Name: Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprenda cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato neonatal usando um dispositivo caseiro. Este método permite injeções precisas de reagentes para estudar neurodesenvolvimento.

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Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia concede MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, os institutos de pesquisa de saúde nacional conceder INDH-EX106-10429NI e programa de centro de pesquisa de áreas Indicados: concessão de o Ministério da educação, através do centro de pesquisa do cérebro, National Yang-Ming University, em Taiwan, e pós-doutorado concede MOST106-2811-B-010-031 (S.-Yc), MOST105-2811-B-010-036 e MOST106-2811-B-010-030 (YK-H.).

Os protocolos de animais descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal e uso comissões da Universidade Nacional de Yang-Ming.
1. preparação do titular para filhotes Neonatal no aparato estereotáxica
<ol><li>Fazer a cabeça da bandeja: cortar o fundo de um tubo de centrífuga de 1,5 mL (15 mm de comprimento) na forma que se encaixa a cabeça dos filhotes neonatais através da remoção de 1/5 da parede do tubo.</li>
	<li>Pegue uma caixa de ponta de pipeta com o tamanho certo que se encaixa com o pedestal de aparelhos estereotáxicos e remover a tampa superior. Fixe a cabeça bandeja preparada no passo 1.1 e um estojo de incorporação de tecido na base da bandeja de ponta com adesivo dederretimento. A altura da fita tecido incorporação é de 7 mm, que é usado para suportar do filhote pescoço e corpo na posição de cabeça-corrigido.</li>
	<li>Coloque toda a configuração em um aparelho padrão estereotáxica.</li>
</ol>2. preparação de agulhas de aço inoxidável de injeção 30g
<ol><li>Limpeza prévia 30 agulhas de seringa G embebendo-os no clorofórmio durante 3 dias.</li>
	<li>Use fórceps para lentamente e com cuidado retire a agulha do seu hub de polipropileno em uma capa de química.</li>
	<li>Lave as agulhas com etanol absoluto por 20 min, seguido de lavagens de etanol 70% para 3 × 10 min num agitador a 50 rpm. Deixe o ar de agulhas para secar e armazenar as agulhas limpas em uma caixa limpa, à temperatura ambiente (RT) até o uso.</li>
</ol>3. prepare um adaptador para tubos de Microinjection
<ol><li>Conecte a seringa de microlitro de uma agulha de injeção de 30G com um tubo de polietileno PE10 (PE10 tubo). Prepare um adaptador de tubo (tubo PE20) PE20 polietileno para colmatar a agulha e a seringa microlitro. O uso do adaptador é necessário, porque o diâmetro do tubo PE10 é muito menor do que a agulha da seringa microlitro 26G.</li>
	<li>Preparar o tubo para a seringa de microlitro: Conecte a agulha de injeção de 30g previamente limpos com 5 cm de tubo PE20 e selar a junção com cola instantânea. Este adaptador de tubo é reutilizável. Nota: Se a agulha da seringa de microinjeção 30G, a preparação (passo 3.1) e o uso (passo 3.3) deste adaptador não é necessário.</li>
	<li>Conecte o adaptador de tubo (preparado no passo 3.1) com uma seringa de microlitro (10 µ l).</li>
	<li>Conecte uma extremidade do tubo PE10 (não mais de 60 cm) sobre a agulha 30G do adaptador de tubo PE20. Monte uma nova agulha de injeção de 30g na outra extremidade do tubo PE10.</li>
</ol>4. carregar o Microinjection tubo com água destilada esterilizada, corante e vírus
<ol><li>Remova o êmbolo da seringa microlitro. Use uma seringa 25g para carregar a seringa microlitro e seu tubo PE conectado com água destilada esterilizada para remover o ar do tubo.</li>
	<li>Coloque o êmbolo volta à seringa microlitro e empurrar o êmbolo até 2 µ l de água destilada permanece no cano. Não deixe que o volume de água destilada, tornar-se inferior a 2 µ l.</li>
	<li>Monte cuidadosamente a seringa microlitro para a bomba de seringa de taxa de fluxo micro.</li>
	<li>Pipetar pequenas quantidades de corante rápido verde de 0.1% (preparada em soro fisiológico a 0,9% e filtrada com filtro de 0,22 µm) e os líquidos de vírus para um pedaço de parafilme.</li>
	<li>Retire uma pequena quantidade de ar tornar visível uma bolha de ar na junção entre a agulha de injeção de 30g e PE10 tubo seguido por 0,7 µ l de filtrado verde rápido a carregar para dentro do tubo para testar o fluxo de fluidos em tubulação microinjeção.</li>
	<li>Retire outra pequena quantidade de ar para fazer uma bolha de ar segunda seguida por carregar os líquidos de vírus para o tubo de microinjeção.</li>
	<li>Anexar e fixe a agulha de microinjeção de 30g para o braço do aparelho estereotáxica.</li>
</ol>5. anestesia de ratos Neonatal por hipotermia
<ol><li>Coloque o filhote em uma luva de látex da luva e mergulhe-a em gelo picado até o pescoço por 5 min.</li>
	<li>Belisca os pés do filhote com fórceps para certificar-se de não resposta de retirada de seus pés.</li>
	<li>Coloque o filhote com luva de látex luva na bandeja da cabeça e Coloque gelo triturado em torno a luva de látex para mantê-lo frio para anestesia de hipotermia.</li>
	<li>Aplica o vet pomada nos olhos do filhote para evitar ressecamento enquanto sob anestesia, se possível.</li>
</ol>6. microinjection
<ol><li>Prepare a cirurgia estéril limpando o instrumento estereotáxica com etanol a 70%. Esterilize o instrumento cirúrgico imergindo-os em etanol a 70%.</li>
	<li>Esfrega a cabeça do filhote com 70% de etanol. Localizar o lambda de marco no crânio e marcar o lambda com uma caneta. Aponte a ponta da agulha para o lambda e definir o ântero-posterior (AP) e médio-lateral (ML) coordenadas como zero.</li>
	<li>Mova o braço para injeções no site de destino de acordo com as coordenadas X e Y do local de destino. Para o corpo estriado do dia pós-natal (P) 2 filhotes, as coordenadas são: AP, +2,4 mm anterior o lambda; ML, 1,0 milímetros lateral da linha média; dorso-ventral (DV), −1.7 mm do crânio. Marca a posição de corante verde rápido em PE10 tubo com uma caneta.</li>
	<li>Trazer a agulha de injeção de 30g lentamente penetrar através da pele e o crânio e então trazer a ponta da agulha até que ele para na superfície do crânio. Defina a coordenada DV como zero.</li>
	<li>Derrubar a agulha 30G lentamente até atingir a coordenada DV do local de destino. Espere 1 min permitir que o parênquima, retomando a sua forma normal. Execute o programa de microinjeção (100 nL/min).</li>
	<li>Certifique-se de que a marca da tintura verde rápido está se movendo no tubo de PE, para garantir que o líquido do vírus é injetado no cérebro.</li>
	<li>Aguardar 1 min após o término da microinjeção e então lentamente e progressivamente trazer a agulha até a altura de 1/2 de profundidade DV dentro de 30 s. Após 30 s, lentamente, retirar a agulha da cabeça do filhote.</li>
	<li>Repita o passo 6.2 a 6.7 até os alevinos de todos os sites alvo sejam concluídos.</li>
</ol>7. pós-cirúrgica recuperação do filhote
<ol><li>Aquecer o filhote por 20 min em uma incubadora de 33 ° C. Verificar a recuperação do filhote da anestesia hipotermia cada 5 min até que o filhote recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.</li>
	<li>Retorna o filhote para a barragem, depois que o filhote está totalmente recuperado.</li>
</ol>

<ol><li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li>
<li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+development+of+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li>
<li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+neurodevelopmental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li>
<li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+circuits%2C+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li>
<li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).</li>
<li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice%3A+a+neurosurgical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Bull%22%5BJournal%5D)">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li>
<li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neostriatal+mosaic%3A+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuit%22%5BJournal%5D)">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

No presente estudo, vamos demonstrar um método simples e confiável de estereotáxica para injetar o vírus AAV para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal. Nós injetadas vírus AAV-eGFP-Cre para o corpo estriado de ratos de repórter Ai14 em P2 e então analisados a expressão do gene repórter no P14. Nós encontramos que AAV transfectadas células GFP-positivo em todo o corpo estriado em níveis rostrocaudal. Além disso, quase todas as células GFP-positivo co expressaram o gene do repórter de tdTomato nas células estriadas...

Estudos modernos da estrutura e função do cérebro normalmente requerem manipulação genética de genes específicos nas células neuronais. Para sondar as funções dos genes diferentes, ratos transgénicos carregando alelos mutantes, incluindo foram rotineiramente gerados nocaute e bater-em alelos. Cirurgia cerebral estereotáxica para roedores adultos é um método padrão para localmente entregar drogas, vírus, marcadores e outros reagentes para regiões específicas do cérebro de roedor1,2. Aplicando a cirurgia estereotáxica cerebral de ratos transgénicos permite um de manipular geneticamente a função dos genes e a atividade neuronal em específicas populações neuronais do cérebro do rato. A manipulação do tipo específico de célula fornece uma poderosa abordagem para decifrar funções neuronais em complexos circuitos neurais do cérebro3,,4,5.
Desenvolvimento neural do sistema nervoso começa em estágios embrionários iniciais, e os processos de desenvolvimento continuam após o nascimento, até o período juvenil. Maturação pós-natal do sistema nervoso inclui a fiação sináptica precisa de circuitos neurais, que é essencial para funções fisiológicas e cognitivas do cérebro6. Portanto, estudar o desenvolvimento eventos que ocorrem em janelas de tempo neonatal é importante não só para compreender o desenvolvimento neural normal, mas também pode fornecer insights sobre a patogênese do desenvolvimento neurológico e transtornos neuropsiquiátricos7 ,8. Embora os métodos de cirurgia cerebral estereotáxica para roedores adultos estão prontamente disponíveis2,9, alguns protocolos estão disponíveis na internet para uma cirurgia estereotáxica cerebral em ratos neonatal10,11. Na verdade, estereotáxicos microinjeções de reagentes no cérebro de filhotes de rato neonatal são difíceis, porque a cabeça do filhote neonatal é demasiado frágil para ser fixada no aparelho estereotáxica padrão. No entanto, a aplicação da cirurgia estereotáxica cerebral de ratos transgênicos é viável para ratos neonatal12. Aqui, descrevemos um método simples com uma armadilha caseira para realizar cirurgia cerebral estereotáxica em filhotes de rato recém-nascido. Vamos demonstrar que essa técnica permite excluir condicionalmente genes de floxed por microinjecting recombinase AAV-expressando Cre DNA para o corpo estriado de ratos de gene repórter e condicionalmente floxed ratos transgénicos. Esta técnica também é aplicável para entregar os reagentes para o neonatal corpo estriado de ratos tipo selvagem.

<table><tbody><tr><td>Agulha PrecisionGlide 30G</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Seringa MICROLITRO JT Baker</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Hamilton</td><td>&nbsp;</td><td>80300</td><td>30G agulha adequada para tubo PE10; a agulha 26G precisa de um adaptador PE20</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bomba de seringa de taxa de fluxo</td><td>Bomba de precisão mais longa Co.</td><td>Seringa TJ-2A (Controlador) e L0107-2A (Unidade de Acionamento)</td><td></td></tr> <tr><td>25G</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 302105</td><td></td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Instrumentos Estereotáxicos Padrão</td><td>RWD Ciências da Vida</td><td>68037</td><td>Sem usar 68030 Adaptador de Rato/Rato Neonatal Anticorpo</td></tr><tr><td>Abcam</td><td></td><td>ab16046</td><td>Coelho policlonal para FOXP2, 1:4.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-RFP</td><td>Abcam</td><td>ab65856</td><td>Monoclonal de camundongo para RFP, microscópio 1:1.000</td></tr><tr><td>BX63</td> Microscópio confocal <td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho conjugado Alexa fluor594</td><td>Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td><td>111-585-003</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV1848</td><td>Lote # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)</td></tr><tr><td>AAV9.chicken actin-eGFP</td><td>AAV core, Instituto de Ciências Biomédicas, Academia Sinica, Taiwan</td><td>N/A</td><td>1x1014 (GC/ml)</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>O Laboratório Jackson&nbsp;</td><td>007914</td><td>Ai14</td></tr><tr><td>B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td><td>O Laboratório Jackson&nbsp;</td><td>026259</td><td>Foxp2fl/fl</td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato</td><td>Corning&nbsp; cellgro</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr></tbody></table>

cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato neonatal

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Muitos genes são expressos no cérebro embrionário, e alguns deles são continuamente expressas no cérebro após o nascimento. Para tais genes persistentemente expressos, eles podem funcionar para regular o processo de desenvolvimento e/ou função fisiológica no cérebro neonatal. Para investigar as funções neurobiológicas de genes específicos no cérebro, é essencial para inativar genes no cérebro. Aqui, descrevemos um método simples estereotáxica para inactivar a expressão gênica no corpo estriado de ratos transgênicos em janelas de tempo neonatal. O vírus AAV-eGFP-Cre foram injetado para o corpo estriado de ratos de gene repórter Ai14 em dia pós-natal (P) 2 por cirurgia cerebral estereotáxica. A expressão do gene repórter tdTomato foi detectada no corpo estriado de P14, sugerindo um sucesso Cre-loxP mediada por recombinação de DNA em células transfectadas-AAV striatal. Nós validado ainda mais esta técnica por microinjecting o vírus AAV-eGFP-Cre em camundongos P2Foxp2fl/fl . Dupla rotulagem de GFP e Foxp2 mostrou que as células GFP-positivo faltavam Foxp2 imunorreatividade no corpo estriado P9, sugerindo que a perda de proteína Foxp2 em AAV-eGFP-Cre transfectada striatal células. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram uma exclusão genética eficaz por stereotaxically microinjected vírus AAV-eGFP-Cre em específicas populações neuronais no cérebro neonatal de floxed ratos transgénicos. Em conclusão, nossa técnica estereotáxica fornece uma plataforma simples e fácil para manipulação genética em cérebro de rato neonatal. A técnica não pode somente ser usada para excluir genes em regiões específicas do cérebro neonatal, mas também pode ser usada para injetar drogas farmacológicas, marcadores neuronais, optogenetics geneticamente modificados e chemogenetics proteínas, indicadores de atividade neuronal e outros reagentes para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal.

Para o primeiro conjunto de experiência, nós injetadas 200 nL de AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 vírus (AAV-eGFP-Cre, diluição de 1/10 em solução salina de tampão fosfato de Dulbecco) que expressam a recombinase Cre DNA fundidos com GFP em P2 corpo estriado de ratos Ai14. Os ratos Ai14 expressam tdTomato gene repórter sobre exclusão Cre-mediada de loxP-flanqueado (floxed) STOP gaveta (Figura 2F). Os cérebros foram colhidos no P14 para imunocoloração de G...

Descreveremos um protocolo de cirurgia estereotáxica com um dispositivo caseiro de cabeça-corrigido para reagentes microinjecting para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal. Esta técnica permite a manipulação genética em células neuronais de regiões específicas do cérebro de rato neonatal.

Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no desenvolvimento genético e neurológico, como durante o desenvolvimento pós-natal. A principal vantagem dessa técnica é que é uma técnica simples com dispositivo caseiro. A demonstração visual desse método é fundamental porque fazer injeções direcionadas no cérebro requer total atenção aos detalhes.Para começar, faça um suporte para usar filhotes neonatais em um aparelho estereotáxico. Primeiro faça a bandeja principal. Corte cerca de 1/5 do fundo de um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro para fazer uma abertura para a cabeça de um filhote neonatal.Em seguida, selecione uma caixa de ponteira de pipeta vazia que se encaixe no pedestal do aparelho estereotáxico. Em seguida, use cola quente para prender a bandeja da cabeça na base da caixa de pontas. Em seguida, cole uma fita de incorporação de tecido na caixa, onde ela pode apoiar o torso do filhote enquanto sua cabeça é fixada.Agora prepare agulhas de aço inoxidável calibre 30 para a injeção. Primeiro, pré-limpe-os mergulhando-os em clorofórmio por três dias em um frasco de vidro. Três dias depois, retire cuidadosamente as agulhas e lave-as com etanol absoluto por 20 minutos e com 50 rpm de agitação.Em seguida, lave-os três vezes em etanol 70% por 10 minutos por lavagem, também com agitação. Após as lavagens, deixe as agulhas secarem ao ar e guarde-as em uma caixa limpa em temperatura ambiente até o uso. Para o conjunto de microinjeção, use um segmento de cinco centímetros de tubo de polietileno PE20 para conectar o tubo PE10 a uma seringa de 26 calibres e 10 microlitros.Fixe a junção com cianoacrilato. Em seguida, monte a nova agulha de injeção de calibre 30 na outra extremidade do tubo PE10. Agora carregue a seringa de microinjeção de 10 microlitros.Remova o êmbolo e use outra seringa de calibre 25 para carregar o conjunto com água destilada autoclavada para remover o ar da tubulação. Em seguida, coloque o êmbolo de volta na seringa de microlitros e empurre o êmbolo até que restem apenas dois microlitros de água destilada no barril e nada menos. Em seguida, monte cuidadosamente a seringa de microlitro na bomba de seringa de microfluxo.Em seguida, pipete pequenas quantidades de corante 0,1% Fast Green filtrado nos líquidos experimentais do vírus em um pedaço de parafilme. Agora aspire uma pequena quantidade de ar para dentro da seringa até que uma bolha de ar seja visível entre a agulha de injeção e o tubo. Em seguida, carregue 0,7 microlitros de solução Fast Green filtrada para testar o fluxo de fluidos na tubulação de microinjeção.Se o fluxo for bom, aspire outro pequeno volume de ar para fazer uma segunda bolha de ar e, em seguida, carregue a solução de injeção no tubo de microinjeção. Encaixar e fixar a agulha de microinjecção ao aparelho estereotáxico e proceder à microinjecção dos ratinhos neonatais. Em preparação para a cirurgia, limpe completamente o instrumento estereotáxico com 70% de etanol e esterilize os instrumentos cirúrgicos com 70% de etanol.Em seguida, anestesiar um recém-nascido usando hipotermia. Coloque o filhote em uma luva de látex e mergulhe-o em gelo picado até o pescoço por cinco minutos. Em seguida, aperte os pés do filhote com uma pinça para garantir que não haja reflexo pedal.Em seguida, posicione o filhote com a luva na bandeja da cabeça e coloque um pouco de gelo picado ao redor da manga de látex para manter a anestesia de hipotermia. Em seguida, esfregue a cabeça do filhote com etanol a 70% e localize o ponto de referência lambda. Marque-o com um marcador.Em seguida, aponte a ponta da agulha para o lambda e defina as coordenadas anterior/posterior e medial/lateral como zero. Em seguida, consultando um atlas cerebral, mova o braço de injeção para o local alvo. Por exemplo, o estriado de filhotes P2 é 2,4 milímetros anterior ao lambda, 1,0 milímetros de cada lado da linha média e 1,7 milímetros ventral.Em seguida, marque a posição do corante Fast Green no tubo PE10 usando uma caneta. Em seguida, comece lentamente a penetrar a agulha através da pele e do crânio até que a ponta da agulha entre em contato com a superfície do crânio. Defina a coordenada dorsal/ventral como zero.Em seguida, abaixe a agulha lentamente até o local de destino. Uma vez na posição, aguarde um minuto para permitir que o parênquima retorne à sua forma normal. Em seguida, execute o programa de microinjeção a 100 nanolitros por minuto.Durante a injeção, observe o corante Fast Green se mover no tubo de PE. É fundamental penetrar lentamente a agulha através da pele e do crânio até que a ponta da agulha entre em contato com a superfície do crânio. Durante a injeção, é imperativo observar o corante Fast Green se mover no tubo de PE.Após a conclusão da injeção, aguarde um minuto e, em seguida, leve lentamente a agulha até 1/2 da profundidade do DV penetrado. Em seguida, espere mais 30 segundos antes de prosseguir com a retirada lenta da agulha da cabeça do filhote. Após a conclusão da injeção, é importante esperar um minuto antes de levar lentamente a agulha a 1/2 da profundidade do DV penetrado.Em seguida, espere mais 30 segundos antes de retirar lentamente a agulha da cabeça do filhote. Depois que todos os locais-alvo forem injetados, aqueça o filhote por 20 minutos em uma incubadora de 33 graus Celsius. Verifique o filhote a cada cinco minutos até que ele recupere a decúbito esternal.Em seguida, devolva o filhote à sua mãe. 200 nanolitros de vírus que expressam Cre DNA recombinase fundido com GFP foram injetados no estriado P2 de camundongos Ai14. Esses camundongos expressaram o gene repórter tdTomato após a deleção mediada por Cre de um de parada flanqueada loxP.Os cérebros foram colhidos em P14 para imunomarcação de GFP e tdTomato. Muitas células positivas para GFP transduzidas por AAV estavam presentes em todo o estriado, indicando uma extensa infecção das células estriatais pelos vírus AAV EGFP Cre. Expressão extensiva semelhante de tdTomato também foi encontrada no estriado.Após exame microscópico em alta ampliação, descobriu-se claramente que todas as células estriatais positivas para GFP co-expressam o gene repórter tdTomato. Além disso, os sinais de tdTomato foram detectados em terminais presumivelmente axônicos no globo pálido, na substância negra pars reticulata, as regiões-alvo dos neurônios de projeção estriatonigral e estriatopallidal. Juntos, esses resultados sugerem uma recombinação bem-sucedida de DNA mediada por Cre loxP induzida pela expressão mediada por AAV da atividade de Cre em neurônios estriados neonatais.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos para injeção estriatal bilateral se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que esta é uma delicada cirurgia cerebral neonatal que requer paciência e cuidado. A partir deste procedimento, outros métodos como optogenética e quimiogenética podem ser realizados a fim de analisar a maturação durante o desenvolvimento pós-natal.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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