Name: Determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo Ustilago Maydis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprenda a determinar o índice de lipídios em células de Ustilago maydis usando o ensaio de recuperação de fluorescência líquida com BODIPY 493/503. Este método de alta vazão permite analisar dinâmicas de acúmulo lipídico em diferentes condições nutricionais.

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Este trabalho foi financiado por doações Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM,) e o Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP e 256520-GGS). Fundação de Amparo a Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas do Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Nós graças a QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo para o Visão geral esquemático. Dr. Miguel Tapia Rodríguez Agradecemos a ajuda valiosa na microscopia confocal de LDs. Gostaríamos de agradecer o Dr. Bruno Bozaquel Morais por seu trabalho pioneiro no desenvolvimento da técnica em S. cerevisiae que adaptamos para U. maydis.

1. preparação de soluções e Buffers
<ol><li>Para preparar 1 L de fosfato, tampão salino (PBS, pH 7), dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4 em 800 mL de água destilada. Ajustar o pH a 7,0 com HCl e em seguida, adicione água para um volume final de 1 L. PBS pode ser feita como uma solução-mãe de 10x e armazenada à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para preparar 10 mL da solução de fixação, adicione 1 mL de formol 37% para 9 mL de PBS para atingir uma concentração final de 3,7%. Prepare esta solução imediatamente antes da utilização. Cuidado: Use luvas para manipular a solução de formaldeído.</li>
	<li>Para preparar a solução têmpera (500 mM), dissolva 8,3 g de KI em 100 mL de água destilada. Preparar esta solução antes do uso e armazená-lo em temperatura ambiente.</li>
	<li>Para preparar a solução-mãe BODIPY 10 mM, dissolvem-se 10 mg de BODIPY 493/503 em 3,8 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO). Manter 100 alíquotas µ l no escuro a-70 ° C.</li>
	<li>Para preparar a solução de BODIPY 5 µM-têmpera, adicione 1 µ l de 10mm BODIPY 493/503 para 2 mL de solução que extingue a 500 mM. Para o ensaio LFR, uma concentração final de 5 µM de BODIPY é necessária.</li>
	<li>Para preparar a solução mineral, adicione 0,06 g de H3BO3, 0,14 g de MnCl2-4 H2O, 0,4 g de ZnCl2, 0,04 g de Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g de FeCl3-6 H2O e 0,4 g de CuSO 4-5 H2O para 1 L de água destilada.</li>
	<li>Para preparar a solução de sal, adicione 16 g de KH2PO4, 4G de at2para que4, 8 g de KCl, 2 g de MgSO4, 1 g de CaCl2e 8 mL de solução mineral para 1 L de água destilada.</li>
	<li>Para preparar o meio mínimo sem uma fonte de nitrogênio para U. maydis FB2 (a2b2), adicionar 10 g de glicose e 62,5 mL de solução de sal para 1 litro de água destilada, de acordo com o Holliday, et al 31. ajustar o pH a 7,0 e então dispense 100 mL dos meios de comunicação em frascos de 250 mL e esterilizá-los. Esterilização autoclave por 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) no ciclo de líquido ou filtro.</li>
	<li>Para preparar o meio de levedura peptona dextrose (YPD), adicione 5 g de fermento extrato, 2,5 g de peptona, e 5 g de glicose para 1 L de água destilada. Dispense a 100 mL de solução em frascos de 250 mL e esterilizá-los. Esterilização autoclave por 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) no ciclo de líquido ou filtro.</li>
</ol>2. cultura do estado e fixação da pilha
Nota: Preserve a estrutura de LDs, fixando as células mais rapidamente possível. A fixação pode ser feita em tubos de microcentrifuge. Fixo de células podem ser mantidas a 4 ° C por até um mês se desidratação é evitada deixando uma fina camada de água.
<ol><li>U. maydis células sob condições de cultura cresce relevantes para o estudo. Comece a cultura com uma OD inicial600 de 0,05 (1,15 × 106 células / mL). Incube as células a 28 ° C, 180 rpm por 24 h. Uma OD600 de 1 corresponde a 2,3 × 107 células / mL.</li>
	<li>No selecionado vezes, retirar uma alíquota de células. Para U. maydis, Retire 5 mL cada 2 h durante as primeiras 8 horas. Após 8 h de crescimento, alíquotas de 2 mL são suficientes.</li>
	<li>Medir a densidade óptica em 600 nm de cada alíquota.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 14.000 x g por 1 min a 4 ° C, utilizando uma centrífuga do tabletop. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Suspenda o sedimento das células em 1 mL de tampão de 3,7% de PBS-formaldeído. Incube as células durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Após a incubação, centrifugar a suspensão de eritrócitos a 14.000 x g por 1 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Lave o pellet de células duas vezes com um volume semelhante de água destilada (1ml). Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 14.000 x g por 1 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante após cada etapa de lavagem.</li>
	<li>Ajustar o centrifugado a 5 OD600 (1,15 x 108 células / mL) com água destilada, água (equação 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq1.jpg">    Equação 1.
</li>
	<li>Manter a amostra em 4 ° C até à sua utilização.</li>
</ol>3. ensaio de recuperação de fluorescência líquido (LFR)
<ol><li>Ligar o espectrofotômetro e abra o software de Skanlt. Clique na nova sessãoe escolha Iniciar e, em seguida, Varioskan Lux. Selecione o protocolo de árvore de sessão, digite as configurações para os comprimentos de onda de fluorescência (excitação 485 nm/emissão 510 nm; densidade óptica 600 nm) e escolha ganho automático fotomultiplicador. Para largura de banda de excitação, selecione 12 nm. Na ótica, selecione superior (excitação da amostra é de cima do poço).</li>
	<li>Insira uma agitação suave e contínua (300 rpm). Selecione Executar placa para forae Pausa até que a ação do usuário (tempo utilizado para a adição da amostra aos poços). Repeti o protocolo cinco vezes. Clique em salvar e escreva um nome para a sessão sobre o Campo de nome de sessão. O protocolo está agora pronto para as análises de amostras.</li>
	<li>Adicione 200 µ l do BODIPY 5 µM - saciada solução a cada poço um 96 bem preto-desobstruídos da placa de base.</li>
	<li>Coloque a placa dentro da câmara de espectrofotômetro e incubar 5 min à 30 ° C. A partir deste ponto, protege a placa de luz, tanto quanto possível.</li>
	<li>Clique no botão Iniciar e lê a fluorescência (485 excitação/emissão 510) e o OD600 correspondentes para os espaços em branco.</li>
	<li>Adicione 5 µ l de suspensão de célula de formaldeído-corrigido nos poços durante o tempo de pausa. Misture as amostras cuidadosamente com pipeta. Colocar a placa dentro do espectrofotómetro e clique em continuar. Em seguida, as amostras serão processadas de acordo com o protocolo projetado acima.</li>
	<li>Repita três adições sucessivas de 5 µ l de suspensão de células. Certifique-se que as células não se precipitar. (Figura 1).</li>
</ol>4. os cálculos do índice de LD
<ol><li>Para cada amostra em microplate, traça a curva de fluorescência e absorvância contra o volume de cada adição sucessiva (5 pontos, incluindo o espaço em branco). Neste estudo, use o software Microsoft Excel para os cálculos. Para plotar os dados, insira o volume, fluorescência e dados de absorbância na primeira, segunda e terceira coluna da folha de dados, respectivamente. Em seguida, selecione os dados com o cursor, clique em inserir e selecione dispersão (XY).</li>
	<li>Selecione os pontos para cada linha no gráfico e insira a respectiva Linha de tendência com a caixa Mostrar equação selecionada. Anote os valores das inclinações das duas linhas retas, de acordo com a equação 2: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq2.jpg">    Equação 2 Onde y = fluorescência ou densidade óptica, x = volume de amostra (0, 5, 10, 15, 20 µ l), m = inclinação da fluorescência ou linha de densidade óptica e b = intercepção de y.</li>
	<li>Divida o declive da linha de fluorescência pelo declive da linha de densidade óptica para obter o índice de LD, equação 3. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57279/57279eq3.jpg">    Equação 3 O índice de LD corresponde ao quociente da fluorescência e densidade óptica pistas.</li>
</ol>5. análise de qualidade de dados
<ol><li>Calcular o coeficiente de correlação de cada reta: clique sobre o Assistente de função (fx) e escolha CORREL. Se r &lt; 0.9, descartar os dados e repetir as leituras. Se r ≥ 0,9, as leituras é confiável.</li>
</ol>

<ol><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+roles+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding roles for lipid droplets.</a> Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).</li>
<li>Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+neutral+lipid+synthesis+by+Yarrowia+lipolytica+on+various+carbon+substrates+under+nutrient-sufficient+and+nutrient-limited+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions.</a> Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).</li>
<li>Raimondi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+lipids+from+glycerol%3A+new+perspectives+on+biotechnological+exploitation+of+Candida+freyschussii%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii.</a> Microbial Cell Factories. 13, 83(2014).</li>
<li>Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+accumulation+in+Rhodotorula+glutinis+induced+by+nitrogen+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation.</a> Biotechnology for Biofuels. 7, 164(2014).</li>
<li>Galafassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+for+second+generation+biodiesel+by+the+oleaginous+yeast+Rhodotorula+graminis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis.</a> Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).</li>
<li>Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodotorula+glutinis-potential+source+of+lipids%2C+carotenoids%2C+and+enzymes+for+use+in+industries%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).</li>
<li>Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+by+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+using+industrial+by-products+under+different+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).</li>
<li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Lipid+Droplet+Proteome+of+the+Oleaginous+Yeast+Rhodosporidium+toruloides%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides.</a> Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).</li>
<li>Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Palmitoleic+and+Linoleic+Acid+in+Oleaginous+and+Nonoleaginous+Yeast+Biomass%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass.</a> International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).</li>
<li>Radulovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+lipid+droplets+in+yeast%3A+current+status+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches.</a> Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perilipin-Mediated+Lipid+Droplet+Formation+in+Adipocytes+Promotes+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein-1+Processing+and+Triacylglyceride+Accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation.</a> Plos One. 8 (5), e64605(2013).</li>
<li>Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).</li>
<li>Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and lipid droplets.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oily+yeasts+as+oleaginous+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oily yeasts as oleaginous cell factories.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).</li>
<li>Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+neutral+lipids%3A+synthesis%2C+storage+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).</li>
<li>Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lipid+droplet+accumulation+associated+with+a+peripheral+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy.</a> Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).</li>
<li>Filipe, A., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+and+lipid+droplets%3A+finding+a+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).</li>
<li>Greenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+droplets+in+metabolic+disease+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).</li>
<li>Aguilar, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+accumulation+and+other+biochemical+changes+induced+in+the+fungal+pathogen+Ustilago+maydis+under+nitrogen-starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation.</a> Archives of Microbiology. , (2017).</li>
<li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PLoS One. 5 (10), e13692(2010).</li>
<li>Madeira, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC1+Inhibition+Induces+Lipid+Droplet+Replenishment+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).</li>
<li>Maya-Monteiro, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+induces+macrophage+lipid+body+formation+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-+and+mammalian+target+of+rapamycin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).</li>
<li>Listenberger, L. L., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aListenberger%2C+LL+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soraphen+A%2C+an+inhibitor+of+acetyl+CoA+carboxylase+activity%2C+interferes+with+fatty+acid+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation.</a> Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924203116302995">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+spectroscopic+property+of+Bodipy+derivates+through+tuning+the+molecular+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).</li>
<li>Pagac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEIPIN+Regulates+Lipid+Droplet+Expansion+and+Adipocyte+Development+by+Modulating+the+Activity+of+Glycerol-3-phosphate+Acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase.</a> Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).</li>
<li>Qiu, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY+493%2F503+Staining+of+Neutral+Lipid+Droplets+for+Microscopy+and+Quantification+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry.</a> Bio-protocol. 6 (17), (2016).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Holliday, R. Ustilago maydis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolliday%2C+R+%22Handbook+of+genetics%22">Handbook of genetics</a>. King, R. , Plenum. New York. 575-595 (1974).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgação

LFR é um novo método que foi aplicado pela primeira vez estudar o metabolismo de lipídios em S. cerevisiae e mais tarde foi com êxito implementado em U. maydis20,21. Embora o índice de LD não dá um valor absoluto das marcas acumuladas nas células, ele fornece uma ideia rápida do conteúdo lipídico das células, e a interpretação dos dados é direta quando índice LD de duas ou mais condições experimentais são comparados. BODIPY 493/503 é altamente e...

Gotículas lipídicas (LDs) são onipresentes corpos de gordura intracelulares, compostos por um núcleo de lipídios neutros, principalmente de TAGs e ésteres de esterol (SE). O núcleo é rodeado por uma monocamada de fosfolipídios que interage com proteínas como perilipin e enzimas envolvidas na síntese de lipídios neutros, como o diacilglicerol acil-transferase, carboxilase acetil-CoA e acil-CoA sintase1. Devido a seu comportamento dinâmico, a monocamada de fosfolipídeo também contém lipases triacilglicerol que hidrolisam TAGs e SE2. Dependendo do tipo de célula e organismo, lipídios neutros armazenados podem ser usados para gerar energia, ou sintetizam fosfolipídios e moléculas sinalizadoras. Em leveduras e outros fungos, o conteúdo do LDs muda em resposta a variações na proporção de nitrogênio/carbono em meios de cultura, indicando que a disponibilidade de nitrogênio diminuída pode ser a chave para aumentar a produção de lipídios neutros3,4 ,5. A produção de grandes quantidades de TAGs em levedura tem potencial uso em biotecnologia como fonte de biocombustíveis e na indústria alimentar. Alguns lipídeos armazenados contêm altas proporções de ácidos graxos poliinsaturados, como o ômega 3 e ômega 6, com importância nutricional e dietética 6,7,8,9,10 , 11. LDs de células de mamíferos, incluindo células humanas, também contêm TAGs e ésteres de colesterol. A monocamada de fosfolipídeo interage com o homólogo de mamíferos das proteínas descrito no fermento LDs e com uma proteína adicional, perilipin, que está ausente em S. cerevisiae12. Uma proposta que papel para a monocamada de fosfolípidos e suas proteínas associadas é para estabilizar a estrutura de LDs e permitir a interação do LDs com organelas como mitocôndrias, retículo endoplasmático, peroxissomos e vacúolos, principalmente para a troca de lipídios 13,14. Curiosamente, em humanos, LDs parecem estar envolvidos em patologias como a diabetes tipo 2, aterosclerose, esteatohepatite e doença coronariana, em que há um aumento no seu número 15,16,17 . Alguns tipos de vírus usam LDs como plataformas para montar os virions 2,18,19.
Devido as implicações de LDs em patologias humanas e seu potencial uso biotecnológico, a exata determinação experimental da formação de LDs é uma tarefa importante. Este artigo descreve um ensaio confiável baseado na recuperação da fluorescência (LFR) de BODIPY 493/503 (4, 4-diflúor-1, 3, 5, 7, 8-pentametil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), para obter um valor relativo do teor de lípidos neutros nas células. Com este ensaio, é possível acompanhar a dinâmica da acumulação de lípidos neutros em fungos como U. maydis e S. cerevisiaee também em células de mamíferos, sem a necessidade de extração de lipídios 20. O método foi aplicado pela primeira vez em S. cerevisiae para identificar as fosfatases da proteína e quinases envolveram na regulação do metabolismo lipídico. Isso foi possível sem extração de lipídios ou proteínas purificação21,22. LFR também tem sido utilizada para estabelecer a dinâmica da formação de LDs em macrófagos peritoneais23. O uso de BODIPY 493/503 tem algumas vantagens sobre outros corantes de lipídios neutros como Nilo vermelho. BODIPY 493/503 é altamente específico para lípidos neutros e tem um estreito espectro de emissão, facilitando a detecção simultânea de sinais de corantes como proteína fluorescente vermelha ou Mito-tracker, quando as amostras são analisadas por microscopia confocal. Infelizmente, BODIPY 493/503 é sensível ao fotobranqueamento, mas este processo pode ser evitado usando um reagente antiquenching durante a exposição à luz24.
Para realizar o ensaio LFR em células de levedura, que são cultivadas nas condições nutricionais desejadas e alíquotas sejam revogadas em momentos diferentes. Em seguida, as células são fixadas com formol, que preserva a integridade do LDs há meses, quando as células são armazenadas a 4 ° C. Outras técnicas de fixação devem ser evitadas, especialmente aqueles que utilizam metanol ou acetona gelada, uma vez que levam à degradação do LDs dentro das células,24. Para medir o índice de LD, em células fixadas em formol são suspensas em água para obter uma concentração definida. Então, eles são adicionados a uma solução contendo o fluoróforo BODIPY 493/503 saciada por KI, e quando o fluoróforo entra na célula e o associa com o LDs, há uma recuperação de sua fluorescência. Concomitante à medição de fluorescência (485 nm/510 nm), a concentração de células é quantificada através da medição da densidade óptica em 600 nm. Cada amostra é ler quatro vezes adicionando subsequentes 5 alíquotas de µ l de uma suspensão de células de formaldeído-fixo para o mesmo bem. Espaços em branco de fluorescência e absorção são adquiridos antes da adição de células. A qualidade de fluorescência e os dados de absorbância são avaliadas determinando a linearidade das medições: se r < 0.9, dados são descartados. O valor de r é importante porque basicamente a intensidade de fluorescência deve produzir uma resposta linear ao aumento das concentrações de célula. Se a concentração de células é muito alta, a linearidade é perdida. O ensaio LFR fornece um método rápido, simples e econômico para selecionar o fenótipo desejado do LD em experimentos de alta produtividade. Depois de selecionar as condições desejadas, o conteúdo do LD de células individuais pode ser estudado pela microscopia confocal, usando as mesmas células fixadas em formaldeído manchadas com BODIPY, fornecendo uma imagem de LDs na célula. Suas TAGs e conteúdo SE podem agora mais analisados por cromatografia em camada fina.

<table><tbody><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Varioskan Lux microplaca multimodo reade</td><td>D5879</td><td>Filtro 493/503 ou detector monocromador</td></tr><tr><td>Placa costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3615</td><td>96 poços de parede preta/fundo transparente</td></tr><tr><td>Placa costar</td><td>Corning Inc</td><td>3598</td><td>96 poços placa de cultura de células costar</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen/ Thermofisher</td><td>D3922</td><td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno</td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549</td><td>reagente ACS, 37% em peso em H2O, contém 10-15% de metanol para evitar a polimerização</td></tr><tr><td>Iodeto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60399</td><td>BioUltra, &ge; 99,5% (AT)</td></tr><tr><td>FB2 Ustilago maydis</td><td>ATCC</td><td>201384</td><td>Basidiomiceto-Levedura</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746398</td><td>Reagente ACS, sal inorgânico</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td>Reagente ACS</td></tr><tr><td>Selecione o extrato de levedura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y100</td><td>Mistura de amini ácidos, peptídeos, solúveis em água, vitaminas e carboidratos para meios de cultura</td></tr><tr><td>N-Z case plus</td><td>Sigma aldrich</td><td>N4642</td><td>Caseína enzimática hidrolisado de leite</td></tr> bovino <tr><td>Glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-8270</td><td>D (+) glicose</td></tr><tr><td>Skaker frasco</td><td>Pirex</td><td>CLS4450250-6EA</td><td>Vidro borosiicado</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>SEV M&eacute; xico</td><td>INO650V-7</td><td>Agitador orbital</td></tr><tr><td>Mesa centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415C</td><td>Microtubos de centrífuga</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606340</td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Axygen scientific</td><td>T-200-Y</td><td>Pontas de pipeta universais com extremidade chanfrada, 200 microlitros, pipeta mLine não estéril</td></tr><tr><td></td><td>Biohit</td><td>725130</td><td>8 canais, faixa de volume 5-100 uL</td></tr></tbody></table>

determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo ustilago maydis

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

O artigo mostra como implementar o ensaio de índice de LD, que é um ensaio sensível microplacas para determinar o acúmulo de triglicérides (TAGs) em gotículas lipídicas (LDs). Índice de LD é obtido sem extração de lipídios. Permite medir o teor de LDs em experimentos de alta produtividade em condições diferentes, tais como o crescimento em ricos ou mídia de nitrogênio empobrecido. Embora o método foi descrito pela primeira vez estudar o metabolismo de gotículas lipídicas em Saccharomyces cerevisiae, foi aplicado com sucesso para o basidiomiceto Ustilago maydis. Curiosamente, e porque LDs são organelas filogeneticamente conservadas em células eucarióticas, o método pode ser aplicado a uma grande variedade de células, do fermento para células de mamíferos. O índice de LD baseia o ensaio de recuperação de líquidos de fluorescência (LFR) de BODIPY 493/503, sob condições de resfriamento, pela adição de células fixadas com formol. Iodo de potássio é usado como um quencher da fluorescência. A relação entre a fluorescência e pistas de densidade óptica é chamada índice de LD. Pistas são calculadas a partir de linhas retas obtidas quando BODIPY fluorescência e densidade óptica em 600 nm (OD600) são plotados contra adição de amostra. Qualidade de dados ideal é refletida por coeficientes de correlação iguais ou acima de 0,9 (r ≥ 0,9). Múltiplas amostras podem ser lidos simultaneamente, como pode ser implementada em uma microplaca. Desde BODIPY 493/503 é um lipofílico fluorescente tintura que partições para as gotículas lipídicas, pode ser usada em muitos tipos de células que se acumulam LDs.

LFR, com BODIPY 493/503 como sonda fluorescente é um método confiável e fácil para estudar a dinâmica acumulação de LDs em U. maydis, independentemente das condições de crescimento. Quando as células foram cultivadas em meio YPD, houve um aumento no índice de LD durante a fase exponencial, seguido por um declínio na fase estacionária (Figura 2A). Em contraste, em células cultivadas em fome de nitrogênio, houve um aumento constante no índice LD em amb...

Aqui, descrevemos um protocolo para obter o índice de gotículas lipídicas (índice de LD) para estudar a dinâmica de triglicérides nas células cultivadas em experimentos de alta produtividade. O ensaio de índice de LD é um método fácil e confiável que usa BODIPY 493/503. Este ensaio não precisa de extração de lipídios dispendious ou análise de microscopia.

Determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo Ustilago Maydis

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar o Índice de Gotículas Lipídicas de células cultivadas sob diferentes condições nutricionais. Este método pode ajudar a responder questões-chave no Campo de Gotículas Lipídicas e Lipídios, como a dinâmica de acúmulo e as diferentes condições nutricionais. A principal vantagem dessa técnica é que várias amostras podem ser lidas simultaneamente, pois pode ser implementada na microplaca.Com o início deste método, quando observamos a refratância de células de Ustilago maydis cultivadas sob falta de nitrogênio e então percebemos que isso pode significar que esses instrutores podem ser gotículas lipídicas. Então, entramos em contato com Monica Montero, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, no Brasil, que implementou o Ensaio de Recuperação de Florescência Líquida de gotículas lipídicas em Saccharomyces cerevisiae para iniciar uma colaboração para adaptar o procedimento para Ustilago maydis. O primeiro passo neste protocolo é a preparação dos buffers e soluções necessários.Para preparar uma solução estoque de BO-DP a 10 milimolares, dissolva 10 miligramas de BO-DP 493-503 e 3,8 mililitros de sulfóxido de dimetila. Divida em alíquotas de

lipid-index-determination-liquid-fluorescence-recovery-fungal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Descrevemos um novo método lipidomics quantitativos para identificação de espécies de lipídios numerosos em levedura utilizando pesquisa scan-espectrometria de massa de ionização electrospray (ESI / MS). Este método ultrapassa atualmente os métodos disponíveis para identificação e quantificação de lipídios na capacidade de resolver diversas formas moleculares de lipídeos, sensibilidade e velocidade.

A avaliação quantitativa do Lipidome fermento usando Electrospray Espectrometria de Massa de Ionização

Nós introduzimos um ensaio de fluorescência baseada rápido que monitora a taxa de extinção de fluorescência como uma medida da atividade do canal gramicidin. Os canais gramicidin são usados ​​como transdutores de força molecular para monitorar as mudanças nas propriedades bicamada lipídica como sentiu por proteínas bicamada de expansão.

Gramicidina baseado em Ensaio de fluorescência; para determinar Moléculas Pequenas Potencial para Modificação de Propriedades bicamada lipídica

A devastação das culturas de cereais por fungos que infectam sementes de suscitou numerosos esforços de pesquisa para entender melhor planta-patógeno interações. Para estudar sementes de fungos interações em um ambiente de laboratório, nós desenvolvemos um método robusto para a quantificação de reprodução dos fungos, biomassa e contaminação por micotoxinas utilizando bioensaios de kernel.

Quantificação da colonização fúngica, esporogênese, e produção de micotoxinas Utilizando Bioensaios Kernel

Um protocolo simples para determinar o teor de lípidos neutros de células de algas com um procedimento de coloração com Vermelho do Nilo é descrito. Esta técnica de poupança de tempo, oferece uma alternativa aos protocolos de quantificação de lípidos tradicionais à base gravimétrica. Ele foi projetado para a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos.

Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência

O artigo descreve um método que aumenta o rendimento enquanto equilibra esforço e precisão para a extração de lipídios das membranas celulares de microorganismos para uso na caracterização de lipídios totais e abundância relativa de lípidos indicadores para determinar a estrutura da comunidade microbiana do solo em estudos com muitas amostras.

Um método de extração e análise de lipídios para caracterizar micróbios de solo em experimentos com muitas amostras

Aqui, apresentamos uma implementação de MATLAB de detecção automatizada e descrição quantitativa de gotas lipídicas em imagens de microscopia de fluorescência de fissão e brotamento de células de levedura.

Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

Este protocolo descreve a fabricação de lipossomas e como estes podem ser imobilizados em uma superfície e imagemindividualmente de uma forma paralela maciça usando microscopia de fluorescência. Isso permite a quantificação do tamanho e inhomogeneidade composicional entre os lipossomos únicos da população.

Um ensaio de liposcopia única baseado em microscopia quantitativa para detectar a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Apresentamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida para capturar imagens, analisar e quantificar a cinética de crescimento do fungo filamentoso A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida. Este protocolo pode ser usado em conjunto com microscopia de fluorescência.

Análise quantitativa da taxa de crescimento de nidulans aspergillus usando microscopia ao vivo e software de código aberto

Este protocolo descreve um modelo de acúmulo de lipofuscina em culturas altamente diferenciadas e polarizadas do epitélio pigmentado da retina humana (EPR) e um ensaio melhorado de fagocitose do segmento externo (EO) para detectar o consumo/capacidade de degradação total do EPR. Esses métodos superam as limitações de modelos anteriores de lipofuscina e ensaios clássicos de fagocitose do segmento externo de perseguição de pulso.

Modelos aprimorados de lipofuscina e quantificação da capacidade de fagocitose do segmento externo em culturas epiteliais pigmentares da retina humana altamente polarizadas

Aprenda a determinar o índice de lipídios em células de Ustilago maydis usando o ensaio de recuperação de fluorescência líquida com BODIPY 493/503. Este método de alta vazão permite analisar dinâmicas de acúmulo lipídico em diferentes condições nutricionais.

Determinação de índice de lipídios pela recuperação de fluorescência líquido no patógeno fungo Ustilago Maydis

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