Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

O objetivo geral desta metodologia é gerar plantas transgênicas carregando inserções intactas de cópia única de um DNA de transferência, ou T-DNA, de maneira eficiente. O vetor BIBAC-Gateway é uma ferramenta valiosa para gerar plantas transgênicas que carregam inserções intactas de cópia única de sequências de interesse que mostram expressão gênica estável. Com o vetor BIBAC-Gateway, pode-se usar a tecnologia de recombinação Gateway para inserir sequências de interesse com o mínimo de esforço.

Todos os derivados do BIBAC, incluindo os vetores BIBAC-Gateway, são adequados para transferir grandes fragmentos de DNA transgênico para genomas de plantas. Os vetores BIBAC-GW podem ser usados para inserir sequências de interesse em muitos sistemas de plantas, como milho, arroz e tomate. Existem dois plasmídeos BIBAC-GW disponíveis.

O plasmídeo BIBAC-RFP-GW contém um gene DsRed que é expresso em tegumentos. O plasmídeo BIBAC-BAR-GW contém um gene que fornece resistência ao glufosinato. Ambos os vetores contêm um gene resistente à canamicina como marcador de seleção em bactérias.

Para inserir as sequências de interesse no vetor binário, primeiro prepare a entrada do gateway e os vetores binários, conforme descrito no protocolo de texto. Para realizar uma reação de Gateway, prepare a reação de recombinação LR de acordo com as sugestões do fornecedor em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro à temperatura ambiente. Misture 100 a 300 nanogramas do clone de entrada superenrolado e 300 nanogramas do vetor BIBAC-Gateway.

Ajuste o volume da mistura para 16 microlitros com TE. Finalmente, adicione quatro microlitros de mistura de enzimas LR Clonase e misture por vórtice. Incube a mistura a 25 graus Celsius por uma hora. Termine a reação LR adicionando dois microlitros de solução de proteinase K à mistura.

Misture e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos antes de prosseguir com a transformação em E.coli, conforme descrito no protocolo de texto. Para preparar as plantas de Arabidopsis para a transformação, cultive as plantas de Arabidopsis em uma estufa ou câmara de crescimento climatizada até que estejam florescendo. Prenda os primeiros parafusos para permitir que mais parafusos secundários surjam.

As plantas estão prontas para mergulhar quatro a seis dias após o corte, quando as plantas têm muitas cabeças de flores imaturas e poucas sílicas fertilizadas. Para realizar a imersão floral, mergulhe as inflorescências por cinco a 10 segundos em suspensão de Agrobacterium. Use agitação suave.

Enrole as partes acima do solo das plantas em filme plástico para manter a umidade alta e cubra os vasos com uma caixa para manter as plantas no escuro. Incube as plantas por dois dias em uma estufa ou câmara de crescimento. Após dois dias, remova a caixa e o filme plástico e cultive as plantas até a maturidade em uma estufa ou câmara de crescimento.

Para aumentar a eficiência da transformação, as mesmas plantas podem ser mergulhadas novamente sete dias após a primeira imersão. Em seguida, quando as plantas transformadas estiverem maduras e secas, colha as sementes. Agrupe e analise as sementes de plantas transformadas com a mesma construção de um único conjunto.

Caso as plantas sejam transformadas com um derivado de plasmídeo BIBAC-RFP-Gateway, identifique as plantas transgênicas analisando as sementes usando microscopia de fluorescência. Para detectar a expressão de DsRed em tegumentos, imagine as sementes com uma excitação de 560 nanômetros e emissão de 600 a 650 nanômetros. Separe as sementes fluorescentes das não fluorescentes usando uma pinça.

Para rastrear plantas transgênicas transformadas com um derivado de plasmídeo BIBAC-BAR-Gateway, semeie as sementes em bandejas cheias de terra. Garanta uma distribuição uniforme das sementes em bandejas, suspendendo as sementes em 0,1% de ágar em meio MS 0,5x e espalhe as sementes usando uma pipeta de um mililitro. Estimule as sementes a germinar de maneira síncrona, incubando-as por pelo menos dois dias a quatro graus Celsius.

Isso pode ser feito antes ou depois de semear as sementes. Duas e três semanas após a semeadura, borrife as mudas com solução de glufosinato-amônio a 0,5%. Use 500 mililitros de solução de glufosinato-amônio por metro quadrado.

Transfira as mudas sobreviventes para vasos. Analise as plantas resistentes ao glufosinato-amônio por PCR para a presença do construto de interesse. Determine o número de integrações T-DNA e sua integridade por DNA blotting usando enzimas de restrição.

Este método permite a identificação de integrações únicas e repetidas no mesmo ou em diferentes loci no genoma. Use uma série de digestão de restrição para identificar os diferentes padrões de integração possíveis. Selecione uma enzima que corte uma vez no meio do T-DNA, para poder sondar independentemente as sequências a montante e a jusante do local de restrição.

Além disso, selecione uma enzima ou combinação de enzimas cortando toda a sequência de interesse de uma só vez. Tome cuidado para usar apenas enzimas de restrição que não sejam sensíveis à metilação da citosina. Depois de realizar o DNA blotting, conforme detalhado no protocolo de texto, faça a análise de blot.

A análise depende da estratégia de restrição utilizada. Ao analisar o blot usando a estratégia com um local de restrição no meio do T-DNA, conte o número de fragmentos detectados. Nesta estratégia, o número de fragmentos hibridizados sugere o número de integrações T-DNA.

Compare o número de fragmentos detectados com uma sonda para o lado esquerdo e direito do T-DNA. Se um número diferente de fragmentos de hibridização for detectado com as duas sondas, então várias integrações de T-DNA em uma repetição invertida ou T-DNAs incompletamente integrados estão presentes. Para identificar arranjos em tandem e invertidos dos T-DNAs, estime os tamanhos dos fragmentos de hibridização no blot com base no tamanho das bandas marcadoras e compare os tamanhos estimados com os tamanhos de fragmentos esperados calculados com base na estratégia de restrição.

Para examinar se a sequência transgênica de interesse está intacta, analise o blot preparado de acordo com a estratégia com locais de restrição nas extremidades da sequência de interesse. Estime o tamanho dos fragmentos de hibridização na mancha com base no tamanho das bandas de marcadores e compare-o com o tamanho esperado. Uma inserção intacta produz um único fragmento com um comprimento definido.

Qualquer desvio do comprimento esperado indica integração incompleta. A restrição de DNA e a estratégia de blotting para determinar o número e a integridade das integrações T-DNA são mostradas. O site de restrição ScaI divide a sequência do repórter nas partes proximais da borda esquerda que são detectadas ao usar uma sonda para bar e as partes proximais da borda direita que são detectadas ao usar uma sonda para eYFP.

Os locais de restrição BglII e PciI estão posicionados dentro do T-DNA, fora da construção repórter. Uma digestão dupla resulta em um fragmento com tamanho definido, e qualquer desvio é uma indicação de inserções incompletas. O número de fragmentos de hibridização identificados reflete o número de inserções de T-DNA.

Um blot contendo DNA genômico de nove transgênicos digeridos com ScaI foi hibridizado com sondas para bar e eYFP. Várias pistas indicam transgênicos com integrações únicas de T-DNA. A raia quatro exibe dois fragmentos com barra e um com eYFP, indicando um truncamento da sequência eYFP ou repetição invertida em torno da borda direita.

A pista seis exibe dois fragmentos com barra e eYFP. Um fragmento tem uma intensidade fraca com a sonda de barra. O outro fragmento tem alta intensidade, indicando duas inserções de T-DNA, uma das quais é truncada.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como incorporar sua sequência de DNA de interesse em um vetor binário BIBAC-GW usando a recombinação Gateway, seguida pela transformação de Arabidopsis, triagem e avaliação do número de integrações T-DNA e sua integridade. Gerar e caracterizar plantas transgênicas é demorado. Ao usar o BIBAC-Gateway como um vetor binário, o processo de identificação de transgênicos com integrações intactas de cópia única pode ser encurtado.

Cerca de metade dos transgênicos gerados com derivados BIBAC carregam integrações intactas de cópia única. Geralmente, os indivíduos não percebem que muitas plantas transgênicas geradas usando vetores binários comuns carregam cópias truncadas de um transgene ou transgenes que mostram silenciamento de genes. Com derivados BIBAC, a maioria das plantas transgênicas geradas carrega integrações únicas e intactas de um transgene que raramente mostram silenciamento de genes.

Ao usar BIBAC-GW para gerar transgênicos, é importante transformar um número suficiente de materiais vegetais, pois a eficiência geral de transformação dos derivados BIBAC é menor do que a dos vetores binários comumente usados. A eficiência de transformação do BIBAC-GW é geralmente entre 0,2% e 0,5% Após a identificação de plantas transgênicas com integrações de T-DNA intactas e de cópia única, se necessário, análises adicionais podem ser realizadas para definir a localização genômica precisa da inserção do T-DNA. Os transgênicos com integrações intactas de cópia única mostram níveis de expressão comparáveis dos transgenes.

Isso indica que a posição de integração do T-DNA no genoma tem pouco efeito no nível de expressão do transgene.