Name: Um modelo de Mouse Syngeneic câncer pancreático para estudar os efeitos da eletroporação irreversível (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a usar um modelo sinigênico de camundongo para estudar os efeitos da eletroporação irreversível no câncer pancreático. Este método permite avaliar o crescimento tumoral e a resposta imune em sistema imunocompetente.

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RAW tem recebido apoio para este trabalho de uma bolsa de Investigação translacional colaborativo financiado pelo C3 San Diego Padres Pedal a causa (#PTC2017).

Todas as experiências com animais realizada seguinte que este protocolo deve ser aprovado pelos respectivos institucional Cuidado Animal e Comitê de uso (IACUC). Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo IACUC UCSD.
1. adquirir animais destinatários
Nota: A linha de celular KPC-Luc 4580 estabeleceu-se de um tumor decorrente de um LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse (KPC), que é um modelo geneticamente modificado do PC em um fundo de C57BL/6. A vantagem desta linha da célula é que constitutivamente expressa habilitação do luciferase tumor monitoramento em modelos ortotópico. No entanto, outras linhas de células podem também ser utilizadas desde que sejam compatíveis com o fundo genético dos ratos destinatários.
<ol><li>Determine os grupos experimentais e o número de animais por grupo antecipadamente.</li>
	<li>Escolher a idade (6 - 10 - semana velhos ratos recomendados) e sexo dos animais sendo usado de acordo com a hipótese e a linha celular usado.</li>
</ol>2. cultura células
<ol><li>Dulbecco uso modificada do meio eagle (DMEM): mistura de nutrientes F12 mídia (50: 50) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina antibiótico (mídia de crescimento completo) para cultivar células 4580 KPC-Luc.</li>
	<li>Se congelado, descongele as células 4 dias antes da implantação do tumor.</li>
	<li>Crescem as células a 37 ° C com 5% de CO2 e 95% umidade sob condições assépticas.</li>
	<li>Trypsinize as células com 0,25% tripsina por 5 min a 37 ° C, antes que eles atinjam > 80% confluência e neutralizar a tripsina adicionando duas vezes o volume de mídia de crescimento completo. Nota: Estas células não estabelecer tumores eficientemente em ratos se utilizam-se na confluência de 100% ou se eles são passados para mais de 12 vezes. Portanto, é aconselhável congelar as células em passagens anteriores sob confluência ideal.</li>
	<li>Contar as células usando um hemocytometer e proceder a indução de tumor se números adequados estão presentes (0,5 - 1 x 106 células/rato). Se não, expandir as células para uma passagem mais até números de celular adequada são obtidos.</li>
</ol>3. indução de tumores SQ
<ol><li>Preparar o material necessário: P1000 e P100 pipetas e pontas, seringa de 1 mL, 25G agulhas, matriz da membrana basal (BMM), tubos de centrifuga de mídia basal de DMEM, 1,5 mL. Manter todos os materiais estéreis e frios (4 ° C) até o final do procedimento. Também manter zaragatoas de álcool e cortar cabelo pronto para o uso de animais.</li>
	<li>Trypsinize (conforme passo 2.4) e contar as células e ressuspendê-los em uma concentração de 2-4 x 107 células/mL de DMEM frio.</li>
	<li>Adicionar um volume igual de 100% BMM tornar-se uma suspensão de células final em 50% BMM. O volume final deverá ascender a 50 µ l de suspensão de células para cada mouse necessário. Prepare-se 10% em excesso para acomodar o espaço morto da seringa e para quaisquer erros de pipetagem.</li>
	<li>Alíquota a suspensão em 550 volumes µ l em tubos de centrífuga de 1,5 mL colocado no gelo.</li>
	<li>Conter os animais (6 semana de idade camundongos C57BL/6 machos) usando uma retenção ou manualmente. Nota: Como alternativa, os ratos podem ser anestesiados com 2,5% de isoflurano em gás oxigênio, a uma taxa de fluxo de 2 L/min, usando um vaporizador de precisão.</li>
	<li>Raspe o local da injeção, que é preferencialmente um flanco acima uma perna, usando uma tesoura. Usando um algodão embebido em álcool, limpe o local da injeção duas vezes.</li>
	<li>Desenhar a 250 µ l de suspensão de células em uma concentração final de 1-2 x 107 células/mL em uma seringa de 1 mL fria e remover quaisquer bolhas de ar, deslocando o pistão subir e descer. Coloque uma agulha 25g a seringa e certifique-se de preencher o espaço dentro da agulha.</li>
	<li>Insira cuidadosamente a agulha sob a pele em um ângulo de 30° para o corpo perto dos flancos, certificando-se que a agulha não perfurar a cavidade peritoneal ou a musculatura dos membros.</li>
	<li>Achate a agulha paralela ao corpo e achatar rugas na pele. Injecte lentamente 50 µ l de suspensão de células. Segure a agulha no local da injeção para 10 s para permitir que o BMM solidificar para evitar fugas.</li>
	<li>Lentamente, retire a agulha, mantendo-o paralelo sem nenhum movimento para os lados. Gentilmente Limpe o local da injeção com um algodão embebido em álcool e solte o mouse para seu alojamento. Nota: Se o mouse foi anestesiado durante o procedimento, monitore o animal até que ele recupere seus braço endireitante reflexos.</li>
	<li>Monitore o crescimento do tumor regularmente usando compassos de calibre até atingir 5 mm de diâmetro.</li>
</ol>4. indução de tumores ortotópico
<ol><li>Prepare o material necessário. Autoclave a cirúrgica ferramentas tais como tesouras, bisturis, drivers de agulha e apontou e a pinça com ponta plana. Manter útil suturas estéreis (6-0 absorvível e não absorvível 4-0), cotonetes de álcool, cortar cabelo, creme depilatório, lubrificante do olho, gaze de algodão, solução de iodo povidona 10%, cirúrgicos, almofadas de aquecimento, buprenorfina e agentes anestésicos.</li>
	<li>Eutanásia em um rato do doador (de preferência do mesmo fundo necessário para o modelo ortotópico) carregando um tumor SQ KPC utilizando uma câmara de enchimento lento CO2 . Excisar o tumor SQ cuidadosamente sob condições estéreis de um capuz de BSL-2 usando Pinças esterilizadas e micro-tesouras logo antes da implantação ortotópico. Durante a excisão do tumor, tome cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal e lavar o tumor imediatamente com 2 trocas de PBS estéril.</li>
	<li>Usando bisturis esterilizados, picar o tumor extirpado em pedaços de3 mm 1, coloque-os em um prato de Petri contendo estéril DMEM basais criogênicos e armazenar no gelo até a implantação.</li>
	<li>Administre o destinatário mouse 0,05 - 1 mg/kg a buprenorfina analgésico SQ, 30 min antes da cirurgia.</li>
	<li>Anestesia os destinatários ratos com 2-3% de isoflurano em oxigênio (2 L/min), usando um vaporizador de precisão (ou outros agentes anestésicos). Manter os ratos em um 37 ° C almofada para a totalidade do processo de aquecimento. Aplique lubrificante dos olhos para evitar a dessecação. Testar a profundidade da anestesia por falta de surpreendentes reflexo inicialmente e confirmar a anestesia cirúrgica avião pela falta de reflexo pedal para uma pitada de dedo suave. Manter a anestesia durante todo o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Coloque o mouse em suas costas e transformá-lo suavemente para o lado direito para que o lado esquerdo do abdômen é exposto. Remover o cabelo abdominal do mouse usando o creme depilatório e limpar com gaze para garantir que nenhum cabelo gratuito entra a incisão de post do abdômen. Prepare a esquerda do abdômen para a cirurgia usando 3 ciclos de iodopovidona 10% seguido de toalhetes com álcool para desinfectar a pele.</li>
	<li>Usando um bisturi estéril, faça uma incisão transversal ou oblíqua de 1,5 cm na pele, 1 cm à esquerda da linha média, abaixo da caixa torácica, ligeiramente medial para o baço. Em seguida, estenda a incisão através da musculatura abdominal, espelhando a incisão superficial sobrejacente.</li>
	<li>Localize o baço usando plana com ponta fórceps e exteriorizá-lo suavemente da cavidade abdominal. Retrair o baço usando um aplicador de algodão estéril e encontrar a cauda do pâncreas anexado à parte inferior do baço.</li>
	<li>Usando a pinça com ponta plana, retraia a cauda do pâncreas lateralmente.</li>
	<li>Apanhar um tumor finamente picada do mouse doador com a ponta de uma agulha de sutura estéril fino (6-0) e posicioná-lo usando Pinças esterilizadas.</li>
	<li>Enquanto suavemente, retraindo o corpo/cauda do pâncreas lateralmente, insira a agulha de sutura que contém o fragmento de tumor na cauda do pâncreas. Passe a sutura lentamente através do tecido, mantendo o tumor em contato com a cauda do pâncreas. Aplica uma ou duas suturas adicionais, dependendo da orientação do fragmento em relação ao tecido.</li>
	<li>Retire completamente a agulha do tecido e manter o pâncreas/baço exteriorizado por um adicional de 60 s ao inspecionar para quaisquer sinais de hemorragia ou vazamento. Em seguida, internalizá-los suavemente na cavidade abdominal usando fórceps rombudo.</li>
	<li>Feche a musculatura abdominal usando uma sutura de 6-0 com qualquer um ponto contínuo ou interrompido e fechar a pele sobrejacente usando um 3-0 para a sutura interrompida não absorvível de 6-0. Descontinuar a anestesia neste ponto.</li>
	<li>Permitir que o mouse para recuperar em sua jaula para casa com livre acesso à comida e água. Coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento para facilitar a recuperação. Monitorar os sinais vitais como a respiração, perfusão etc., durante o processo de recuperação.</li>
	<li>Confirme os sinais do reflexo de endireitamento uma vez que o mouse se recupera, e então retorno a gaiola pode à moradia regular.</li>
	<li>Administrar a buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/kg 8-12 h após a cirurgia e a cada 8-12 h após o procedimento conforme necessário para os sinais de dor.</li>
	<li>Monitorar o crescimento do tumor usando uma bioluminescência na vivo , sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais).<ol>
<li>Acompanhar o crescimento do tumor por imagem começando no dia 4 após implantação ortotópico e executar a imagem duas vezes por semana.</li>
		<li>No dia da imagem latente, administrar (injeção intraperitoneal) 30 mg/kg para uma anestesiados D-luciferina (2-3% de oxigênio (2 L/min) de isoflurano) destinatário rato 10 min antes da imagem latente.</li>
		<li>Imagem para atividade de luciferase usando a configuração de luminescência sem qualquer filtro de emissão para um mínimo de 5 s exposição em uma imagem de luminescência, com fase aquecida grátis de autofluorescência e mantendo a anestesia para os ratos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. a ira dos tumores SQ
<ol><li>Preparar o material necessário: quadrado de onda electroporator, interruptor de pé de segurança, eletrodos (matriz de agulha contra pinça-pisasse) e adaptadores. Manter estéril suturas (não absorvível 4-0), compressas de álcool, cortar cabelo, creme depilatório, lubrificante de olho, gaze de algodão, buprenorfina e anestésicos também nas proximidades.</li>
	<li>Esterilizar a pinça ou agulha eletrodos de matriz usando a esterilização por gás. Não é recomendada a esterilização em autoclave. Use um esterilizador de grânulo de vidro para esterilizar os eletrodos entre animais.</li>
	<li>Administre a buprenorfina 0,05 - 0,1 mg/Kg para os ratos de tumor-rolamento 30 min antes do procedimento.</li>
	<li>Siga os passos 4.4-4.5 para induzir a anestesia em camundongos com sucesso uma vez que o implante de tumor SQ atinge 5 mm de diâmetro.</li>
	<li>Coloque o mouse anestesiado de lado para acessar o tumor SQ no flanco. Remova os pelos com tesoura e pele limpa usando um algodão embebido em álcool.</li>
	<li>Para tumores SQ, use eletrodos de agulha 2 matriz. Elevar a pele diretamente sob o site tumor usando fórceps e inserir os eletrodos através da pele, paralelo ao organismo certificar-se de que eles não penetram na cavidade peritoneal. Uma vez através da pele, posicione os eletrodos de tal forma que eles suporte o tumor.</li>
	<li>Programa do electroporator para entregar 100 µs de pulsos em uma frequência de 1 Hz a 1.500 V/cm, para um total de 150 pulsos. Entrega os pulsos usando o pedal. Separe cada conjunto de 10 pulsos por 10 s, a fim de permitir a dissipação de calor e confirmar a posição correta dos eletrodos. Nota: Sem o uso de agentes paralisantes, ratos experimentará contrações musculares com ira que pode causar o deslocamento dos eletrodos a manualmente.</li>
	<li>Remova os eletrodos após a dose completa, que não deverá exceder 200 s. registro entregue a tensão real, que é exibido sobre o electroporator. Permitir que os ratos se recuperar após IRE como por etapas 4.14-4.16.</li>
</ol>6. ira dos tumores ortotópico
Nota: A ira de tumores ortotópico envolve uma segunda cirurgia de sobrevivência no mouse mesmo exigindo aprovação especial de IACUC local antes de começar.
<ol><li>Preparar os materiais necessários: autoclave os instrumentos cirúrgicos, tais como tesouras, bisturis, drivers de agulha, apontou o fórceps e liso com ponta fórceps. Lembre-se também o seguinte nas proximidades: suturas estéreis (6-0 absorvível e não absorvível 4-0), amostras de álcool, cortar cabelo, creme depilatório, lubrificante do olho, gaze de algodão, 10% solução de iodo povidona, cirúrgicos, almofadas de aquecimento, electroporator de onda quadrada, interruptor de pé de segurança, eletrodos e seus adaptadores, buprenorfina e anestésicos.</li>
	<li>Avaliar os ratos para o crescimento do tumor ortotópico na vivo de imagem (consulte a etapa 4.17) através da injeção de 30 mg/kg de D-luciferina intraperitonealmente. Nota: Os tumores ortotópico são ideais para IRE tratamento 8 a 10 dias após a implantação, quando os tumores são claramente visíveis e ainda confinados ao pâncreas como pode ser visto nas imagens da luminescência Luciferase (Ver os Resultados do representante).</li>
	<li>Siga os passos 4.4-4.9, para localizar o tumor implantado. Se o tumor não é fácil de localizar, use fórceps nariz brusco para mover o estômago e baço suavemente para identificar o tumor.</li>
	<li>Exteriorizar o tumor com a pinça de nariz brusco e capturar o tumor firmemente com os eléctrodos de platina da pinça-pisasse. Entrega os pulsos electroporation como programado na etapa 5.7 usando o electroporator de onda quadrada em conjuntos de 10 pulsos controlados pelo interruptor de pé.</li>
	<li>Manter o tumor exteriorizado para pelo menos 60 post s IRE para monitorar sinais de hemorragia. Inserir o tumor volta na cavidade abdominal e fechar a incisão, como descritos anteriormente (passos 4.13-4.16) e monitorar o mouse até que se recupere.</li>
	<li>Monitore os efeitos da ira no crescimento do tumor utilizando na vivo do luciferase imagens conforme passo 4.17.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores têm sem divulgações financeiras relevantes.

Neste estudo, demonstramos um modelo de rato imunocompetentes para PC que pode ser usado para estudar os efeitos da ira sobre o crescimento do tumor. Atualmente, o Ira está sendo usada como uma técnica de ablação térmica não apenas em pacientes altamente selecionados de PC localmente avançados que não têm progressão da doença distante depois de meses de terapia pré-operatória. Seu uso, portanto, tem sido limitado, porque a maioria dos pacientes com PC localmente avançado desenvolver doença metastática distante<sup class=...

Adenocarcinoma ductal pancreático (PC) é projetada para se tornar a segunda causa principal de mortes por câncer nos Estados Unidos em torno de 20201. A grande maioria dos pacientes diagnosticados com PC acabará por morrer de doença metastática distante2. O microambiente de PC é notoriamente imunossupressor e chemoresistant. Seu estroma desmoplásico contém uma escassez das células T efetoras (anti-tumorais) e uma proeminência de leucócitos imunossupressoras, incluindo macrófagos tumor-associado (TAMs), mieloide supressor derivada de células (MDSCs) e pilhas de T reguladora (Tregs)3 . Estas fundamentam a necessidade de desenvolver estratégias multimodais que neutralizar estes efeitos do microambiente.
IRA foi desenvolvida como um método não-térmica de ablação de tumor. Ao contrário de técnicas de ablação térmica, IRE não causa necrose coagulativa rápida, mas em vez disso resulta em gradual apoptose celular morte4. Importante para tumores pancreáticos, a ira não é vulnerável aos efeitos de "dissipador de calor" e pode ser realizada ao lado de vasos sanguíneos5. Esta tecnologia tem 510 autorização do FDA6 e atualmente está sendo usada clinicamente, para pacientes selecionados com localmente avançado ou no limite ressecável câncer pancreático. A maior série publicados de IRE para PC7, a sobrevida mediana dos pacientes submetidos à ira foi aproximadamente dobro a sobrevivência dos pacientes tratados com quimioterapia moderna sozinha sem ressecção8,9.
Vários estudos têm demonstrado que a ablação térmica induz uma resposta imune sistêmica em outros tipos de tumor (revisto em Chu et al 10). ablação por radiofrequência (RFA) em tumor animal modelos conduzem ao aumento de células T, se infiltra11,12, incluindo um aumento nas células ativadas assassinas naturais (NK) em hepatocelular câncer pacientes13, 14e uma diminuição de Tregs imunossupressoras em de pacientes de câncer de pulmão15. Um número muito menor de estudos examinaram imunológico, microenvironmental e respostas de lesão para IRE16. IRA foi mostrada para estimular uma resposta imune sistêmica em modelos do rato imunocompetentes em que o crescimento dos enxertos de células renais (contralateral) secundário foi reduzido ou impedido pela ira de um tumor primário duas semanas anteriores17. Eles também observaram que camundongos imunocompetentes necessários menos tensão para regressão completa do que ratos imunodeprimidos. Isso tem sido a hipótese que ira pode resultar na apresentação de antigénios melhorado em comparação com a necrose coagulativa da ablação térmica, mas isto não tem sido estudado especificamente.
Desenvolvemos um modelo de syngeneic do mouse do PC da linha de celular de KPC-Luc 4580 (presente do J.J. Yeh na Universidade da Carolina do Norte), que foi derivado de um tumor que se desenvolveu em um macho LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse, para estudar os efeitos locais e sistêmicos de IRE18,19. Esta linha de celular do luciferase-expressando é imunogênica e também tumorigênico em imunocompetentes camundongos C57BL/6, quando injetado SQ ou orthotopically e confiantemente produz metástases hepáticas quando injetado o baço. Podemos ter utilizado um gerador de pulso de onda quadrada programável para entregar 100 µs pulsos de eletricidade em uma relação de tensão/distância de 1.500 V/cm, usando uma sonda de matriz de dois-agulha (separados por 5 mm) ou platina pinça-eletrodos para tumores SQ ou ortotópico, respectivamente, em ratos para modelar os efeitos da ira em um animal pequeno.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 eletroporador de onda quadrada</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BTX # 45-0002 ( 58018-004 )</td><td></td></tr><tr><td>2 agulhas eletrodo Harvard</td><td>Apparatus</td><td>45-0167</td><td></td></tr><tr><td>Interruptor de pé de segurança</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Tweezer-trode</td><td>Harvard Apparatus</td><td>&nbsp; 45-0486</td><td></td></tr><tr><td>Mídia DMEM-F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>792632</tr><tr><td>Lacrilube</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>19090646</tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>NC1292810</tr><tr><td>D-luciferrina</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp; Sistema de Imagem In Vivo Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de camundongo C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>000664 / Black 6</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular (KPC-Luc 4580)</td> <td>J.J. Yeh Lab na Universidade da Carolina</td><td></td><td></td>do Norte</tr><tr><td>BD Agulhas de seringa Precisionglide</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td>Cotonete com</td></tr><tr><td>álcool Z192406 (álcool isopropílico 70%)</td> <td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Pinças digitais</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Bisturis descartáveis, estéreis</td><td>Aplicadores</td> com ponta de algodão VWR <td>21909</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89198</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de sutura, 45 cm, tamanho 6-0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3308</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de Sutura, 45 cm, Tamanho 4-0</td><td>Aparelho Harvard</td><td>72-3314</td><td></td></tr><tr><td>Povidona-iodo 10%</td><td>BD</td><td>29900-404</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de Aquecimento Descartável&nbsp;</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>TP-3E</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de cortar cabelo para rato</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>Campo cirúrgico</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-7421</td><td></td></tr> Solução <tr><td>salina tamponada com fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de mouse syngeneic câncer pancreático para estudar os efeitos da eletroporação irreversível

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Câncer pancreático (PC), uma doença que mata cerca de 40.000 pacientes a cada ano nos Estados Unidos, tem iludidas com sucesso várias abordagens terapêuticas, incluindo as estratégias de imunoterapia promissoras. Eletroporação irreversível (IRE) é uma técnica de ablação não térmicos que induz a morte de células de tumor sem destruição de estruturas colágenas adjacentes, permitindo, assim, o procedimento a ser realizado nos tumores muito perto dos vasos sanguíneos. Ao contrário de técnicas de ablação térmica, IRE resulta na morte de células apoptóticas gradual, juntamente com necrose imediata ablação induzida e está atualmente em uso clínico para pacientes selecionados com PC localmente avançado. Um ablativo, procedimento específico não-alvo como IRE pode induzir uma infinidade de respostas no microambiente do tumor. Poucos estudos abordaram-se os efeitos da ira sobre o crescimento do tumor em outros tipos de tumor, mas nenhum têm-se centrado no PC. Desenvolvemos um modelo de syngeneic do mouse do PC no qual subcutâneo (SQ) e ortotópico tumores podem ser tratadas com sucesso com ira em um ambiente altamente controlado, facilitando o processo de post vários estudos longitudinais. Este modelo animal serve como um sistema robusto para estudar os efeitos da ira e maneiras de melhorar a eficácia clínica da ira.

Seguimos o procedimento descrito acima e gerado SQ tumores na semana de 5-6 velho tipo selvagem C57BL/6 ratos inoculados com 1 x 106 células com 50% BMM. Quando o tamanho do tumor chegou a 5-6 mm de diâmetro, alguns dos ratos foram sacrificados, os tumores foram extirpados e implantaram orthotopically em um destinatário camundongos C57BL/6. IRA foi realizada 10 dias após a implantação, conforme mostrado na linha do tempo na Figura 1. IRE realizou-s...

Eletroporação irreversível (IRE) é uma técnica de ablação não térmicos utilizada para o tratamento do câncer de pâncreas localmente avançado. Sendo uma técnica relativamente nova, os efeitos da ira sobre o crescimento do tumor são mal compreendidos. Nós desenvolvemos um modelo de mouse syngeneic que facilita a estudar os efeitos da ira sobre câncer pancreático.

Um modelo de Mouse Syngeneic câncer pancreático para estudar os efeitos da eletroporação irreversível

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

O objetivo geral deste modelo é estudar os efeitos da eletroporação irreversível ou IRE, no câncer de pâncreas em camundongos imunocompetentes. Este modelo pode ajudar a responder a muitas perguntas-chave sobre o papel do IRE no câncer de pâncreas. Por exemplo, como o IRE afeta o microambiente tumoral local?A principal vantagem desse modelo é que ele facilita a avaliação precisa do crescimento do tumor em um sistema imunocompetente, sem exigir modelos de camundongos knockout ou mutantes. Este método pode fornecer informações sobre os efeitos do IRE no sistema imunológico, em um modelo de camundongo imunocompetente de câncer de pâncreas. Para indução de tumor subcutâneo, primeiro, raspe o local da injeção em um camundongo C57 preto de seis semanas anestesiado e use um cotonete embebido em álcool para limpar o local duas vezes.Em seguida, carregue uma seringa fria de um mililitro com uma a duas vezes dez a sete células por mililitro e 250 microlitros de matriz de membrana basal. Conecte uma agulha de calibre 25 à seringa e carregue a agulha com a suspensão de células tumorais. Pressione e retraia o êmbolo algumas vezes para remover quaisquer bolhas de ar.Insira cuidadosamente a agulha sob a pele do local da injeção, em um ângulo de 30 graus. Com a agulha paralela ao corpo, injete lentamente 50 microlitros das células tumorais. Após 10 segundos, retire lentamente a agulha, mantendo-a paralela sem nenhum movimento lateral, e limpe suavemente o local da injeção com um cotonete embebido em álcool, antes de retornar o mouse à sua gaiola.Quando o tumor atingir de cinco a sete milímetros, use pinça estéril e microtesoura para extirpar o tumor subcutâneo, em condições estéreis em um capuz de nível dois de biossegurança, tomando cuidado para não perfurar a cavidade peritoneal. Lave imediatamente o tumor excisado, duas vezes, em PBS estéril. E use bisturis estéreis para picar o tumor em pedaços de um a dois milímetros cúbicos.Em seguida, transfira os pedaços do tumor para uma placa de Petri, contendo meio basal DMEM frio e estéril em gelo. Para implantar os fragmentos tumorais, após confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, aplique pomada nos olhos do animal receptor anestesiado e coloque o camundongo do lado direito, de modo que o lado esquerdo do abdômen fique exposto. Remova os pelos abdominais com creme depilatório e remova o creme com gaze.Depois de desinfetar a pele exposta com três lenços sequenciais de 10% de povidona mais iodo e álcool, use um bisturi estéril para fazer uma incisão de 1,5 centímetro na pele, um centímetro à esquerda da linha média, abaixo da caixa torácica e ligeiramente medial ao baço. Exteriorize suavemente o baço com uma pinça de ponta plana e um aplicador de algodão estéril e use a pinça para retrair lateralmente a cauda do pâncreas, na parte inferior do baço. Usando uma pinça estéril, segure um pedaço de tumor finamente picado e passe uma agulha de sutura estéril 6-O fina através da peça.Insira a agulha contendo o fragmento do tumor na cauda do pâncreas, passando a sutura lentamente pelo tecido. Tome cuidado para evitar o contato entre o tumor e a musculatura da parede abdominal e o peritônio, para evitar a disseminação do tumor. Quando o fragmento do tumor estiver preso, remova completamente a agulha do tecido e mantenha os órgãos completamente exteriorizados por mais 60 segundos, enquanto inspeciona se há sinais de hemorragia.Se nenhum sangramento for observado, use uma pinça romba ou um aplicador de ponta de algodão para retornar suavemente o baço, o pâncreas e o tumor à cavidade abdominal. Antes que o tumor atinja seis milímetros de diâmetro, coloque o animal anestesiado do lado direito para permitir o acesso ao tumor e use uma tesoura e um cotonete com álcool para limpar o local do tumor. Usando uma pinça, eleve a pele diretamente sob o tumor e insira dois eletrodos de arranjo de agulhas através da pele, paralelos ao corpo, para braquear o tumor, tomando cuidado para que os eletrodos não penetrem na cavidade peritoneal.Defina o eletroporador para fornecer pulsos de 100 microssegundos a uma frequência de um hertz, a 1500 volts por centímetro, para um total de 150 pulsos, e use o pedal para fornecer os pulsos, separando cada conjunto de 10 pulsos por 10 segundos, para permitir a dissipação de calor entre cada conjunto de pulsos. Como a contração muscular ocorre durante a entrega do IRE e é mais pronunciada durante o conjunto inicial de pulsos, certifique-se de que os eletrodos ainda estejam no local desejado e que o animal ainda esteja sedado após cada conjunto de pulsos. Após não mais de 200 segundos de dosagem, remova os eletrodos e registre o volume realtage fornecido, conforme exibido no eletroporador.Em seguida, retorne o mouse para sua gaiola. Para IRE de um tumor ortotópico, oito a 10 dias após o implante do tumor, use uma pinça de nariz rombudo para externalizar o tumor com a pinça e capture firmemente o tumor com os eletrodos de platina da pinça, forneça os pulsos de eletroporação, como acabamos de demonstrar, mantendo o tumor externalizado para o último conjunto de pulsos, por pelo menos 60 segundos, para monitorar quaisquer sinais de hemorragia. Em seguida, retorne o tumor para a cavidade abdominal e feche a incisão, conforme demonstrado, monitorando o animal até que ele esteja totalmente recuperado.Neste experimento representativo, os tumores subcutâneos, em quase 50% dos camundongos, regrediram completamente após 150 pulsos de IRE, com apenas uma pequena regressão após 75 pulsos. A análise histológica do tecido tumoral, uma semana após a IRE, revelou grandes regiões de necrose tumoral central, que não foram observadas em tumores controle, não tratados, e que foram flanqueadas por tecido tumoral vivo, em casos de regressão tumoral incompleta. O monitoramento das taxas de crescimento de tumores ortotópicos implantados revelou um crescimento tumoral consistente ao longo do tempo em animais receptores, que também pode ser interrompido pelo IRE, demonstrando a capacidade deste modelo de simular os efeitos do IRE, em um modelo de camundongo imunocompetente.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 15 minutos por mouse, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o tamanho do tumor dentro da distância de trabalho dos eletrodos IRE disponíveis, pois tumores maiores produzirão respostas inconsistentes devido à ablação incompleta. Outras abordagens de tratamento, como radiação ou quimioterapias, também podem ser usadas para responder a perguntas adicionais sobre se a combinação de tratamentos pode melhorar as respostas do tumor ao IRE.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer cânceres pancreáticos subcutâneos e ortotópicos em camundongos e como realizar IRE nesses tumores.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O vídeo explica um método cirúrgico passo a passo para implantação ortotópica de um fragmento tumoral de um doador canceroso para o pâncreas de um camundongo receptor não canceroso para o desenvolvimento de câncer de pâncreas. O PDAC implantado ortotopicamente pode recapturar o microambiente tecidual de cânceres pancreáticos humanos do que os modelos subcutâneos (SC) convencionais com mais precisão.

Transplante de tumor ortotópico de homoenxerto: uma técnica para gerar modelos de camundongos com tumor pancreático

Este vídeo descreve o procedimento para realizar eletroporação irreversível (IRE) para ablação não térmica de tumores pancreáticos em camundongos. Tanto os tumores subcutâneos (SQ) quanto os ortotópicos podem ser tratados com sucesso com IRE em um ambiente altamente controlado, facilitando vários estudos pós-procedimento.

Eletroporação irreversível: uma técnica para ablação de tumor pancreático em camundongo

Este vídeo demonstra o protocolo para implantar células cancerígenas pancreáticas que expressam proteínas fluorescentes verdes ortotopicamente no pâncreas do camundongo. O modelo ortotópico de camundongo ajuda a investigar a eficácia de novas terapêuticas em tumores primários e metastáticos.

Modelo de camundongo ortotópico fluorescente: implantando células cancerígenas que expressam GFP em camundongos para avaliar a progressão do tumor in vivo

Este vídeo demonstra um modelo ortotópico de câncer de pâncreas que utiliza Matrigel para entrega celular localizada e imagens de bioluminescência in vivo para monitoramento não invasivo da progressão do tumor. O modelo ortotópico é adequado para modelos singênicos e de xenoenxerto e pode ser usado em ensaios pré-clínicos para investigar o impacto de novas terapias anticâncer no crescimento do tumor pancreático primário e metástase.

Modelo de camundongo com câncer de pâncreas ortotópico bioluminescente: uma técnica não invasiva para monitorar a progressão do câncer em camundongos

A modelo pré-clínico, murino de metástases hepáticas realizado através de uma técnica de injeção hemispleen.

Um Modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica

O objetivo deste protocolo é aplicar ressonância magnética com contraste dinâmico (DCE-MRI) para xenoenxertos de tumores pancreáticos ortotópicos em camundongos. A DCE-MRI é um método não invasivo para analisar a microvasculatura em um tecido-alvo e útil para avaliar a resposta vascular em um tumor após uma nova terapia.

Contraste Dinâmico aprimorada Ressonância Magnética de um Modelo de câncer de pâncreas Orthotopic Rato

Um procedimento para implantar células cancerígenas pancreáticas que expressam proteínas fluorescentes verdes (PANC-1 GFP) ortotopicamente no pâncreas de camundongos Balb-c Ola Hsd-Fox1nu para avaliar a progressão e metástase do tumor é apresentado aqui.

Fluorescente modelo de camundongo ortotópico de câncer de pâncreas

Descrevemos um protocolo para a implantação guiada por ultrassom de linhas de células de adenocarcinoma ductal pancreática derivada de urina diretamente no local do tumor nativo. Esta aproximação conduziu aos tumores pancreatic detectáveis pela exploração do ultra-som dentro de 2-4 semanas da injeção, e reduziu significativamente a semeadura da pilha do tumor da proporção na parede peritoneal em comparação à implantação ortotópica cirúrgica.

Implantação ortotópica guiada por ultrassom do Adenocarcinoma Ductal Pancreático murine

No contexto clínico, pacientes com câncer pancreático localizado serão submetidos à pancreatectomia seguida de tratamento adjuvante. Este protocolo aqui relatado visa estabelecer um método seguro e eficaz de modelagem deste cenário clínico em camundongos nus, através da implantação ortotópica de câncer pancreático seguido de pancreatectomia distal e esplenectomia.

Um modelo de rato resemcional ortotópico de câncer pancreático

Aloenxertos ortotópicos singênicos de adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) de camundongos recapitulam a biologia, os fenótipos e as respostas terapêuticas dos subtipos da doença. Devido à sua rápida e reprodutível progressão tumoral, são amplamente utilizados em estudos pré-clínicos. Aqui, mostramos práticas comuns para gerar esses modelos, injetando culturas de PDAC murino singênico no pâncreas.

Aloenxertos Ortotópicos Singênicos de Camundongos para Modelo de Câncer de Pâncreas

O presente protocolo descreve uma nova abordagem para modelar a pancreatite obstrutiva crônica, que envolve a visualização do ducto pancreático e a eletrocoagulação do ducto pancreático para causar obstrução do ducto pancreático.

Um modelo de pancreatite crônica obstrutiva estabelecido por eletrocoagulação

Aprenda a usar um modelo sinigênico de camundongo para estudar os efeitos da eletroporação irreversível no câncer pancreático. Este método permite avaliar o crescimento tumoral e a resposta imune em sistema imunocompetente.

Um modelo de Mouse Syngeneic câncer pancreático para estudar os efeitos da eletroporação irreversível

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