Name: Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar macrófagos alveolares de murinos e humanos para pesquisa em imunologia pulmonar. Este método fornece populações altamente purificadas para estudos de infecções respiratórias e inflamação.

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Agradecemos a Clare Prendergast para obter assistência com o manuscrito de edição. DKN é suportado por uma pesquisa conceder (#2095) da Fundação Flinn e TM é suportada por concessões do National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN desenvolveu os métodos, projetou o estudo e escreveu o manuscrito; OM assistida com estudos em animais e recolha de amostra clínica; SB assistida com fluxo cytometric análise e classificação de célula; TM supervisionou os estudos e revisão do manuscrito.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) o cuidados de Animal institucional e o institucional Review Board (IRB), no Hospital e centro médico de St. Joseph.
1. isolamento de AMs do líquido de lavagem broncoalveolar murino (BAL)
<ol><li>Anestesiar um rato C57BL/6 de oito semanas de idade com cetamina (87,5 mg/kg de peso) e xilazina (12,5 mg/kg de peso corporal) coquetel através de uma injeção intraperitoneal. Proceda quando rato atinja a anestesia cirúrgica com perda de reflexos e relaxamento dos músculos.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre uma superfície de dissecação com o lado ventral virada para cima. Aplica a pomada oftálmica veterinário nos olhos para evitar a desidratação e limpe toda a superfície ventral do mouse com almofadas de preparação de álcool estéril saturadas com isopropanol 70% para desinfetar.</li>
	<li>Monte o mouse com as quatro patas contidas.</li>
	<li>Abra cuidadosamente a cavidade abdominal com ferramentas micro dissecação. Deve ter cuidado para abrir a área tanto quanto possível sem danificar qualquer órgãos viscerais ou criando tecido pendendo sobre.</li>
	<li>Abra cuidadosamente a cavidade torácica por incisão lentamente a cavidade torácica através do mediastino. Idealmente, a caixa torácica pode ser extirpada do lado a lado. Extremo cuidado deve ser tomado para não machucar a pleura, dos pulmões durante a abertura da cavidade torácica.</li>
	<li>Localizar a veia cava inferior e fazer uma incisão para sangrar o mouse. Use almofadas de algodão absorvente para absorver o sangue.</li>
	<li>Injete soro fisiológico 10ml gelada tamponado de fosfato (PBS) no ventrículo direito (usando a seringa de 10 mL e agulha 25g) para liberar as células do sangue circulantes. Absorva o fluxo de sangue com almofadas de algodão absorvente. Uma vez completamente perfundidos, os pulmões aparecerão branqueados e então estão prontos para lavagem.</li>
	<li>Delicadamente abri a pele e muscular no pescoço para expor as vias aéreas. Excisar cuidadosamente os músculos adjacentes, cartilagens e tecidos de gordura sem danificar a traqueia.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão (< 2 mm) na traqueia posterior na laringe. Esta incisão deve ser apenas o suficiente para inserir um cateter em enquanto a traqueia continua preso na laringe. Inserir um cateter de 22G 1 polegada sem uma agulha na traqueia em direção aos pulmões. Fixar o cateter com uma sutura trançada seda (4-0; não absorvível) com um nó quadrado. Nota: O cateter precisa ser aparado com base no tamanho do mouse. Cateteres de extremamente curtos ou longos tendem a vazar e/ou rasgar a via aérea durante a lavagem. Comprimento do cateter deve ser tal que, quando totalmente inseridos os restos de ponta bem dentro da traqueia e não atingir os brônquios primários.</li>
	<li>Anexar uma seringa de 1 mL, cheia de buffer de BAL gelado (Ca2 + e Mg2 + grátis PBS + 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético, EDTA) para o cateter e incutir lentamente o buffer para os pulmões. Isto irá inflar os pulmões. Manter a seringa anexada ao cateter por cinco segundos e então aspirar o fluido de lavagem puxando suavemente o êmbolo. Isso esvaziará os pulmões. Recolha o líquido em um tubo cônico de 15 mL colocado no gelo.</li>
	<li>Repita a etapa 1.10 para nove vezes mais e o fluido de lavagem da piscina. Não exceda 1 mL de tampão por descarga, que podem exceder a capacidade pulmonar e levar a sua ruptura.</li>
	<li>Eutanásia o mouse com overdose de CO2 por protocolo IACUC aprovado.</li>
	<li>Centrifugue o líquido 10ml BAL a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. O centrifugado contém células do BAL. Atenção: O sedimento pode ser muito pequeno, então tenha cuidado ao aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células do BAL em 100 μL de tampão (PBS + 2% calor inativada soro fetal bovino (FBS) + 1 mM EDTA e ácido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) de 25 mM) de fluxo/classificação.</li>
	<li>Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando bloco de Fc de rato (clone 2.4G2, 10 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.</li>
	<li>Executar o anticorpo que mancha com fluorescência menos um (FMO) e single-mancha controles11,25. Avaliar o BAL células por um analisador de célula de análise de citometria de fluxo de célula única (ver Tabela de materiais) seguiram pelo software de análise adequada (consulte a Tabela de materiais).</li>
	<li>Isolar a AMs por uma célula de fluorescência-ativado classificador (ver Tabela de materiais) diretamente em rato 1 mL estou meio de cultura quando AMs destinam-se a cultura in vitro ou no vivo transferência de célula. Como alternativa, tipo AMs em 1 mL de tampão de lise (ver Tabela de materiais) suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol para extração de RNA.</li>
</ol>2. isolamento de AMs do pulmão do rato, suspensão de célula única
<ol><li>Anestesiar um rato C57BL/6 de oito semanas de idade com cetamina (87,5 mg/kg de peso) e xilazina (12,5 mg/kg de peso corporal) coquetel através de uma injeção intraperitoneal. Proceda quando rato atinja a anestesia cirúrgica com perda de reflexos e relaxamento dos músculos.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre uma superfície de dissecação com o lado ventral virada para cima. Aplica a pomada oftálmica veterinário nos olhos para evitar a desidratação e limpe toda a superfície ventral do mouse com álcool estéril almofadas saturadas com isopropanol 70% para desinfetar.</li>
	<li>Monte o mouse com as quatro patas contidas.</li>
	<li>Abra cuidadosamente a cavidade abdominal com ferramentas micro dissecação. Deve ter cuidado para abrir a área tanto quanto possível sem danificar qualquer órgãos viscerais ou criando tecido pendendo sobre.</li>
	<li>Abra cuidadosamente a cavidade torácica por incisão lentamente a cavidade torácica através do mediastino. Idealmente, a caixa torácica pode ser extirpada do lado a lado. Extremo cuidado deve ser tomado para não machucar a pleura, dos pulmões durante a abertura da cavidade torácica.</li>
	<li>Localizar a veia cava inferior e fazer uma incisão para sangrar o mouse. Use almofadas de algodão absorvente para absorver o sangue.</li>
	<li>Injete 10 mL PBS gelado no ventrículo direito (usando a seringa de 10 mL e agulha 25g) para liberar as células do sangue circulantes. Uma vez completamente perfundidos, os pulmões aparecerão branqueados e estão prontos para a colheita.</li>
	<li>Dissecar os pulmões pelo rompimento da traqueia, vasos sanguíneos e ligamentos em um tubo cônico de 15 mL, com 5 mL de frio médio modificado águia de Dulbecco (DMEM). Mantê-lo no gelo até o próximo passo.</li>
	<li>Eutanásia o mouse com overdose de CO2 por protocolo IACUC aprovado.</li>
	<li>Transferi os pulmões perfundidos para um prato de cultura estéril e apirógena 60 mm com 3 mL DMEM. Com a ajuda de pinças de dissecação destrinchar as vias aéreas e outro material duro tecido não-pulmonar, se presente. Picar o tecido pulmonar com um bisturi para < tamanho de 1 mm.</li>
	<li>Adicionar 300 µ g/mL Liberase TL e 5 U/mL DNase, misturar pipetando e incubar a 37° C numa incubadora por 25 minutos. Misture suavemente uma vez pipetando após 10 minutos.</li>
	<li>Passe os pulmões dissociados através de um filtro de célula 100 µm instalado em um tubo cónico de 50 mL. Use a volta de um êmbolo de seringa de 1 mL para amassar até grupos de célula no filtro. Lavar o filtro com 20 mL de tampão de lavagem (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g a 4 ° C durante 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL de tampão de lavagem.</li>
	<li>Repita as etapas 2.12 e 2.13 duas vezes, mudando o filtro e tubo de cada vez. Pré-imersão o filtro em tampão de lavagem por mais de cinco minutos aumenta o rendimento de AM. Preparar a suspensão de célula única adicionando 100 μL de tampão para o centrifugado de fluxo/classificação.</li>
	<li>Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando bloco de Fc de rato (clone 2.4G2, 10 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.</li>
	<li>Execute o anticorpo que mancha junto com FMO e controles de single-mancha11,25. Avaliar o pulmão células por um analisador de célula (ver Tabela de materiais) seguiram por citometria de fluxo de célula única análise pelo software.</li>
	<li>AMs tipo por um classificador de pilha (ver Tabela de materiais) diretamente em rato 1 mL estou meio de cultura quando AMs destinam-se a cultura in vitro ou no vivo transferência de célula. Alternativamente, classificar AMs em 1 mL de tampão de Lise suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol para extração de RNA.</li>
</ol>3. isolamento de AMs de fluido humano BAL
<ol><li>Transferir o líquido de BAL humano da clínica para o laboratório a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugue o fluido BAL (10-50 mL) em 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. O centrifugado contém BAL células11.</li>
	<li>Lave o pellet com 20 mL de tampão de lavagem (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 2 mM EDTA) e centrifugar 250 x g a 4 ° C por 10 minutos.</li>
	<li>Ressuspender as células do BAL estão em 100 μL de tampão de fluxo/classificação (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 1 mM EDTA + 25mm HEPES).</li>
	<li>Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando humana Fc bloco (clone Fc1.3070, 25 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.</li>
	<li>Execute o anticorpo que mancha junto com FMO e controles de single-mancha11,24. Avaliar o BAL células por um analisador de célula (ver Tabela de materiais) seguiram por citometria de fluxo de célula única análise pelo software.</li>
	<li>AMs tipo por um classificador de célula (ver Tabela de materiais) diretamente em meio de cultura de 1ml AM humana ou 1 mL de tampão de Lise suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol.</li>
</ol>4. in vitro cultura da AMs
<ol><li>Seguindo a classificação de célula, recolher as células por centrifugação a 250 x g a 4 ° C por 10 min.</li>
	<li>Resuspenda AMs humanas em 1 mL meio de cultura humano AM [Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI) suplementado com 10% de 1640 FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como uma fonte de colônia de macrófagos (M-CSF), fator de concentração final de 100 U/mL), piruvato de sódio 1 mM, 10 mM de ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) e 1 x penicilina/estreptomicina (opcional)]. Da mesma forma, resuspenda mouse AMs em 1ml rato meio de cultura AM [DMEM suplementado com 10% FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como uma fonte de M-CSF, concentração final de 100 U/mL), 1 mM piruvato de sódio, 10 mM HEPES e 1x penicilina/estreptomicina (opcional )].</li>
	<li>Enumerar as trypan azul-excluindo células viáveis por um contador de célula e ajustar a concentração de células viáveis em 1 x 106/mL. Nota: Idealmente, acima de 5 x 105 AMs pode ser isolado de BAL fluido coletado de um rato masculino C57BL/6 de 8-10 semanas. O rendimento do AM do digest de pulmão do rato é variável e pode ser um pouco menos do que o fluido do mouse BAL. Rendimento de AM de fluido humano BAL depende do volume do fluido BAL, o volume total de soro usado na lavagem e a condição clínica do paciente.</li>
	<li>Baseado no rendimento e necessidade experimental, as sementes das células em câmara slides, pratos de cultura ou frascos de cultura. Idealmente, as sementes do AMs em 1 x 105/mL, com média de 10 mL em um frasco de cultura de tecidos de T25.</li>
	<li>Incube as células numa incubadora umidificado de 37 ° C com 5% CO2 atmosfera. Nota: AMs vai crescer como células aderentes e são de crescimento extremamente lento (tempo de duplicação > 7 dias).</li>
	<li>Em 24 horas após a semeadura, AMs devem ser aderente e não irá ser desanexada por uma mudança suave de meio de cultura. Remover o meio por aspiração de uma extremidade e reabasteça com meio fresco, pre-aquecido a 37 ° C. Nota: As células agora podem ser usadas para avaliar a fisiologia de AM ou os efeitos de estímulos. AMs cultivadas em slides câmara podem convenientemente ser manchadas com anticorpos apropriados e são ideais para visualização microscópica. Para avaliação de fluxo cytometric, AMs são colhidos pela incubação com célula não enzimáticos, dissociando a solução.</li>
	<li>Aspire o meio de cultura e adicionar dissociando solução suficiente para cobrir a superfície de cultura (aproximadamente 2 mL por frasco T25) e incubar a 37 ° C por 5-10 minutos. Não há raspagem será necessário, e não é aconselhável raspar as células mecanicamente. Bata levemente os lados, adicionar 1 a 2 mL de tampão de fluxo/classificação e suavemente Pipetar para cima e para baixo para desanexar a maioria das células aderentes.</li>
	<li>Para estudos de RNA, lyse as pilhas diretamente sobre o prato de cultura pela adição de Lise.</li>
</ol>

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<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
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Os autores têm sem conflitos de interesse para declarar.

MGA é macrófagos de pulmão-residente de vida longa que povoam os pulmões começando no nascimento e duradouro sobre a extensão de vida inteira26. Seus papéis na fisiologia pulmonar7 e patologia12 e seu potencial para prever de auto-imunidade pulmonar24 foram reconhecidos. Porque AMs tem uma presença de longo prazo em pulmões11,27 e porque eles estão envolvidos na ativaç...

O microambiente pulmonar é um ecossistema complexo exclusivamente com uma conduta de ar elaborada e vasculatura. O ar inalado viaja através da traqueia e inúmeras ramificações dos brônquios e bronquíolos antes de atingir os alvéolos, onde ocorre a troca de gás de ar-sangue. Devido à interação direta com a atmosfera, a superfície respiratória requer proteção contra os efeitos potencialmente prejudiciais de partículas suspensas no ar e poluentes. Uma série de barreiras físicas, químicas e imunológicas protege os pulmões. Nomeadamente, a implantação dos fagócitos na superfície respiratória serve um sistema importante primeira linha de defesa. Macrófagos alveolares (AMs) são um tipo de fagócitos residente no pulmão, e eles compõem a grande maioria do grupo de macrófagos pulmonares. Como seu nome sugere, AMs são principalmente localizadas para o lúmen alveolar e ocorrem como células sésseis que constantemente a atmosfera ambiente da amostra e comunicar-se com o epitélio alveolar1. No estado estacionário, pulmões, mais de 95% dos fagócitos no espaço alveolar são AMs2, cuja composição pode alterar devido a inflamação, infecção ou exposição crônica aos poluentes.
AMs participarem em uma ampla gama de funções que podem ser locais para os pulmões e/ou de importância sistêmica. Por exemplo, AMs são essenciais para o desenvolvimento e o bom funcionamento dos pulmões; vigilância imunológica; e liberação de restos celulares, invadindo a patógenos e partículas inaladas3,4,5,6,7. Alvo de depleção de AMs é conhecida por prejudicar a liberação de vírus respiratórios e bactérias4,8. Além de seu papel como fagócitos e um defensores da primeira linha da homeostase pulmonar, AMs são conhecidos por funcionar como células apresentadoras de antígeno em suscitar T célula imunidade9, potencializando a eficácia da vacina intranasal10 e influenciando a auto-imunidade restrição pulmonar após transplante de pulmão11,12. Deficiência na função AM tem sido associada a lipoidoproteinose alveolar pulmonar (PAP), uma condição resultante de uma mutação genética, malignidade ou infecção que prejudica o apuramento de surfactantes pulmonares13,14. Transplante de AMs agora está sendo explorada como uma abordagem terapêutica para o tratamento de PAP 15,16.
MGA é conhecidas que se originam durante a embriogênese e a persistir nos pulmões durante toda a vida sem ser substituído por leucócitos2,17de circulação. Embora, volume de negócios AM é indetectável nos pulmões homeostáticos, diferentes níveis de volume de negócios AM têm sido relatados em determinadas condições clínicas, incluindo a infecção pela gripe vírus4, mieloablativo irradiação18, exposição a endotoxina 19e20anos. MGA é acreditadas para auto renovar através de um baixo grau de proliferação de17,21, mas alguns estudos recentes afirmam que os monócitos podem dar origem a uma população de pulmão intravascular macrófagos22,23 , sob condições experimentais, mas a funcionalidade destes recém-convertidos macrófagos pulmonares ainda têm de ser definidos em doenças pulmonares. Além disso, compreender o limiar de estímulo no contexto de ativação AM é uma área potencialmente interessante, como o pulmão tenta preservar um equilíbrio entre os sinais inflamatórios e a maquinaria imunorreguladores.
As alterações fisiológicas ou patológicas que levam à perda do Regulamento imune são importantes para avaliar em vários ambientes clínicos (por exemplo, infecções respiratórias, doença inflamatória pulmonar e doenças pulmonares fibróticas). Não obstante, AMs são cada vez mais reconhecidos como indicadores ou mesmo determinantes da saúde pulmonar11,24. Atualmente, existem protocolos não unificados disponível para colheita, caracterizando, e/ou manutenção AMs com os humanos e modelos pré-clínicos de murino. Falta de um consenso sobre AM precursores e fenótipos e ausência de uma metodologia detalhada tinham sido grande bloqueio em decifrar função (ões) de AM na doença e na saúde pulmonar. O seguinte protocolo oferece uma identificação definitiva, isolamento e em vitro cultura estratégia extremamente avançar a compreensão do comportamento de AM e facilitar estudos de diagnósticos e terapêuticos AM-alvo.

<table><tbody><tr><td>Solução dissociante de células não enzimáticas</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Pomada Puralube Vet</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Cateter&nbsp;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura trançada de seda não absorvível&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>tampão de lise (Kit de RNA PureLink)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Classificador de células FACSAria II&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina&nbsp; (Cetatesia)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina&nbsp; (Analisado)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu; Filtro de célula M&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Bloco Fc Humano</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>Solução Azul de Tripano</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>linha celular L-929</td><td>American Type Culture</td><td>Collection ATCC,&nbsp; CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina&nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de Sódio</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Frasco de cultura de tecidos</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>156367</tr><tr><td>prato de cultura de 60 mm</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 15 mL&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 50 mL&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa analisador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Software de análise</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Clone N418, BV 421 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clone 551, PE conjugado</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clone HK1.4, BV605 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clone M1/69, BV510 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Clone OX-62, BV650 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Clone 927, APC conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Clone SA011F11, BV785 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30, AF488 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clone L243, APC/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clone 7-239, APC conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2, PE conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clone GHI/61, BV421 conjugado</td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura in vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Os macrófagos alveolares são macrófagos terminalmente diferenciados, pulmão-residente de origem pré-natal. Os macrófagos alveolares são únicos em sua longa vida e o seu importante papel no desenvolvimento pulmonar e função, bem como suas respostas pulmão-localizada a infecção e inflamação. Até à data, nenhum método unificado para identificação, isolamento e manipulação dos macrófagos alveolares com os humanos e ratos existe. Esse método é necessário para estudos sobre essas células imunes inatas importantes em várias configurações experimentais. O método descrito aqui, que pode ser facilmente adoptado por qualquer laboratório, é uma abordagem simplificada para colheita de macrófagos alveolares de líquido de lavagem broncoalveolar ou de tecido pulmonar e mantê-los em vitro. Porque os macrófagos alveolares ocorrem principalmente como células aderentes no alvéolo, o foco desse método é desalojá-los antes da colheita e identificação. O pulmão é um órgão altamente vascularizado, e vários tipos de células de origem mieloide e linfoide habitam, interagem e são influenciados pelo microambiente do pulmão. Usando o conjunto de marcadores de superfície descrita aqui, pesquisadores podem facilmente e de forma inequívoca distinguir outros leucócitos macrófagos alveolares e purificá-los para aplicações a jusante. O método de cultura desenvolvido neste documento suporta ambos humanos e macrófagos alveolares para multiplicação in vitro de rato e é compatível com estudos celulares e moleculares.

A abordagem de fluxo cytometric identificar rato AMs é mostrada na Figura 1. Isso inclui a análise de um conjunto mínimo de marcadores de superfície necessárias na distinção entre AMs de outros fagócitos residentes pulmonar ou pulmão infiltrando. É necessária análise diferencial de identificar positivamente AMs de intersticiais macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, monócitos e macrófagos derivados de monócitos pulmonares que ocorrem nos pulmões. O seg...

Esta comunicação descreve metodologias para isolamento e cultura de macrófagos alveolares dos humanos e modelos murino para fins experimentais.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar macrófagos alveolares humanos e de camundongos dos pulmões e do fluido de lavagem broncoalveolar e desenvolver o método para sua cultura in vitro. Este método pode ajudar a responder a algumas questões-chave no campo da imunologia pulmono, como o papel dos macrófagos alveolares na infecção respiratória, inflamação e autoimunidade. A principal vantagem desta técnica é ser capaz de distinguir os macrófagos alveolares dos outros leucócitos pulmonares e obter uma população de macrófagos alveolares altamente purificados para fins experimentais.Coloque um camundongo anestesiado em uma superfície de dissecção com o lado ventral voltado para cima. Aplique pomada veterinária oftálmica nos olhos para evitar a desidratação. Limpe toda a superfície ventral do camundongo com almofadas de preparação de álcool estéreis, saturadas com 70% de isopropanol, para desinfetar.Monte o mouse com as quatro patas retidas. Abra suavemente a cavidade abdominal com ferramentas de microdissecção. Deve-se tomar cuidado para abrir o máximo de área possível sem danificar nenhum órgão visceral ou criar tecido saliente.Abra suavemente a cavidade torácica incisando lentame

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um novo método para obter macrófagos de cultura primária de células de fígado de rato é descrito. Este método utiliza a proliferação de macrófagos na cultura, seguido por agitação de frascos de cultura e purificação pelo apego seletivo para pratos de plástico. Esta técnica proporciona eficiente macrófagos do fígado, sem equipamentos complexos e habilidades.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Um método para avaliar a capacidade dos isolados macrófagos alveolares do rato para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados por microscopia confocal.

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

Descrevemos aqui um protocolo simples para isolar macrófagos peritoneais murinos. Este procedimento é seguido pela extração de RNA para realizar a análise da expressão gênica após a estimulação de receptores do tipo Toll.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

Células da medula óssea cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) geram uma cultura heterogênea contendo macrófagos e células dendríticas (DCs). Este método destaca o uso da ligação de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar macrófagos das DCs na cultura GM-CSF. Os macrófagos nesta cultura têm muitas semelhanças com os macrófagos alveolares.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

Nós descrevemos um método para processar o líquido broncoalveolar do lavagem e o sangue periférico combinado dos indivíduos cronicamente HIV-contaminados na terapia antiretroviral para avaliar reservatórios pulmonars do HIV. Estes métodos resultam na aquisição de células T CD4 altamente puras e macrófagos alveolares que posteriormente podem ser utilizados para a imunofenotipagem e quantificações de DNA/RNA do HIV por reação em cadeia da polimerase ultrassensora.

Processamento de fluido de lavagem broncoalveolar e sangue pareado para macrófago alveolar e CD4+ T-Cell immunophenotyping e avaliação do reservatório de HIV

Apresentado aqui é um protocolo para isolamento do monócito sanguíneo humano primário, bem como sua diferenciação em macrófagos e células dendríticas e montagem com células epiteliais em um modelo pulmonar humano multicelular. Respostas biológicas de coculturas compostas de células imunes diferenciadas de monócitos recém-isolados ou descongelados, após exposição a estímulos proinflamatórios, são comparadas.

Modelo Alveolar Humano Multicelular Composto por Células Epiteliais e Células Imunes Primárias para Avaliação de Riscos

O protocolo aqui apresentado fornece uma abordagem passo-a-passo para o isolamento de macrófagos residentes cardíacos da região do nó sinoatrial (SAN) e do nó atrioventricular (AVN) de corações de camundongos.

Isolamento e Cultura de Macrófagos Cardíacos Residentes do Nó Sinoatrial e Atrioventricular Murino

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Aprenda a isolar e cultivar macrófagos alveolares de murinos e humanos para pesquisa em imunologia pulmonar. Este método fornece populações altamente purificadas para estudos de infecções respiratórias e inflamação.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

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