Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

O objetivo geral deste protocolo é isolar linfócitos de locais indutivos intestinais, incluindo placas de Peyer e linfonodos mesentéricos e locais efetores, incluindo lâmina própria e epitélio. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia da mucosa, como entender as respostas imunes a infecções gastrointestinais, cânceres e doenças inflamatórias. A principal vantagem dessa técnica é que ela garante o isolamento de linfócitos altamente purificados e viáveis de compartimentos distintos do intestino delgado com contaminação intercompartimental mínima.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é um desafio identificar e isolar os gânglios linfáticos do mesentério e as placas de Peyer e equilibrar velocidade e precisão para obter rendimentos ideais. Para iniciar o protocolo, coloque um camundongo previamente anestesiado de costas e borrife-o com etanol a 70%. Use uma tesoura para fazer uma incisão na linha média e abra a pele e a parede abdominal para expor a cavidade peritoneal.

Em seguida, localize o ceco e use uma pinça para puxar suavemente o ceco para baixo. Use uma pinça para mover cuidadosamente o intestino delgado para a direita, expondo todos os linfonodos mesentéricos ou a cadeia MLN que está alinhada com o cólon. Identifique o nó inferior na cadeia localizado mais próximo do ceco.

Use um conjunto de pinças para agarrar a gordura do mesentério ao seu redor e mova suavemente a cadeia MLN de baixo para cima, pinçando a gordura ao redor do linfonodo com outro conjunto de pinças. Em seguida, umedeça uma toalha com mídia de colheita e coloque a corrente MLN na toalha de papel. Remova a gordura do mesentério enrolando a corrente na toalha de papel e puxando a gordura com dois conjuntos de pinças.

Coloque o MLN em meio de colheita a frio para etapas posteriores de isolamento. Com uma tesoura, corte o intestino delgado abaixo do esfíncter pilórico e acima do ceco. Puxe o intestino lentamente do íleo para o duodeno usando um conjunto de pinças enquanto remove a gordura do mesentério anexada usando outro conjunto de pinças.

Coloque o intestino em uma toalha de papel umedecida com meio de colheita e retire qualquer gordura restante do mesentério com dois conjuntos de pinças. Mantenha o intestino umedecido durante essas etapas aplicando o meio de colheita periodicamente. Colete os adesivos de Peyer removendo-os do intestino com uma tesoura curva.

Colete 5-11 manchas de Peyer do intestino delgado. Coloque os adesivos de Peyer em meios de colheita frios para etapas posteriores de isolamento. Use o lado plano da pinça e deslize suavemente do duodeno em direção ao íleo para expelir o conteúdo fecal e o muco.

Repita esta etapa uma vez para remover a maior parte do muco. Use uma tesoura fina com uma ponta romba em uma ponta, insira a ponta romba no intestino e corte o intestino longitudinalmente do duodeno ao íleo. Corte lateralmente o intestino aberto em pedaços de dois centímetros.

Coloque os pedaços intestinais em um tubo cônico de 50 mililitros com 25 mililitros de meio de colheita a frio para etapas posteriores de isolamento. Isole os linfócitos do MLN dissociando-os suavemente por meio de um filtro de células de 70 micrômetros usando o êmbolo de uma seringa de três mililitros. Lave o filtro de células com cinco mililitros de meio de colheita frio.

Pulverize as células MLN centrifugando-as a 400 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de meio de colheita a frio. Lave os pedaços de intestino delgado três vezes com 25 mililitros de meio de colheita frio, invertendo o tubo 10 vezes.

Deixe os pedaços intestinais assentarem e despeje o sobrenadante. Em seguida, adicione 20 mililitros de ditioeritritol pré-aquecido ou solução DTE ao tubo cônico de 50 mililitros contendo pedaços intestinais e transfira o conteúdo para um frasco Erlenmeyer siliconizado de 50 mililitros com uma barra de agitação. Use um grande ímã na parte externa do frasco para segurar a barra de agitação e transfira o tecido e a solução de volta para o tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, bata o tubo na configuração máxima por 10 segundos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo cônico de 50 mililitros através de um filtro de células de 70 micrômetros, tendo o cuidado de manter os pedaços de tecido no tubo original. Pellet as células.

Ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio de colheita a frio e armazene no gelo. Adicione 20 mililitros de solução DTE pré-aquecida ao tubo cônico de 50 mililitros contendo pedaços de intestino e transfira de volta para o frasco de Erlenmeyer siliconizado de 50 mililitros contendo uma barra de agitação. Use um grande ímã na parte externa do frasco para segurar a barra de agitação e transfira o tecido e a solução de volta para o tubo cônico de 50 mililitros.

Vortex o tubo na configuração máxima por 10 segundos. Transferir o sobrenadante através de um filtro de células de 70 micrómetros para o tubo que contém as células do sobrenadante do primeiro tratamento DTE e centrifugar as células. Ressuspenda o pellet celular em oito mililitros de gradiente de densidade a 44% ou solução DG à temperatura ambiente.

Transfira a solução de oito litros de DG a 44% e a suspensão celular para um tubo inferior redondo de polipropileno de 17 milímetros por 100 milímetros e 14 mililitros. Cubra as células com cinco mililitros de solução de RT 67%DG. Centrifugue a 1.600 vezes a gravidade por 25 minutos em RT sem usar o freio.

As células viáveis formam um revestimento leucocitário na interface de 44% e 67%. Remova a camada de gordura por aspiração a vácuo. Use uma pipeta Pasteur para colher o buffy coat na interface e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 40 mililitros de meio de colheita a frio.

Células de pellets centrifugando a 400 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius e ressuspendem o pellet de célula em um meio de colheita a frio de um mililitro. Remova as células epiteliais dos pedaços de tecido intestinal adicionando 25 mililitros de solução de EDTA pré-aquecida aos pedaços intestinais restantes e transfira o conteúdo para um frasco de Erlenmeyer siliconizado de 50 mililitros com uma barra de agitação e mexa. Segurar o agitador e rejeitar cuidadosamente o sobrenadante, mantendo os pedaços intestinais no balão.

Repita a etapa de remoção de células epiteliais mais uma vez. Em seguida, adicione 50 mililitros de meio de colheita em temperatura ambiente e mexa o conteúdo brevemente com um ímã. Em seguida, deixe os pedaços intestinais assentarem e descarte cuidadosamente o sobrenadante.

Adicione 30 mililitros de solução de colagenase pré-aquecida e mexa os pedaços intestinais. Depois de agitar, transfira o tecido digerido e o sobrenadante para um tubo cônico de 50 mililitros através de um filtro de células de 70 micrômetros. Dissocie suavemente os pedaços de tecido restantes usando o êmbolo de uma seringa de três mililitros para triturar o filtro.

Lave o filtro com 10 mililitros de meio de colheita a frio e peletize as células. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em oito mililitros de solução de 44% DG em temperatura ambiente. Transfira os oito mililitros de suspensão de célula de solução 44% DG para um novo tubo inferior redondo de polipropileno de 70 milímetros por 100 milímetros.

Underlay com cinco mililitros de solução de 67% DG em temperatura ambiente e centrifugue os gradientes. Remova a camada de gordura por aspiração a vácuo. Use uma pipeta Pasteur para colher o buffy coat na interface e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 40 mililitros de meio de colheita a frio.

Finalmente, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de meio de colheita a frio. Cada compartimento imunológico intestinal é caracterizado por uma composição única de subconjuntos de linfócitos. O MLN é predominantemente composto de células T alfa beta, enquanto os linfócitos PP são principalmente células B.

A composição de linfócitos LP é composta principalmente de células T alfa beta e células B. IEL são principalmente células T gama delta e células T alfa beta essencialmente sem células B. As células T alfa beta CD8 positivas dentro dos compartimentos LP e IEL expressaram o homodímero alfa CD8 ou o heterodímero alfa beta CD8, enquanto as células T alfa beta CD8 positivas no local indutivo expressaram predominantemente o heterodímero alfa beta CD8.

A maioria das células T gama delta no compartimento IEL expressou CD8 alfa, enquanto as células T gama delta encontradas no MLN não possuem CD8 alfa. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de gastar tempo e cuidado suficientes durante as etapas de isolamento do tecido para limitar a contaminação entre os compartimentos intestinais. Após este procedimento, os linfócitos isolados podem ser submetidos a estimulação ex vivo, citometria de fluxo e outras técnicas para posterior análise fenotípica e funcional.