Name: Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a preparar cirurgicamente a glândula salivar submandibular murina para microscopia intravital vertical. Este protocolo permite visualizar processos celulares em tempo real em imunologia e biologia glandular.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional Suíço (SNF) projeto concessão 31003A_135649, 31003A_153457 e 31003A_172994 (para joint ventures) e Leopoldina companheirismo semi-submersíveis 2011-16 (a BS). Este trabalho beneficiado ópticas configurações do "Microscopia Imaging Center" (MIC) da Universidade de Berna.

Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comité Cantonal de Experimentação Animal e realizado de acordo com as diretrizes federais.
1. anestesiar o Mouse
<ol><li>Utilize equipamento de protecção pessoal, incluindo luvas e jaleco.</li>
	<li>Misture cetamina, xilazina e soro fisiológico para um trabalho de concentração de 20 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente. Injetar o estoque de trabalho intraperitonealmente (i.p.) em 8-10 µ l/g de rato. Coloque o mouse volta para a jaula. Nota: Este protocolo foi testado para 6 a 40-semanas os ratos masculinos e femininos com um fundo C57BL/6.</li>
	<li>Preparar a solução de acepromazina a 2,5 mg/mL e 30 µ l i.p., 15 min após a injeção de xilazina-cetamina (75 µ g/mouse) de injetar.</li>
	<li>Depois de 5-15 min, verifique adequada anestesia e analgesia, controlando para reflexos, por exemplo, reflexo de retirada da pata ou reflexo corneal.</li>
	<li>Controle de reflexos aproximadamente cada 30 minutos durante toda a duração do experimento. Injectar por via subcutânea xilazina/cetamina em 1,5 µ l/g de rato, cada 60 min ou anterior se reflexos são positivos. Nota: A anestesia por inalação como o isoflurano não pode ser usada com este protocolo, devido a fixação do mouse.</li>
</ol>2. Retire a pele da área operacional
<ol><li>Use um barbeador elétrico para depilar uma área que se expande cerca de 5mm de caudal da boca em direção as pernas dianteiras, estendendo-se sobre as maxilas para ambos os ouvidos.</li>
	<li>Aplique creme depilatório na área depilada com um cotonete. Com cuidado e completamente remova após 3 min, por exemplo, limpando com tecidos húmidos.</li>
</ol>3. fixe o Mouse no palco
Nota: Este protocolo usa um palco personalizado (Figura 1), equipado com dois suportes livremente ajustáveis para lamínulas (um anexado ao palco com um parafuso, o outro fixado permanentemente); barras de orelha estereotáxica ajustável; uma sequência de caracteres, que pode ser apertada com um parafuso; um metal livremente ajustável aquecimento anel; e uma área levantada designada para colocar o torso do mouse. Nesta fase é modificada de uma fase de linfonodo poplíteo, com um titular estereotáxico adicionado e um suporte para o deslizamento da tampa inferior segurando a exteriorização SMG. Planos detalhados ou citações do palco estão disponíveis mediante pedido.
<ol><li>Prepare o palco, removendo os suportes para o anel de aquecimento e o titular do deslizamento da tampa removível. Desaperte os parafusos de titulares de bar a orelha e o titular do deslizamento da tampa fixa. Grave um pedaço de gaze na área central do palco, servindo como fundamento para o mouse.</li>
	<li>Usar cola (consulte a Tabela de materiais) para anexar um vidro de tampa do diâmetro de 20 mm para o topo de um suporte de metal cilíndrico (este será o vidro tampa inferior). Cola um vidro de tampa de 25 mm para o fundo do porta metálica plana (este será o vidro de tampa superior). Certifique-se que os óculos de cobertura se sobrepõem a aproximadamente 2-3 mm, com suportes de metal e que o resto do vidro permanece livre de graxa e cola.</li>
	<li>Posicione o mouse na suas costas sobre a gaze, perpendicular a corda esticada, com a cabeça centrada entre as barras de orelha.</li>
	<li>Fixe as extremidades superiores do mouse para o palco com esparadrapo.</li>
	<li>Em seguida, ligar a sequência de caracteres para os incisivos superiores da frente e apertar até que o queixo se encontre em posição horizontal. Use uma pinça curva angulada para puxar ligeiramente a língua da boca, que facilita a respiração.</li>
	<li>Firmemente, mas não com força, puxar o rabo e fita-lo para o palco.</li>
	<li>Alinhe as barras de orelha para alcançar um ângulo de aproximadamente 30° entre o bar e a beira do palco. Para garantir este ângulo, use uma régua de triângulo para desenhar um ângulo de 30° de direita e esquerda em uma folha de papel e coloque o palco transparente no papel para alinhar os suportes em conformidade.</li>
	<li>Corrigir o queixo entre as barras de orelha movendo simultaneamente a barra esquerda e direita para dentro até que a mandíbula é fixa e aperte os parafusos. Observe o movimento do peito antes, durante e após a fixação da mandíbula. Reduzida ou ausente respiração indica que as barras são fixas no pescoço, não o osso da mandíbula; Neste caso, repita o procedimento de fixação imediatamente.</li>
	<li>Fornece o aquecimento para o mouse, por exemplo, colocando uma lâmpada de aquecimento nas proximidades e/ou uma almofada de aquecimento por baixo do palco.</li>
</ol>4. exposição cirúrgica da glândula salivar usando um estereomicroscópio
Nota: As etapas a seguir requerem o uso de um microscópio estereoscópico, pinça fina e tesoura cirúrgica. Desde que o procedimento é terminal, não é necessário manter condições de funcionamento estéril. Instrumentos de etanol-limpo é suficiente.
<ol><li>Localize a posição aproximada do lóbulo direito SMG à procura de uma ligeira protuberância na pele aproximadamente 15mm de caudal da boca e medial de 5 mm da linha da mandíbula. Levantar uma prega de pele pequena no centro da protuberância e cortá-lo a criar e abertura de aproximadamente 5 mm de comprimento.</li>
	<li>Aplique imediatamente um anel de 4 mm de altura de vácuo graxa sobre a pele ao redor do corte. (Use uma seringa cheia de graxa vácuo com agulha hipodérmica 25g cega).</li>
	<li>Encha o anel de gordura com solução salina para garantir que o tecido úmido durante a operação.</li>
	<li>Sob o microscópio estereoscópico, perturbar o tecido conjuntivo, usando o seguinte procedimento: usar uma pinça fina para Segure firmemente um pedaço de tecido conjuntivo anexado diretamente para a SMG e usar uma segunda pinça para puxar o tecido conjuntivo distal até que rompe. Certifique-se de que algum tecido conjuntivo permanece anexado para o SMG; Isto é desejável, uma vez que permite a manipulação. Não toque a glândula em si com a pinça, pois isto causará sangramento.</li>
	<li>Repita este movimento de perturbar o tecido conjuntivo primeiro em cima da glândula e, em seguida, no lado medial (entre o lobo direito e esquerdo da SMG). Não separe o sublingual da glândula submandibular.</li>
	<li>Continue a remover o tecido conjuntivo lateral no sentido anti-horário em torno do SMG (medial ao caudal, para distal, para rostral).</li>
	<li>Certifique-se de que o fornecimento de sangue, vasos linfáticos eferentes e ducto salivar, que estão localizados em um pacote no site craniano da glândula, não são rompidas.</li>
	<li>Uma vez que a lateral do tecido conjuntivo é interrompido, use pinça para puxar o tecido conjuntivo anexado à extremidade caudal do SMG para cima para levantar a extremidade caudal do SMG. Perturbar o tecido conjuntivo abaixo do lóbulo SMG, a partir do caudal e se movendo em direção a extremidade rostral.</li>
	<li>Continue até o tecido conjuntivo para todos os sites da SMG é removido (excluindo o site rostral com alimentação/drenagem vasos sanguíneos e o WD).</li>
</ol>5. fixação da glândula
<ol><li>Confirme se o anel de graxa segurando o soro fisiológico é pelo menos 4 mm alto e não vazar (consulte a etapa 4.2).</li>
	<li>Instalar a tampa inferior de vidro (ver passo 3.2), colocando a barra de metal seu suporte regulável em altura. Certifique-se que o titular de lamínula é ajustado para a posição máxima e não toca o anel de graxa quando anexado ao palco. Posicione o titular da direção caudal em um ângulo de aproximadamente 60° para o mouse, com lamínula cobrindo cerca de dois terços (partes distais e caudais) do exposto lobo. Abaixe o tampa de vidro até que ele entra em contato com a glândula.</li>
	<li>Complete o anel de graxa por cima do vidro de tampa para formar um novo reservatório de solução salino.</li>
	<li>Puxe cuidadosamente o lóbulo SMG em cima a lamínula com pinça, somente tocando o tecido conjuntivo anexado a ele (o órgão pode ser invertido com o site de baixo para cima).</li>
	<li>Certifique-se que o anel de graxa tem uma altura de até mesmo de pelo menos 4 mm e não vaza. Se necessário, reabastecer o reservatório salino usando um 30 G seringa preenchida com solução salina.</li>
	<li>Verifique se o suporte de vidro de tampa para o vidro de tampa superior está na posição máxima. Use o parafuso para fixar o suporte de metal com vidro de tampa superior a 25 mm para o titular. Use os parafusos ajustáveis do titular para posicionar o tampa de vidro para que o SMG é centralizado no meio.</li>
	<li>Utilize os parafusos de suporte ajustável para abaixar o vidro de tampa superior até que contacta directamente o SMG. Observe a forma e a coloração da glândula durante esta etapa. Se a área de superfície da glândula parece maior, ou a coloração muda (por exemplo, do rosa ao branco), imediatamente coloque o tampa de vidro para uma posição mais elevada para aliviar a pressão sobre o SMG.</li>
	<li>Verifique se o reservatório de solução salino para vazamentos à procura de bolhas de ar e/ou gotas de solução salina fora do reservatório. Se for detectada um vazamento ou ar bolha, remover lamínulas e todos Unte e reiniciar a partir do passo 2.</li>
	<li>Parafuso fecha todos os parafusos de fixação.</li>
</ol>6. fixar o anel de aquecimento e sonda de temperatura
<ol><li>Inserir uma sonda de temperatura no reservatório e posicioná-lo perto da glândula e, em seguida, o fio da sonda para a fase de fita.</li>
	<li>Aplica um anel de graxa para o deslizamento da tampa superior, com a SMG no centro (o diâmetro do anel de gordura deve corresponder ao diâmetro do anel de aquecimento). Posicione o anel de aquecimento em cima do deslizamento da tampa e lacre com graxa. Fita a tubagem do anel de aquecimento para o palco.</li>
</ol>7. imagem latente
Nota: Nós usamos um sistema vertical de dois fotões de microscópio equipado com um Laser sintonizável de Ti:Sa e um microscópio fluorescente com objectivos de imersão água 20 X ou 25 X. Tempo real correção da deriva de tecido durante a aquisição pode ser implementada usando uma fase automatizada e VivoFollow19. Isto melhora a estabilidade de aquisição de imagem, mas não é necessário.
<ol><li>Ligue o sistema de microscopia vertical usando um software apropriado fornecido pelo fabricante do microscópio. Ajuste o Laser Ti:Sa para um comprimento de onda de excitação do 780-900 nm.</li>
	<li>Conecte o tubo de aquecimento para o anel de aquecimento. Uma bomba peristáltica água circula água quente (aquecida submergindo parte do tubo em um banho de água a 80° C) através do anel para aquecer o SMG.</li>
	<li>Conecte a sonda de temperatura com um termómetro digital. Ajustar a velocidade da bomba peristáltica, se a temperatura for não entre 35-39 ° C. Quanto mais rápido a bomba funciona, mais quente o objeto fica e vice-versa.</li>
	<li>Antes de iniciar a aquisição de imagens, execute um controle visual das velocidades de fluxo do sangue. Verifique cuidadosamente a passagem dos leucócitos através dos capilares finos ou por injeção de dextrano fluorescente. Nota: Dextran fluorescente injetado por via intravenosa imediatamente preencherá vasculatura SMG inteira quando o fluxo sanguíneo é fisiológico. Quase sempre é o caso neste procedimento.</li>
	<li>Seguir as células imunes, profundidade de imagem é tipicamente entre 20-150 µm na superfície da SMG identificado pelo sinal harmônico geração 2nd . Pilhas de gravar imagem de 150-300 µm campo de visão com uma resolução de pixels de aproximadamente 512 x 512 ou superior e z-profundidade de 20-60 µm com espaçamento de 2-4 µm entre imagens. Repita a aquisição de pilha cada 20-30 s para uma duração total de 20-60 min.</li>
	<li>Use o termómetro digital para controlar os níveis de temperatura mínima e máxima após a aquisição da imagem de uma sequência. Descartar a sequência de imagens se o mínimo ou máximo não está na faixa de 37 ± 2 ° C. A pegar água para imersão de objetivo entre sequências de imagem.</li>
	<li>No final da sessão de imagens, eutanásia os ratos por asfixia de CO2 sob anestesia. Nota: Isto é de acordo com orientações federais suíços de experimentação animal; outras orientações para eutanásia podem aplicar em outro lugar.</li>
</ol>

<ol><li>Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPakurar%2C+AS+%22Digital+Histology%22">Digital Histology</a>. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. 101-121 (2005).</li>
<li>Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarpenter%2C+G+%22Food+Oral+Processing%22">Food Oral Processing</a>. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 45-60 (2012).</li>
<li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).</li>
<li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands.</a> Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).</li>
<li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).</li>
<li>Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+CD66a+and+CD117+in+the+mouse+submandibular+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland.</a> Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).</li>
<li>Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+podoplanin+in+the+mouse+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of podoplanin in the mouse salivary glands.</a> Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).</li>
<li>Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+salivary+gland+function+by+autonomic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Auton+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of salivary gland function by autonomic nerves.</a> Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).</li>
<li>Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Dendritic+Cells+in+Normal+Human+Salivary+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands.</a> Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).</li>
<li>Hofmann, M., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+promotes+accumulation+of+a+unique+memory+CD8+T-cell+population+in+murine+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).</li>
<li>Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+tertiary+lymphoid+structures%2C+autoimmunity%2C+and+exocrine+dysfunction+in+a+novel+model+of+salivary+gland+inflammation+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).</li>
<li>Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+activation+of+the+RANK+signaling+receptor+induces+murine+salivary+gland+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128467(2015).</li>
<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+A+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).</li>
<li>Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22992750">Intravital microscopy.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+Multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/ol/abstract.cfm?uri=ol-28-12-1022">Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier.</a> Opt Lett. 28 (12), 1022(2003).</li>
<li>Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+3D+in+vivo+intravital+microscopy+images+with+an+iteratively+refined+soft-tissue+model+for+immunology+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments.</a> Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).</li>
<li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).</li>
<li>Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cervical+spinal+cord+window+preparation+allows+for+two-photon+imaging+of+T-Cell+interactions+with+the+cervical+spinal+cord+microvasculature+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Front Immunol. 8, 406(2017).</li>
<li>Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), e52607(2015).</li>
<li>Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+CD4+T+cell+interstitial+migration+in+the+inflamed+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis.</a> J Vis Exp. (109), e53585(2016).</li>
<li>Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).</li>
<li>Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+the+mouse+popliteal+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.</a> J Vis Exp. (60), e3720(2012).</li>
<li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium%3A+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).</li>
<li>Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+imaging+subcellular+structures+in+live+mice+expressing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins.</a> J Vis Exp. (79), e50558(2013).</li>
<li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
<li>Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+actions+of+distinct+nonmuscle+myosin+II+isoforms+drive+intracellular+membrane+remodeling+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals.</a> J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).</li>
<li>Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannulation+of+the+mouse+submandibular+salivary+gland+via+the+Wharton%27s+duct%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct.</a> J Vis Exp. (51), e3074(2011).</li>
<li>Chen, G. Y., Nuñez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+Sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage.</a> Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).</li>
<li>McLaren, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1113/expphysiol.1961.sp001513/full">Some causes of variation of body temperature in mice.</a> Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).</li>
<li>Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+metabolic+effects+of+hypothermia+and+inhaled+hydrogen+sulfide+in+anesthetized+and+ventilated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice.</a> Crit Care Med. 38 (2), Accessed November 21, 2017 
 <a target="_blank" href=" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069"> http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20095069</a> 588-595 (2010).</li>
<li>Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+area+of+the+murine+aorta+linearly+increases+with+increasing+core+body+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Hyperth%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature.</a> Int J Hyperth. , 1-13 (2017).</li>
<li>Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+CMV+infection+induces+the+continuous+production+of+mucosal+resident+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells.</a> Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).</li>
<li>Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).</li>
<li>Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+interactive+two-photon+photoconversion+of+recirculating+lymphocytes+for+discontinuous+cell+tracking+in+live+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice.</a> J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).</li>
<li>Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).</li>
<li>Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li>
<li>Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+modulation+of+femtosecond+laser+pulses+in+the+megahertz+range+for+frequency-multiplexed+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging.</a> Opt Express. 25 (8), 9435(2017).</li>
<li>Potma, E. O., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jrs.1045/abstract">Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo oferece uma abordagem simples para a imagem latente na vivo de murino glândulas salivares submandibulares e sublingual usando microscopia não-linear vertical, muitas vezes usada no campo da imunologia. O método pode ser adaptado para o tratamento de imagens de outras glândulas exócrinas na região da cabeça e pescoço. Por exemplo, nosso laboratório tem realizado de imagem da glândula lacrimal de forma análoga (não mostrada).
Remover o tecido conectivo ao redor a SMG é a ...

Saliva é secretada pelas glândulas exócrinas para lubrificar o alimento, proteger as superfícies mucosas do trato oral e entregar as enzimas digestivas, bem como substâncias antimicrobianas1,2. Além de glândulas salivares menores intercaladas na submucosa oral, existem três conjuntos bilaterais das glândulas maiores identificados como parótida, sublingual e submandibular, de acordo com sua localização1,2. Células epiteliais em forma de pirâmide, organizados em sacos em forma de balão (ácinos) ou demilunes que são circundadas por células mioepiteliais e uma membrana basal, secretam os componentes seroso e mucosos de saliva1. O estreito espaço luminal dos ácinos drenos para dutos intercalados, que se unem para dutos estriados até que eles finalmente se juntam em um único Ducto excretor1. O Ducto excretor principal da SMG é chamado ducto de Wharton (WD) e abre para a carúncula sublingual3,4. O compartimento de epiteliais SMG representa, portanto, uma estrutura altamente arborized com múltiplos pontos de extremidade do terminais, assemelhando-se a um pacote de uvas1,5,6. O interstício SMG é composto de vasos sanguínea e linfática, incorporados no tecido conjuntivo7 que contém nervos parassimpáticos8 e matriz extracelular5. Glândulas salivares normais de humanas e roedores também contêm células T, macrófagos e células dendríticas9, bem como plasmócitos que secretam a imunoglobulina A (IgA) na saliva9,10. Devido a suas funções multifacetadas na saúde e na doença, a SMG é um assunto de interesse para muitos campos de pesquisa biológica, incluindo Odontologia4Imunologia11, oncologia12, fisiologia8e biologia celular 3.
Imagem de interações e processos celulares dinâmicos é uma ferramenta poderosa em pesquisas biológicas13,14. O desenvolvimento do tecido profundo imaging e inovações inmicroscopes baseado em óptica não-linear (NLO), que contam com dispersão ou absorção de múltiplos fótons pela amostra, permitiu-se diretamente, examinar processos celulares em tecidos complexos13 ,15. Absorção de múltiplos fótons envolve a entrega da energia total excitação por fótons de baixa energia, que excitação de fluoróforo limites para o plano focal e, portanto, permite a penetração mais profunda do tecido com Fotodano reduzido e ruído fora do foco excitação de13,15. Este princípio é empregado pela microscopia de dois fotões (14:00) e permite que para a imagem latente de amostras fluorescentes em profundidades de até 1 mm15,16. Enquanto comercialmente disponível 14:00 configurações tornaram-se amigável e confiável, o grande desafio para a imagem latente intravital é cuidadosamente expor e estabilizar o órgão-alvo de ratos anestesiados, especialmente para a imagem latente da série de lapso de tempo. Vários métodos para a correção de deriva digital depois de aquisição de dados ter sido publicado17,18 anos e recentemente desenvolvemos a "VivoFollow", um sistema de correção automática, que neutraliza o tecido lenta deriva em tempo real usando um estágio informatizado19. No entanto, é ainda essencial para alta qualidade de imagem para minimizar o movimento do tecido, especialmente movimentos rápidos causados pela respiração ou batimento cardíaco19. Procedimentos de preparação e estabilização foram publicados por vários órgãos, incluindo medula espinhal2021de fígado, pele22, pulmão23e linfonodo24. Além disso, modelos para a imagem latente de glândulas salivares de ratos foram desenvolvidos3,25 e ainda mais refinado para intravital imagem de alta resolução do murino que SMG adaptado a um microscópio invertido configuração26, 27 , 28.
Aqui, apresentamos um protocolo prático e adaptável para intravital imagem da SMG murino utilizando microscopia não linear vertical, que é comumente usada para a imagem latente intravital no campo da imunologia. Para este fim, nós modificamos um palco de imobilização muito utilizado usado para preparações de linfonodo poplíteo.

<table><tbody><tr><td>Narketan 10 %&nbsp; (Cetamina) 20ml (100 mg/ml)</td><td>Vetoquinol</td><td>3605877535982</td><td></td></tr><tr><td>Rompun 2% (Xilazina) 25 ml (20 mg/ml)</td><td>Bayer</td><td>680538150144</td><td></td></tr><tr><td>NaCl salino 0,9%</td><td>B. Braun</td><td>3535789</td><td></td></tr><tr><td>Prequillan 1% (Acepromazina) 10 ml (10 mg/ml)</td><td>Fatro</td><td>6805671900029</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador elétrico</td><td>Wahl</td><td>9818L</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Depilação creme</td><td>Veet</td><td>4002448090656</td><td></td></tr><tr><td>Durapore Fita cirúrgica (2,5 cm x 9,1 m e 1,25 cm x 9,1 m)</td><td>Durapore (3M)</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Durapore Fita cirúrgica (2,5 cm x 9,1 m e 1,25 cm x 9,1 m)</td><td>Durapore (3M)</td><td>1538-0</td><td></td></tr><tr><td>Super cola Ultra gel, cola instantânea</td><td>Pattex, Henkel</td><td>4015000415040</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro de cobertura de microscópio 20 mm e 22 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>631-1343/ 631-1344</td><td></td></tr><tr><td>Graxa para laboratórios 60 g glisseal N</td><td>Borer (fornecedor VWR)</td><td>DECO514215.00-CA15</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>14090-09</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>11252-20</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Cotonete</td><td>Migros</td><td>617027988254</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Gaze Gazin 5 x 5 cm</td><td>Lohmann e Rauscher</td><td>18500</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>Texas Red dextran 70kDa</td><td>&nbsp; Sondas Moleculares</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Cascade Blue dextran 10kDa</td><td>invitrogen</td><td>D1976</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de dois fótons</td><td>LaVision Biotec</td><td>TrimScope I e II</td><td>ou similar</td></tr><tr><td>XLUMPLANFL 20x/0.95 W objetiva</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td>ou outra objetiva de imersão em água&nbsp;</td></tr><tr><td>Termômetro digital</td><td>Fluke</td><td>95969077651</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de murino das glândulas salivares submandibular para microscopia intravital vertical

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Glândula salivar submandibular (SMG) é uma das três principais glândulas salivares e é de interesse para muitos diferentes campos de pesquisa biológica, incluindo Imunologia, oncologia, odontologia e biologia celular. O SMG é uma glândula exócrina composta de células epiteliais secretoras, miofibroblastos, células endoteliais, nervos e matriz extracelular. Processos celulares dinâmicos no rato e rato SMG anteriormente tem sido fotografados, principalmente utilizando invertido sistemas multi fóton microscópio. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a preparação cirúrgica e estabilização da SMG murino em ratos anestesiados para a imagem latente na vivo com sistemas vertical multi fóton microscópio. Apresentamos a moda imagem intravital representativa de endógena e enviaram transferido células fluorescentes, incluindo a rotulagem dos vasos sanguíneos ou dutos salivares e geração segundo harmônica Visualizar fibrillar colágeno. Em suma, nosso protocolo permite a preparação cirúrgica das glândulas salivares de rato em sistemas de microscopia na posição vertical, que são comumente usados para intravital imagem no campo da imunologia.

Este protocolo permite imagens de quase todo o dorsal ou ventral lado da SMG. O campo de visão tipicamente inclui também a glândula salivar sublingual, que difere ligeiramente da SMG na composição celular4. Ambas as glândulas são encapsuladas por colágeno fibrillar e subdivididas em lóbulos. A maioria das 14:00 sistemas podem produzir uma imagem livre de rótulo de colágeno fibrillar medindo o sinal harmônico 2nd , mas geralmente moléculas fluorescentes s...

Descreveremos um protocolo para cirurgicamente expor e estabilizar a glândula salivar submandibular murino para intravital imagem usando microscopia intravital vertical. Este protocolo é facilmente adaptável a outras glândulas exócrinas da cabeça e região do pescoço dos ratos e outros pequenos roedores.

Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é preparar a glândula salivar submandibular murina para microscopia intravital vertical. Este método pode ajudar a responder a perguntas em qualquer campo de pesquisa que use a glândula salivar submandibular como órgão modelo, por exemplo, imunologia. A principal vantagem desta técnica é que permite o preparo cirúrgico da glândula salivar para microscopia intravital vertical, que é amplamente utilizada no campo da imunologia.Primeiro, use um barbeador elétrico para remover o pelo da área de barbear em um rato C57 preto de seis. Em seguida, passe um cotonete com creme depilatório e aplique na área raspada. Após cerca de três minutos, use lenços úmidos para remover completamente o creme da área depilada.Em seguida, remova os suportes do anel de aquecimento e o suporte de lamínula removível para preparar o palco para fixar o mouse. Em seguida, afrouxe os parafusos da barra auricular e os suportes fixos da lamínula. Em seguida, cole um pedaço de gaze no centro do palco para preparar uma cama para o rato.Use cola para prender uma lamínula de 20 milímetros de diâmetro na parte superior de um suporte de metal cilíndrico formando a lamínula inf

preparation-murine-submandibular-salivary-gland-for-upright

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo para a canulação do mouse glândula salivar submandibular via ducto de Wharton, é descrito. Para este experimento, a solução de azul de tripano é usado como um tintureiro para demonstrar como esta técnica efetivamente oferece infusões na glândula alvo, e sugerir a confiabilidade dessa nova abordagem como uma potencial terapia medicamentosa / célula clínicos para a regeneração das glândulas salivares.

Canulação da glândula submandibular do rato através do duto salivar de Wharton

Uma técnica para manipular geneticamente as células epiteliais no quadro da...

Modificação genética e recombinação de culturas de órgãos de glândula salivar

Microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite a imagem latente vários processos biológicos em animais vivos. Neste artigo, é apresentado um método detalhado para a imagem dinâmica das estruturas subcelulares, tais como os grânulos secretores, nas glândulas salivares de ratos vivos.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

A glândula lacrimal (LG) é um órgão de ramificação que produz os componentes aquosos de lágrimas necessários para a manutenção da visão e saúde ocular. Aqui nós descrevemos murino LG dissecção e ex vivo de técnicas de cultura de decifrar as vias de sinalização envolvidas na LG desenvolvimento.

Manipulando o Murino lacrimais Gland

A hipofunção das glândulas salivares, um dos principais efeitos adversos da radioterapia de cabeça e pescoço, diminui a qualidade de vida do paciente. A demonstração da eficácia de novas terapias em modelos animais é um pré-requisito antes da transição clínica. Este protocolo descreve a administração retroductal e a irradiação local das glândulas submandibulares de ratos.

Retroductal submandibular Glândula instilação e localizada fracionado irradiação em um modelo de rato de salivar Hipofunção

Entrega de drogas local para as glândulas submandibulares é de interesse em biologia de glândula salivar de entendimento e para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Apresentamos um protocolo de injeção retroductal atualizadas e detalhadas, destinado a melhorar a precisão de entrega e reprodutibilidade experimental. O aplicativo aqui apresentado é a entrega de nanopartículas poliméricas.

Injeção de Retroductal de nanopartículas para a glândula Submandibular murino

Apresentamos uma abordagem detalhada para realizar coleta de saliva, incluindo murino traqueostomia e o isolamento dos três glândulas salivares maiores.

Murino salivar avaliação funcional através de pilocarpina estimulação seguinte fracionada de radiação

Usar culturas queratinócitos tridimensionais para visualizar a morfologia e os marcadores funcionais de glândulas salivares pode fornecer introspecções novas nos mecanismos de dano de tecido depois da radiação. Descrito aqui é um protocolo para secção, cultura, irradiar, mancha, e imagem 50 – 90 μm de espessura secções salivares antes e após a exposição à radiação ionizante.

Tratamento de radiação de culturas organotypic de glândulas salivares submandibulares e parótidas modelos chave in vivo características

O presente protocolo descreve uma técnica fácil para a imagem intravital da glândula mamária de camundongos lactantes por microscopia confocal e multifotônica de varredura a laser.

Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

No presente protocolo, a função de barreira endotelial da glândula submandibular (SMG) foi avaliada por meio da injeção de diferentes marcadores fluorescentes de peso molecular nas veias angulares de modelos animais de teste in vivo sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons.

In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo

A imagem por imunofluorescência é limitada pela capacidade de observar processos biológicos complexos e dependentes do tempo em apenas um único instantâneo no tempo. Este estudo descreve uma abordagem de imagem ao vivo conduzida em cortes de glândula submandibular de camundongos com corte preciso. Esta abordagem permite a observação em tempo real das interações célula-célula durante a homeostase e os processos de regeneração e reparo.

Interrogando interações célula-célula na glândula salivar via imagem de células vivas ex vivo

Aprenda a preparar cirurgicamente a glândula salivar submandibular murina para microscopia intravital vertical. Este protocolo permite visualizar processos celulares em tempo real em imunologia e biologia glandular.

Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical

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