Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no desenvolvimento genético e neurológico, como durante o desenvolvimento pós-natal. A principal vantagem dessa técnica é que é uma técnica simples com dispositivo caseiro. A demonstração visual desse método é fundamental porque fazer injeções direcionadas no cérebro requer total atenção aos detalhes.

Para começar, faça um suporte para usar filhotes neonatais em um aparelho estereotáxico. Primeiro faça a bandeja principal. Corte cerca de 1/5 do fundo de um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro para fazer uma abertura para a cabeça de um filhote neonatal.

Em seguida, selecione uma caixa de ponteira de pipeta vazia que se encaixe no pedestal do aparelho estereotáxico. Em seguida, use cola quente para prender a bandeja da cabeça na base da caixa de pontas. Em seguida, cole uma fita de incorporação de tecido na caixa, onde ela pode apoiar o torso do filhote enquanto sua cabeça é fixada.

Agora prepare agulhas de aço inoxidável calibre 30 para a injeção. Primeiro, pré-limpe-os mergulhando-os em clorofórmio por três dias em um frasco de vidro. Três dias depois, retire cuidadosamente as agulhas e lave-as com etanol absoluto por 20 minutos e com 50 rpm de agitação.

Em seguida, lave-os três vezes em etanol 70% por 10 minutos por lavagem, também com agitação. Após as lavagens, deixe as agulhas secarem ao ar e guarde-as em uma caixa limpa em temperatura ambiente até o uso. Para o conjunto de microinjeção, use um segmento de cinco centímetros de tubo de polietileno PE20 para conectar o tubo PE10 a uma seringa de 26 calibres e 10 microlitros.

Fixe a junção com cianoacrilato. Em seguida, monte a nova agulha de injeção de calibre 30 na outra extremidade do tubo PE10. Agora carregue a seringa de microinjeção de 10 microlitros.

Remova o êmbolo e use outra seringa de calibre 25 para carregar o conjunto com água destilada autoclavada para remover o ar da tubulação. Em seguida, coloque o êmbolo de volta na seringa de microlitros e empurre o êmbolo até que restem apenas dois microlitros de água destilada no barril e nada menos. Em seguida, monte cuidadosamente a seringa de microlitro na bomba de seringa de microfluxo.

Em seguida, pipete pequenas quantidades de corante 0,1% Fast Green filtrado nos líquidos experimentais do vírus em um pedaço de parafilme. Agora aspire uma pequena quantidade de ar para dentro da seringa até que uma bolha de ar seja visível entre a agulha de injeção e o tubo. Em seguida, carregue 0,7 microlitros de solução Fast Green filtrada para testar o fluxo de fluidos na tubulação de microinjeção.

Se o fluxo for bom, aspire outro pequeno volume de ar para fazer uma segunda bolha de ar e, em seguida, carregue a solução de injeção no tubo de microinjeção. Encaixar e fixar a agulha de microinjecção ao aparelho estereotáxico e proceder à microinjecção dos ratinhos neonatais. Em preparação para a cirurgia, limpe completamente o instrumento estereotáxico com 70% de etanol e esterilize os instrumentos cirúrgicos com 70% de etanol.

Em seguida, anestesiar um recém-nascido usando hipotermia. Coloque o filhote em uma luva de látex e mergulhe-o em gelo picado até o pescoço por cinco minutos. Em seguida, aperte os pés do filhote com uma pinça para garantir que não haja reflexo pedal.

Em seguida, posicione o filhote com a luva na bandeja da cabeça e coloque um pouco de gelo picado ao redor da manga de látex para manter a anestesia de hipotermia. Em seguida, esfregue a cabeça do filhote com etanol a 70% e localize o ponto de referência lambda. Marque-o com um marcador.

Em seguida, aponte a ponta da agulha para o lambda e defina as coordenadas anterior/posterior e medial/lateral como zero. Em seguida, consultando um atlas cerebral, mova o braço de injeção para o local alvo. Por exemplo, o estriado de filhotes P2 é 2,4 milímetros anterior ao lambda, 1,0 milímetros de cada lado da linha média e 1,7 milímetros ventral.

Em seguida, marque a posição do corante Fast Green no tubo PE10 usando uma caneta. Em seguida, comece lentamente a penetrar a agulha através da pele e do crânio até que a ponta da agulha entre em contato com a superfície do crânio. Defina a coordenada dorsal/ventral como zero.

Em seguida, abaixe a agulha lentamente até o local de destino. Uma vez na posição, aguarde um minuto para permitir que o parênquima retorne à sua forma normal. Em seguida, execute o programa de microinjeção a 100 nanolitros por minuto.

Durante a injeção, observe o corante Fast Green se mover no tubo de PE. É fundamental penetrar lentamente a agulha através da pele e do crânio até que a ponta da agulha entre em contato com a superfície do crânio. Durante a injeção, é imperativo observar o corante Fast Green se mover no tubo de PE.

Após a conclusão da injeção, aguarde um minuto e, em seguida, leve lentamente a agulha até 1/2 da profundidade do DV penetrado. Em seguida, espere mais 30 segundos antes de prosseguir com a retirada lenta da agulha da cabeça do filhote. Após a conclusão da injeção, é importante esperar um minuto antes de levar lentamente a agulha a 1/2 da profundidade do DV penetrado.

Em seguida, espere mais 30 segundos antes de retirar lentamente a agulha da cabeça do filhote. Depois que todos os locais-alvo forem injetados, aqueça o filhote por 20 minutos em uma incubadora de 33 graus Celsius. Verifique o filhote a cada cinco minutos até que ele recupere a decúbito esternal.

Em seguida, devolva o filhote à sua mãe. 200 nanolitros de vírus que expressam Cre DNA recombinase fundido com GFP foram injetados no estriado P2 de camundongos Ai14. Esses camundongos expressaram o gene repórter tdTomato após a deleção mediada por Cre de um de parada flanqueada loxP.

Os cérebros foram colhidos em P14 para imunomarcação de GFP e tdTomato. Muitas células positivas para GFP transduzidas por AAV estavam presentes em todo o estriado, indicando uma extensa infecção das células estriatais pelos vírus AAV EGFP Cre. Expressão extensiva semelhante de tdTomato também foi encontrada no estriado.

Após exame microscópico em alta ampliação, descobriu-se claramente que todas as células estriatais positivas para GFP co-expressam o gene repórter tdTomato. Além disso, os sinais de tdTomato foram detectados em terminais presumivelmente axônicos no globo pálido, na substância negra pars reticulata, as regiões-alvo dos neurônios de projeção estriatonigral e estriatopallidal. Juntos, esses resultados sugerem uma recombinação bem-sucedida de DNA mediada por Cre loxP induzida pela expressão mediada por AAV da atividade de Cre em neurônios estriados neonatais.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos para injeção estriatal bilateral se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que esta é uma delicada cirurgia cerebral neonatal que requer paciência e cuidado. A partir deste procedimento, outros métodos como optogenética e quimiogenética podem ser realizados a fim de analisar a maturação durante o desenvolvimento pós-natal.