que ele poderia nos fornecer.

Para este protocolo, colete uma biópsia endomiocárdica do ventrículo direito de um paciente com ACM usando mapeamento eletroanatômico integrado e fluoroscopia cardíaca. Pegue cerca de cinco gramas de tecido e envie-o para o laboratório em meio TMES. No laboratório, configure a cabine de segurança biológica conforme necessário para realizar o procedimento até a digestão ensomática.

Em seguida, transfira a biópsia para uma placa e lave-a duas vezes com PBS. Neste ponto, a biópsia pode ser documentada ao microscópio. Em seguida, transfira a biópsia para um tubo de dois mililitros contendo um mililitro da solução de colagenase.

Nele, corte a amostra em pequenos fragmentos, entre 0,5 e um milímetro de largura. Em seguida, incube o tecido por 90 minutos a 37 graus Celsius com agitação rotativa contínua. Em seguida, centrifugue a solução digerida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS.

Em seguida, centrifugar novamente o tubo, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em um mililitro de TMES. Agora coloque a suspensão em uma placa de 60 milímetros e encha a placa até três mililitros usando o TMES, mas não mais. Em seguida, cultive e expanda as células de acordo com o protocolo de texto.

Antes de começar, prepare o reagente de dissociação celular, o tampão de lavagem e os anticorpos necessários para uso. Quando o número estimado de células da cultura atingir três milhões, lave a placa de 100 milímetros duas vezes com 10 mililitros de PBS estéril. Em seguida, adicione cinco mililitros de um reagente de dissociação celular às células e incube a placa por sete a 10 minutos em temperatura ambiente para separar as células.

Uma vez que as células são destacadas, adicione 15 mililitros de PBS às células e transfira a suspensão para um tubo de 50 mililitros. Agora, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lavagem. Em seguida, conte as células e transfira três milhões para um novo tubo em um volume final de 1,5 mililitros de tampão de lavagem.

Em seguida, divida a suspensão em 12 tubos de fax. Em cada tubo, adicione anticorpos usados para caracterizar CMSCs nas concentrações recomendadas. Certifique-se de incluir os controles de isotipo.

Depois de preparados, incube os tubos por 15 minutos em temperatura ambiente, protegidos da luz. Mais tarde, adicione um mililitro de tampão de lavagem a cada tubo para interromper as reações. Em seguida, centrifugue as células, remova o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 250 microlitros de tampão de lavagem.

Agora prossiga para caracterizar as células usando citometria de fluxo. Após a diferenciação adipogênica das células, use a coloração ORO para testar o acúmulo de lipídios. Antes de começar, certifique-se de ter a solução de trabalho ORO.

Antes de corar as células, remova o meio e lave as células duas vezes com dois mililitros de PBS. Em seguida, cubra as células com 4% de paraformaldeído e deixe-as fixar por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, descarte o paraformaldeído e lave as células duas vezes com dois mililitros de PBS.

Após a segunda lavagem, adicione solução de trabalho ORO suficiente para cobrir as células. Em seguida, incube a placa por uma hora em temperatura ambiente. Esta incubação deve ser realizada em um ambiente onde a autosolution não funcione, portanto, salas cheias não são recomendadas.

Após a incubação, aspirar a solução ORO e lavar as células com dois mililitros de PBS várias vezes até que a mancha não possa ser vista na lavagem com PBS e até que, quando vista ao microscópio, não seja detectada coloração inespecífica. Agora, usando um microscópio de contraste de fase de cultura de tecidos invertido, capture 20 imagens de cada poço com ampliação de 20x. Os detalhes são fornecidos no protocolo de texto.

As CMSCs foram isoladas de biópsias endomiocárdicas, conforme descrito. Para confirmar sua linhagem mesenquimal, as células foram incubadas com anticorpos conjugados florofour apropriados e analisadas por citometria de fluxo. As CMSCs foram positivas para os antígenos de superfície mesenquimais específicos CD29, CD44 e CD105.

Sabe-se que a fração de células CD90 positivas é variável. Os marcadores para herança endotelial, herança de monócitos ou macrófagos, herança onomatopaica e para o complexo principal de histocompatibilidade não foram expressos. Em seguida, as CMSCs foram cultivadas em meio T.ADIPO para diferenciação adipogênica e coradas com ORO para procurar gotículas lipídicas intracelulares.

As CMSCs de pacientes com cardiomiopatia arritmogênica acumularam mais gotículas lipídicas do que células de controles saudáveis. Essas diferenças foram medidas em condições de diferenciação em 72 horas e em sete dias. Uma vez dominada, a resolução da célula pode ser feita em três horas, a coloração pode ser feita em duas horas e a análise de fax pode ser concluída em três horas.

Após este procedimento, outros métodos, como testes de drogas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como podemos usar células de estoma dos mesmos pacientes para responder a diferentes estímulos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da cardiomiopatia arritmogênica explorarem o envolvimento das células do estroma cardíaco humano na patogênese da doença.