Name: Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar macrófagos alveolares de murinos e humanos para pesquisa em imunologia pulmonar. Este método fornece populações altamente purificadas para estudos de infecções respiratórias e inflamação.

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Agradecemos a Clare Prendergast para obter assistência com o manuscrito de edição. DKN é suportado por uma pesquisa conceder (#2095) da Fundação Flinn e TM é suportada por concessões do National Institutes of Health (R01HL056643 e R01HL092514). DKN desenvolveu os métodos, projetou o estudo e escreveu o manuscrito; OM assistida com estudos em animais e recolha de amostra clínica; SB assistida com fluxo cytometric análise e classificação de célula; TM supervisionou os estudos e revisão do manuscrito.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) o cuidados de Animal institucional e o institucional Review Board (IRB), no Hospital e centro médico de St. Joseph.
1. isolamento de AMs do líquido de lavagem broncoalveolar murino (BAL)
<ol><li>Anestesiar um rato C57BL/6 de oito semanas de idade com cetamina (87,5 mg/kg de peso) e xilazina (12,5 mg/kg de peso corporal) coquetel através de uma injeção intraperitoneal. Proceda quando rato atinja a anestesia cirúrgica com perda de reflexos e relaxamento dos músculos.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre uma superfície de dissecação com o lado ventral virada para cima. Aplica a pomada oftálmica veterinário nos olhos para evitar a desidratação e limpe toda a superfície ventral do mouse com almofadas de preparação de álcool estéril saturadas com isopropanol 70% para desinfetar.</li>
	<li>Monte o mouse com as quatro patas contidas.</li>
	<li>Abra cuidadosamente a cavidade abdominal com ferramentas micro dissecação. Deve ter cuidado para abrir a área tanto quanto possível sem danificar qualquer órgãos viscerais ou criando tecido pendendo sobre.</li>
	<li>Abra cuidadosamente a cavidade torácica por incisão lentamente a cavidade torácica através do mediastino. Idealmente, a caixa torácica pode ser extirpada do lado a lado. Extremo cuidado deve ser tomado para não machucar a pleura, dos pulmões durante a abertura da cavidade torácica.</li>
	<li>Localizar a veia cava inferior e fazer uma incisão para sangrar o mouse. Use almofadas de algodão absorvente para absorver o sangue.</li>
	<li>Injete soro fisiológico 10ml gelada tamponado de fosfato (PBS) no ventrículo direito (usando a seringa de 10 mL e agulha 25g) para liberar as células do sangue circulantes. Absorva o fluxo de sangue com almofadas de algodão absorvente. Uma vez completamente perfundidos, os pulmões aparecerão branqueados e então estão prontos para lavagem.</li>
	<li>Delicadamente abri a pele e muscular no pescoço para expor as vias aéreas. Excisar cuidadosamente os músculos adjacentes, cartilagens e tecidos de gordura sem danificar a traqueia.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão (< 2 mm) na traqueia posterior na laringe. Esta incisão deve ser apenas o suficiente para inserir um cateter em enquanto a traqueia continua preso na laringe. Inserir um cateter de 22G 1 polegada sem uma agulha na traqueia em direção aos pulmões. Fixar o cateter com uma sutura trançada seda (4-0; não absorvível) com um nó quadrado. Nota: O cateter precisa ser aparado com base no tamanho do mouse. Cateteres de extremamente curtos ou longos tendem a vazar e/ou rasgar a via aérea durante a lavagem. Comprimento do cateter deve ser tal que, quando totalmente inseridos os restos de ponta bem dentro da traqueia e não atingir os brônquios primários.</li>
	<li>Anexar uma seringa de 1 mL, cheia de buffer de BAL gelado (Ca2 + e Mg2 + grátis PBS + 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético, EDTA) para o cateter e incutir lentamente o buffer para os pulmões. Isto irá inflar os pulmões. Manter a seringa anexada ao cateter por cinco segundos e então aspirar o fluido de lavagem puxando suavemente o êmbolo. Isso esvaziará os pulmões. Recolha o líquido em um tubo cônico de 15 mL colocado no gelo.</li>
	<li>Repita a etapa 1.10 para nove vezes mais e o fluido de lavagem da piscina. Não exceda 1 mL de tampão por descarga, que podem exceder a capacidade pulmonar e levar a sua ruptura.</li>
	<li>Eutanásia o mouse com overdose de CO2 por protocolo IACUC aprovado.</li>
	<li>Centrifugue o líquido 10ml BAL a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. O centrifugado contém células do BAL. Atenção: O sedimento pode ser muito pequeno, então tenha cuidado ao aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células do BAL em 100 μL de tampão (PBS + 2% calor inativada soro fetal bovino (FBS) + 1 mM EDTA e ácido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) de 25 mM) de fluxo/classificação.</li>
	<li>Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando bloco de Fc de rato (clone 2.4G2, 10 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.</li>
	<li>Executar o anticorpo que mancha com fluorescência menos um (FMO) e single-mancha controles11,25. Avaliar o BAL células por um analisador de célula de análise de citometria de fluxo de célula única (ver Tabela de materiais) seguiram pelo software de análise adequada (consulte a Tabela de materiais).</li>
	<li>Isolar a AMs por uma célula de fluorescência-ativado classificador (ver Tabela de materiais) diretamente em rato 1 mL estou meio de cultura quando AMs destinam-se a cultura in vitro ou no vivo transferência de célula. Como alternativa, tipo AMs em 1 mL de tampão de lise (ver Tabela de materiais) suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol para extração de RNA.</li>
</ol>2. isolamento de AMs do pulmão do rato, suspensão de célula única
<ol><li>Anestesiar um rato C57BL/6 de oito semanas de idade com cetamina (87,5 mg/kg de peso) e xilazina (12,5 mg/kg de peso corporal) coquetel através de uma injeção intraperitoneal. Proceda quando rato atinja a anestesia cirúrgica com perda de reflexos e relaxamento dos músculos.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre uma superfície de dissecação com o lado ventral virada para cima. Aplica a pomada oftálmica veterinário nos olhos para evitar a desidratação e limpe toda a superfície ventral do mouse com álcool estéril almofadas saturadas com isopropanol 70% para desinfetar.</li>
	<li>Monte o mouse com as quatro patas contidas.</li>
	<li>Abra cuidadosamente a cavidade abdominal com ferramentas micro dissecação. Deve ter cuidado para abrir a área tanto quanto possível sem danificar qualquer órgãos viscerais ou criando tecido pendendo sobre.</li>
	<li>Abra cuidadosamente a cavidade torácica por incisão lentamente a cavidade torácica através do mediastino. Idealmente, a caixa torácica pode ser extirpada do lado a lado. Extremo cuidado deve ser tomado para não machucar a pleura, dos pulmões durante a abertura da cavidade torácica.</li>
	<li>Localizar a veia cava inferior e fazer uma incisão para sangrar o mouse. Use almofadas de algodão absorvente para absorver o sangue.</li>
	<li>Injete 10 mL PBS gelado no ventrículo direito (usando a seringa de 10 mL e agulha 25g) para liberar as células do sangue circulantes. Uma vez completamente perfundidos, os pulmões aparecerão branqueados e estão prontos para a colheita.</li>
	<li>Dissecar os pulmões pelo rompimento da traqueia, vasos sanguíneos e ligamentos em um tubo cônico de 15 mL, com 5 mL de frio médio modificado águia de Dulbecco (DMEM). Mantê-lo no gelo até o próximo passo.</li>
	<li>Eutanásia o mouse com overdose de CO2 por protocolo IACUC aprovado.</li>
	<li>Transferi os pulmões perfundidos para um prato de cultura estéril e apirógena 60 mm com 3 mL DMEM. Com a ajuda de pinças de dissecação destrinchar as vias aéreas e outro material duro tecido não-pulmonar, se presente. Picar o tecido pulmonar com um bisturi para < tamanho de 1 mm.</li>
	<li>Adicionar 300 µ g/mL Liberase TL e 5 U/mL DNase, misturar pipetando e incubar a 37° C numa incubadora por 25 minutos. Misture suavemente uma vez pipetando após 10 minutos.</li>
	<li>Passe os pulmões dissociados através de um filtro de célula 100 µm instalado em um tubo cónico de 50 mL. Use a volta de um êmbolo de seringa de 1 mL para amassar até grupos de célula no filtro. Lavar o filtro com 20 mL de tampão de lavagem (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g a 4 ° C durante 5 minutos. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 20 mL de tampão de lavagem.</li>
	<li>Repita as etapas 2.12 e 2.13 duas vezes, mudando o filtro e tubo de cada vez. Pré-imersão o filtro em tampão de lavagem por mais de cinco minutos aumenta o rendimento de AM. Preparar a suspensão de célula única adicionando 100 μL de tampão para o centrifugado de fluxo/classificação.</li>
	<li>Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando bloco de Fc de rato (clone 2.4G2, 10 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.</li>
	<li>Execute o anticorpo que mancha junto com FMO e controles de single-mancha11,25. Avaliar o pulmão células por um analisador de célula (ver Tabela de materiais) seguiram por citometria de fluxo de célula única análise pelo software.</li>
	<li>AMs tipo por um classificador de pilha (ver Tabela de materiais) diretamente em rato 1 mL estou meio de cultura quando AMs destinam-se a cultura in vitro ou no vivo transferência de célula. Alternativamente, classificar AMs em 1 mL de tampão de Lise suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol para extração de RNA.</li>
</ol>3. isolamento de AMs de fluido humano BAL
<ol><li>Transferir o líquido de BAL humano da clínica para o laboratório a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugue o fluido BAL (10-50 mL) em 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. O centrifugado contém BAL células11.</li>
	<li>Lave o pellet com 20 mL de tampão de lavagem (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 2 mM EDTA) e centrifugar 250 x g a 4 ° C por 10 minutos.</li>
	<li>Ressuspender as células do BAL estão em 100 μL de tampão de fluxo/classificação (PBS + 2% de calor inactivada FBS + 1 mM EDTA + 25mm HEPES).</li>
	<li>Bloquear a ligação de anticorpos inespecíficos ao receptor Fc adicionando humana Fc bloco (clone Fc1.3070, 25 μg/mL) e incubar durante 20 minutos no gelo.</li>
	<li>Execute o anticorpo que mancha junto com FMO e controles de single-mancha11,24. Avaliar o BAL células por um analisador de célula (ver Tabela de materiais) seguiram por citometria de fluxo de célula única análise pelo software.</li>
	<li>AMs tipo por um classificador de célula (ver Tabela de materiais) diretamente em meio de cultura de 1ml AM humana ou 1 mL de tampão de Lise suplementado com 10 µ l/mL de β-Mercaptoetanol.</li>
</ol>4. in vitro cultura da AMs
<ol><li>Seguindo a classificação de célula, recolher as células por centrifugação a 250 x g a 4 ° C por 10 min.</li>
	<li>Resuspenda AMs humanas em 1 mL meio de cultura humano AM [Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI) suplementado com 10% de 1640 FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como uma fonte de colônia de macrófagos (M-CSF), fator de concentração final de 100 U/mL), piruvato de sódio 1 mM, 10 mM de ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) e 1 x penicilina/estreptomicina (opcional)]. Da mesma forma, resuspenda mouse AMs em 1ml rato meio de cultura AM [DMEM suplementado com 10% FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como uma fonte de M-CSF, concentração final de 100 U/mL), 1 mM piruvato de sódio, 10 mM HEPES e 1x penicilina/estreptomicina (opcional )].</li>
	<li>Enumerar as trypan azul-excluindo células viáveis por um contador de célula e ajustar a concentração de células viáveis em 1 x 106/mL. Nota: Idealmente, acima de 5 x 105 AMs pode ser isolado de BAL fluido coletado de um rato masculino C57BL/6 de 8-10 semanas. O rendimento do AM do digest de pulmão do rato é variável e pode ser um pouco menos do que o fluido do mouse BAL. Rendimento de AM de fluido humano BAL depende do volume do fluido BAL, o volume total de soro usado na lavagem e a condição clínica do paciente.</li>
	<li>Baseado no rendimento e necessidade experimental, as sementes das células em câmara slides, pratos de cultura ou frascos de cultura. Idealmente, as sementes do AMs em 1 x 105/mL, com média de 10 mL em um frasco de cultura de tecidos de T25.</li>
	<li>Incube as células numa incubadora umidificado de 37 ° C com 5% CO2 atmosfera. Nota: AMs vai crescer como células aderentes e são de crescimento extremamente lento (tempo de duplicação > 7 dias).</li>
	<li>Em 24 horas após a semeadura, AMs devem ser aderente e não irá ser desanexada por uma mudança suave de meio de cultura. Remover o meio por aspiração de uma extremidade e reabasteça com meio fresco, pre-aquecido a 37 ° C. Nota: As células agora podem ser usadas para avaliar a fisiologia de AM ou os efeitos de estímulos. AMs cultivadas em slides câmara podem convenientemente ser manchadas com anticorpos apropriados e são ideais para visualização microscópica. Para avaliação de fluxo cytometric, AMs são colhidos pela incubação com célula não enzimáticos, dissociando a solução.</li>
	<li>Aspire o meio de cultura e adicionar dissociando solução suficiente para cobrir a superfície de cultura (aproximadamente 2 mL por frasco T25) e incubar a 37 ° C por 5-10 minutos. Não há raspagem será necessário, e não é aconselhável raspar as células mecanicamente. Bata levemente os lados, adicionar 1 a 2 mL de tampão de fluxo/classificação e suavemente Pipetar para cima e para baixo para desanexar a maioria das células aderentes.</li>
	<li>Para estudos de RNA, lyse as pilhas diretamente sobre o prato de cultura pela adição de Lise.</li>
</ol>

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<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
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Os autores têm sem conflitos de interesse para declarar.

MGA é macrófagos de pulmão-residente de vida longa que povoam os pulmões começando no nascimento e duradouro sobre a extensão de vida inteira26. Seus papéis na fisiologia pulmonar7 e patologia12 e seu potencial para prever de auto-imunidade pulmonar24 foram reconhecidos. Porque AMs tem uma presença de longo prazo em pulmões11,27 e porque eles estão envolvidos na ativaç...

O microambiente pulmonar é um ecossistema complexo exclusivamente com uma conduta de ar elaborada e vasculatura. O ar inalado viaja através da traqueia e inúmeras ramificações dos brônquios e bronquíolos antes de atingir os alvéolos, onde ocorre a troca de gás de ar-sangue. Devido à interação direta com a atmosfera, a superfície respiratória requer proteção contra os efeitos potencialmente prejudiciais de partículas suspensas no ar e poluentes. Uma série de barreiras físicas, químicas e imunológicas protege os pulmões. Nomeadamente, a implantação dos fagócitos na superfície respiratória serve um sistema importante primeira linha de defesa. Macrófagos alveolares (AMs) são um tipo de fagócitos residente no pulmão, e eles compõem a grande maioria do grupo de macrófagos pulmonares. Como seu nome sugere, AMs são principalmente localizadas para o lúmen alveolar e ocorrem como células sésseis que constantemente a atmosfera ambiente da amostra e comunicar-se com o epitélio alveolar1. No estado estacionário, pulmões, mais de 95% dos fagócitos no espaço alveolar são AMs2, cuja composição pode alterar devido a inflamação, infecção ou exposição crônica aos poluentes.
AMs participarem em uma ampla gama de funções que podem ser locais para os pulmões e/ou de importância sistêmica. Por exemplo, AMs são essenciais para o desenvolvimento e o bom funcionamento dos pulmões; vigilância imunológica; e liberação de restos celulares, invadindo a patógenos e partículas inaladas3,4,5,6,7. Alvo de depleção de AMs é conhecida por prejudicar a liberação de vírus respiratórios e bactérias4,8. Além de seu papel como fagócitos e um defensores da primeira linha da homeostase pulmonar, AMs são conhecidos por funcionar como células apresentadoras de antígeno em suscitar T célula imunidade9, potencializando a eficácia da vacina intranasal10 e influenciando a auto-imunidade restrição pulmonar após transplante de pulmão11,12. Deficiência na função AM tem sido associada a lipoidoproteinose alveolar pulmonar (PAP), uma condição resultante de uma mutação genética, malignidade ou infecção que prejudica o apuramento de surfactantes pulmonares13,14. Transplante de AMs agora está sendo explorada como uma abordagem terapêutica para o tratamento de PAP 15,16.
MGA é conhecidas que se originam durante a embriogênese e a persistir nos pulmões durante toda a vida sem ser substituído por leucócitos2,17de circulação. Embora, volume de negócios AM é indetectável nos pulmões homeostáticos, diferentes níveis de volume de negócios AM têm sido relatados em determinadas condições clínicas, incluindo a infecção pela gripe vírus4, mieloablativo irradiação18, exposição a endotoxina 19e20anos. MGA é acreditadas para auto renovar através de um baixo grau de proliferação de17,21, mas alguns estudos recentes afirmam que os monócitos podem dar origem a uma população de pulmão intravascular macrófagos22,23 , sob condições experimentais, mas a funcionalidade destes recém-convertidos macrófagos pulmonares ainda têm de ser definidos em doenças pulmonares. Além disso, compreender o limiar de estímulo no contexto de ativação AM é uma área potencialmente interessante, como o pulmão tenta preservar um equilíbrio entre os sinais inflamatórios e a maquinaria imunorreguladores.
As alterações fisiológicas ou patológicas que levam à perda do Regulamento imune são importantes para avaliar em vários ambientes clínicos (por exemplo, infecções respiratórias, doença inflamatória pulmonar e doenças pulmonares fibróticas). Não obstante, AMs são cada vez mais reconhecidos como indicadores ou mesmo determinantes da saúde pulmonar11,24. Atualmente, existem protocolos não unificados disponível para colheita, caracterizando, e/ou manutenção AMs com os humanos e modelos pré-clínicos de murino. Falta de um consenso sobre AM precursores e fenótipos e ausência de uma metodologia detalhada tinham sido grande bloqueio em decifrar função (ões) de AM na doença e na saúde pulmonar. O seguinte protocolo oferece uma identificação definitiva, isolamento e em vitro cultura estratégia extremamente avançar a compreensão do comportamento de AM e facilitar estudos de diagnósticos e terapêuticos AM-alvo.

<table><tbody><tr><td>Solução dissociante de células não enzimáticas</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Pomada Puralube Vet</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Cateter&nbsp;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura trançada de seda não absorvível&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>tampão de lise (Kit de RNA PureLink)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Classificador de células FACSAria II&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina&nbsp; (Cetatesia)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina&nbsp; (Analisado)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu; Filtro de célula M&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Bloco Fc Humano</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>Solução Azul de Tripano</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>linha celular L-929</td><td>American Type Culture</td><td>Collection ATCC,&nbsp; CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina&nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de Sódio</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Frasco de cultura de tecidos</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>156367</tr><tr><td>prato de cultura de 60 mm</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 15 mL&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 50 mL&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa analisador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Software de análise</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Clone N418, BV 421 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clone 551, PE conjugado</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clone HK1.4, BV605 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clone M1/69, BV510 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Clone OX-62, BV650 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Clone 927, APC conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Clone SA011F11, BV785 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30, AF488 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clone L243, APC/Cy7 conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clone 7-239, APC conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2, PE conjugado</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Humano)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clone GHI/61, BV421 conjugado</td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura in vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Os macrófagos alveolares são macrófagos terminalmente diferenciados, pulmão-residente de origem pré-natal. Os macrófagos alveolares são únicos em sua longa vida e o seu importante papel no desenvolvimento pulmonar e função, bem como suas respostas pulmão-localizada a infecção e inflamação. Até à data, nenhum método unificado para identificação, isolamento e manipulação dos macrófagos alveolares com os humanos e ratos existe. Esse método é necessário para estudos sobre essas células imunes inatas importantes em várias configurações experimentais. O método descrito aqui, que pode ser facilmente adoptado por qualquer laboratório, é uma abordagem simplificada para colheita de macrófagos alveolares de líquido de lavagem broncoalveolar ou de tecido pulmonar e mantê-los em vitro. Porque os macrófagos alveolares ocorrem principalmente como células aderentes no alvéolo, o foco desse método é desalojá-los antes da colheita e identificação. O pulmão é um órgão altamente vascularizado, e vários tipos de células de origem mieloide e linfoide habitam, interagem e são influenciados pelo microambiente do pulmão. Usando o conjunto de marcadores de superfície descrita aqui, pesquisadores podem facilmente e de forma inequívoca distinguir outros leucócitos macrófagos alveolares e purificá-los para aplicações a jusante. O método de cultura desenvolvido neste documento suporta ambos humanos e macrófagos alveolares para multiplicação in vitro de rato e é compatível com estudos celulares e moleculares.

A abordagem de fluxo cytometric identificar rato AMs é mostrada na Figura 1. Isso inclui a análise de um conjunto mínimo de marcadores de superfície necessárias na distinção entre AMs de outros fagócitos residentes pulmonar ou pulmão infiltrando. É necessária análise diferencial de identificar positivamente AMs de intersticiais macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, monócitos e macrófagos derivados de monócitos pulmonares que ocorrem nos pulmões. O seg...

Esta comunicação descreve metodologias para isolamento e cultura de macrófagos alveolares dos humanos e modelos murino para fins experimentais.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar macrófagos alveolares humanos e de camundongos dos pulmões e do fluido de lavagem broncoalveolar e desenvolver o método para sua cultura in vitro. Este método pode ajudar a responder a algumas questões-chave no campo da imunologia pulmono, como o papel dos macrófagos alveolares na infecção respiratória, inflamação e autoimunidade. A principal vantagem desta técnica é ser capaz de distinguir os macrófagos alveolares dos outros leucócitos pulmonares e obter uma população de macrófagos alveolares altamente purificados para fins experimentais.Coloque um camundongo anestesiado em uma superfície de dissecção com o lado ventral voltado para cima. Aplique pomada veterinária oftálmica nos olhos para evitar a desidratação. Limpe toda a superfície ventral do camundongo com almofadas de preparação de álcool estéreis, saturadas com 70% de isopropanol, para desinfetar.Monte o mouse com as quatro patas retidas. Abra suavemente a cavidade abdominal com ferramentas de microdissecção. Deve-se tomar cuidado para abrir o máximo de área possível sem danificar nenhum órgão visceral ou criar tecido saliente.Abra suavemente a cavidade torácica incisando lentamente a caixa torácica através do mediastino. Idealmente, a caixa torácica pode ser excisada de um lado para o outro. Deve-se tomar extremo cuidado para não ferir a pleura dos pulmões ao abrir a cavidade torácica.Localize a veia cava inferior e faça uma incisão para sangrar o camundongo. Use almofadas de algodão absorventes para absorver o sangue. Injete 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado no ventrículo direito para liberar as células sanguíneas circulantes.Absorva o fluxo de sangue com almofadas de algodão absorventes. Uma vez completamente perfundidos, os pulmões parecerão branqueados e estarão prontos para a lavagem. Corte suavemente a pele e o músculo do pescoço para expor as vias aéreas.Extirpar cuidadosamente os músculos, cartilagens e tecidos adiposos adjacentes, sem danificar a traqueia. Em seguida, faça uma pequena incisão na traqueia, posterior à laringe. Esta incisão deve ser apenas o suficiente para inserir um cateter enquanto a traqueia ainda está presa à laringe.A etapa mais crítica na coleta do fluido de LBA é conectar com segurança um cateter à traqueia que minimizará os vazamentos durante a lavagem. Insira um cateter de calibre 22 de uma polegada sem agulha na traqueia em direção aos pulmões. Prenda o cateter com uma sutura trançada de seda e um nó quadrado.Com mãos firmes e para seguir este passo, lenta e suavemente evita a ruptura da traqueia e dos pulmões. Conecte uma seringa de um mililitro, cheia de tampão de LBA gelada ao cateter e instile lentamente o tampão nos pulmões. Isso inflará os pulmões.Mantenha a seringa presa ao cateter por cinco segundos e, em seguida, aspire o fluido de lavagem puxando suavemente o pistão. Isso irá esvaziar os pulmões. Recolha o líquido num tubo cónico de 15 mililitros, colocado sobre gelo.Repita a inflação e a deflação mais nove vezes e acumule o fluido de lavagem. Não exceda um mililitro de tampão por descarga, pois isso pode exceder a capacidade pulmonar e levar à sua ruptura. Centrifugue os 10 mililitros de fluido BAL a 250 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos.O pellet celular contém células LBA. Ressuspenda as células de LBA em 100 microlitros de tampão de classificação de fluxo. Prossiga para corar e classificar as células conforme descrito no protocolo de texto.Prepare um camundongo anestesiado para dissecação, faça incisões e sangre o camundongo como antes. Injete 10 mililitros de PBS gelado no ventrículo direito para liberar as células sanguíneas circulantes. Uma vez completamente perfundidos, os pulmões parecerão branqueados e prontos para a colheita.Disseque os pulmões cortando a traqueia, os vasos sanguíneos e os ligamentos em um tubo cônico de 15 mililitros, com cinco mililitros de DMEM frio. Mantenha-o no gelo até a próxima etapa. Transfira os pulmões perfundidos para uma placa de cultura estéril e livre de pirogênio de 60 milímetros com três mililitros de DMEM.Com a ajuda de pinças de dissecação, retire as vias aéreas e outros materiais duros de tecido não pulmonar, se presentes. Pique o tecido pulmonar com um bisturi com menos de um milímetro. Adicione 300 microgramas por mililitro de Liberase TL e cinco unidades por mililitro de DNAse um.Misture pipetando e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora por 25 minutos. Após 10 minutos, misture delicadamente uma vez pipetando. Passe os pulmões dissociados por um filtro de células de 100 mícrons instalado em um tubo cônico de 50 mililitros.Use a parte de trás de um êmbolo de uma seringa de um mililitro para triturar aglomerados de células no filtro. Lave o filtro com 20 mililitros de tampão de lavagem. Centrifugue a 500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 20 mililitros de tampão de lavagem. Repita as etapas de deformação e centrifugação duas vezes, trocando o filtro e o tubo a cada vez. Finalmente, prepare a suspensão de célula única adicionando 100 microlitros de tampão de classificação de fluxo ao pellet de célula.Realize a coloração de anticorpos e a classificação celular, conforme descrito no protocolo de texto. Após a classificação das células, colha as células centrifugando a 250 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Ressuspenda os AMs de camundongo em um mililitro de meio de cultura AM de camundongo.Com base no rendimento e na necessidade experimental, semeie as células em lâminas de câmara, placas de cultura ou frascos de cultura. Idealmente, semeie os AMs a 100.000 por mililitro com 10 mililitros de meio em um frasco de cultura de tecidos T 25. Incube as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de atmosfera de dióxido de carbono.24 horas após a semeadura, os AMs devem ser aderentes e não serão destacados por uma mudança suave de meio de cultura. Remova o meio por aspiração de uma extremidade e reabasteça com meio fresco pré-aquecido a 37 graus Celsius. Por fim, observar o balão ao microscópio invertido.A avaliação por citometria de fluxo de macrófagos alveolares no fluido de lavagem alveolar bronco-do-camundongo é mostrada. Os macrófagos alveolares são positivos identificados por serem CD45 positivos, CD11c positivos e Siglec-F positivos. Mostrado aqui, é um resultado representativo de macrófagos alveolares de camundongos cultivados in vitro por 24 horas.As células tornaram-se aderentes e uma mudança suave de meio de cultura não as separará. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente duas horas, se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como distinguir os macrófagos alveolares de camundongos e humanos de outras células pulmonares.Além disso, como os procedimentos para obter uma bela população de macrófagos alveolares para experimentos a jusante. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que nem todos os macrófagos ou fagócitos residentes no pulmão são macrófagos alveolares. Os macrófagos alveolares são um tipo de células especializadas presentes nos pulmões desde o nascimento.Para o isolamento de macrófagos alveolares, o foco deve ser em métodos viáveis de extração do microambiente alveolar. O método de cultura in vitro desenvolvido aqui suporta o crescimento de macrófagos alveolares em uma condição de laboratório que pode ser utilizada em ensaios moleculares e celulares. Após este procedimento, outros métodos como transferência de células adotivas, apresentação de antígenos e avaliação da resposta a estímulos inflamatórios podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a biologia dos macrófagos alveolares.

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Um método para avaliar a capacidade dos isolados macrófagos alveolares do rato para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados por microscopia confocal.

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

Descrevemos aqui um protocolo simples para isolar macrófagos peritoneais murinos. Este procedimento é seguido pela extração de RNA para realizar a análise da expressão gênica após a estimulação de receptores do tipo Toll.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

Células da medula óssea cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) geram uma cultura heterogênea contendo macrófagos e células dendríticas (DCs). Este método destaca o uso da ligação de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar macrófagos das DCs na cultura GM-CSF. Os macrófagos nesta cultura têm muitas semelhanças com os macrófagos alveolares.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

Aqui nós relatamos métodos comuns para analisar a função fagocitária de macrófagos alveolares murino e apuramento bacteriano do pulmão. Esses métodos estudam in vitro fagocitose dos grânulos de isotiocianato de fluoresceína e fagocitose in vivo de Pseudomonas aeruginosa verde proteína fluorescente. Também descrevemos um método para limpar p. aeruginosa em camundongos.

Fagocitose de macrófagos alveolares e apuramento de bactérias em ratos

Nós descrevemos um método para processar o líquido broncoalveolar do lavagem e o sangue periférico combinado dos indivíduos cronicamente HIV-contaminados na terapia antiretroviral para avaliar reservatórios pulmonars do HIV. Estes métodos resultam na aquisição de células T CD4 altamente puras e macrófagos alveolares que posteriormente podem ser utilizados para a imunofenotipagem e quantificações de DNA/RNA do HIV por reação em cadeia da polimerase ultrassensora.

Processamento de fluido de lavagem broncoalveolar e sangue pareado para macrófago alveolar e CD4+ T-Cell immunophenotyping e avaliação do reservatório de HIV

Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

Apresentado aqui é um protocolo para isolamento do monócito sanguíneo humano primário, bem como sua diferenciação em macrófagos e células dendríticas e montagem com células epiteliais em um modelo pulmonar humano multicelular. Respostas biológicas de coculturas compostas de células imunes diferenciadas de monócitos recém-isolados ou descongelados, após exposição a estímulos proinflamatórios, são comparadas.

Modelo Alveolar Humano Multicelular Composto por Células Epiteliais e Células Imunes Primárias para Avaliação de Riscos

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Aprenda a isolar e cultivar macrófagos alveolares de murinos e humanos para pesquisa em imunologia pulmonar. Este método fornece populações altamente purificadas para estudos de infecções respiratórias e inflamação.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

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