Name: Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprenda a gerar plantas transgênicas com inserções de cópia única intactas usando o vetor binário BIBAC-GW. Este método utiliza tecnologia Gateway para inserir grandes fragmentos de DNA em genomas de plantas como Arabidopsis, milho e arroz.

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Esta pesquisa é suportada pelo holandês tecnologia Foundation STW (12385), que faz parte da organização de países baixos para a pesquisa científica (NWO), e que é parcialmente financiado pelo Ministério dos assuntos económicos (OTP Grant 12385-MS).  Agradecemos a Carol M. Hamilton (Universidade de Cornell, Estados Unidos) para a prestação de pCH20, a espinha dorsal dos vetores BIBAC-GW.

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Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Crítico para a geração de transgênicos com integrações único, intactos de um transgene é a escolha do vetor binário usado. Vetores de família BIBAC têm sido utilizados para entregar muitos planta espécie23,24,25,26,,27,28-sequências de interesses. Vetores BIBAC, incluindo BIBAC-GW, rendem cópia única integrações com eficiênci...

Ao gerar plantas transgênicas, geralmente, o objetivo é ter o transgene integrado estàvel expressa. Isto pode ser conseguido por integrações intacta cópia única de um transgene. Múltiplas integrações podem levar ao aumento da expressão de um transgene, mas também para o silenciamento de genes. Silenciamento de transgenes é mais provável se sequências inseridas são dispostas em tandem ou repetições invertidas1,2,3,4. Vetores binários são usadas como naves em Agrobacterium-mediada experimentos de transformação para entregar as sequências de interesse em genomas de planta. O número de integrações no genoma planta é dependente do número de cópia do vetor binário em Agrobacterium tumefaciens5,6. Muitos vetores binários comumente usados são vetores de alta cópia e, portanto, produzir um número de cópia do transgene média alta: cópias de 3.3 para 4,9 em Arabidopsis5.
O número de integrações de T-DNA pode ser diminuído usando vetores binários que têm um número baixo-cópia em a. tumefaciens, tais como BIBAC7, ou através do lançamento de um T-DNA da . tumefaciens cromossoma5. O número médio de integrações do transgene em tais casos é inferior a 25,8,9,10. Devido a ser cópia única na . tumefaciens e também em Escherichia coli, BIBAC-derivados podem manter e entregar as construções tão grandes quanto 150 kb,11.
Compatível com o GW BIBAC vetores10,12 permitir fácil introdução de genes de interesse para o vetor usando Gateway clonagem. O uso da tecnologia de Gateway simplifica o procedimento de clonagem, mas também supera os problemas comuns associados com13,grandes vetores de baixo-cópia-número14, como um baixo rendimento de DNA e uma seleção limitada de restrição exclusiva sites disponíveis para clonagem de7,11. Os derivados de pBIBAC-GW estão disponíveis com qualquer resistência ao glufosinato-amônio (pBIBAC-BAR-GW) ou DsRed fluorescência em revestimentos de semente (pBIBAC-RFP-GW) para seleção em plantas (Figura 1)10,12. Para os dois vetores, um gene de resistência canamicina é usado como marcador de seleção em bactérias.
Combinam os vetores de pBIBAC-GW: design (1) fácil e manipulação genética em e. colie integrações de cópia única (2) intacto em planta com alta eficiência. O rendimento de vetores de pBIBAC-GW em integrações de média 1,7 em Arabidopsis com aproximadamente metade das plantas transgênicas carregando um único integrado T-DNA10.
Expressao de transgenes é um requisito para a maioria dos transgênicos gerados. Expressão do transgene estável pode ser conseguida integrações intactas, cópia única. Trabalhar com plantas transgênicas carregando integrações intactas, cópia única é, no entanto, ainda mais importante, se por exemplo, o objetivo é estudar a eficiência de processos baseados em cromatina, tais como recombinação, mutagênese ou reparação e a dependência destes processos no genoma e a estrutura da cromatina no local da inserção. Para nosso interesse, para estudar a dependência de mutagênese do oligonucleotide dirigido (ODM) no contexto genômico do local, um conjunto de linhas de repórter com integrações intactos, cópia única de um gene repórter de mutagénese foi gerado (Figura 2)10. Usando este conjunto de linhas, foi demonstrado que a eficiência ODM varia entre loci transgénicos integrado em diferentes localizações genômicas, apesar dos níveis de expressão do transgene ser bastante semelhante.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de canamicina monohidratado</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Duchefa</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Duchefa</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>T-3383</td><td></td></tr><tr><td>DB3.1 células competentes</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11782-018</td><td>One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) da Invitrogen ou qualquer outra cepa resistente a ccdB E. coli pode ser usada em seu lugar&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Células competentes DH10B</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Mix de enzimas clonase LR Gateway&nbsp;</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>citrato de tri-sódio dihidratado</td><td>Base Merck</td><td>106432</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA dissódico dihidratado</td><td>Duchefa</td><td>E0511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Bactotriptona</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Honeywell Fluka</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose monohidratada</td><td>Merck</td><td>108346</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetes de eletroporação, 0,1 cm de folga</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1652089</tr><tr><td>Electroporator Gene Pulser</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Calbiochem</td><td>442613</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Maltose monohidratado 90%</td><td>Acros Organics</td><td>32991</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138454</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Meio Skoog</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Glufosinato-amônio (Basta)</td> <td>Bayer</td><td>79391781</td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de restrição</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Bio-Rad</td><td>1610433</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de</td> <td>sódioÁcido</td><td></td> clorídrico Merck 106498 <td></td></tr><tr><td>Membrana</td><td></td> de nylon <td>de</td> 100316 <td></td></tr><tr><td>de borrão Hybond N+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15358</td><td>ou GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM Papel mata-borrão</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-931</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Acetilado BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Merck</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Grosso</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17004401</td><td>ou Sephadex G-50 Médio (17004301)</td></tr><tr><td>Dextran sulfato de sódio sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio&nbsp;</td><td>US Biological</td><td>S5010</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Monohidrato de di-hidrogenofosfato de sódio Tela</td> e <td>de fósforo Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Storage</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Imager de fósforo</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon FLA 7000</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>Stratalinker 1800</td><td></td></tr><tr><td>filme plástico (envoltório de Saran)</td> <td>Omnilabo</td><td>1090681</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Merck</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>marcador de DNA ' Blauw'; Escada de DNA.</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8070</td><td></td></tr><tr><td>marcador de DNA ' Rood'; Escada de DNA</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8080</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de Hexanucleotídeos</td><td>Roche</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Construção Grande</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno selável a quente, transparente</td><td>vários fornecedores</td><td></td><td>a largura do tubo deve ser maior do que a da membrana de borrão</td></tr><tr><td>Selador</td><td></td><td></td><td></td>térmico</tr><tr><td>Filtro de membrana disco</td><td>Merck</td><td>VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Merck</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>Malha de hibridização</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2519</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário bibac-gw

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Ao gerar plantas transgênicas, em geral, o objetivo é ter expressão estável de um transgene. Isto requer única intacta de uma integração do transgene, como cópia multi integrações são frequentemente sujeitas a silenciamento de genes. O vetor binário compatível com o Gateway com base em cromossomos artificiais bacterianos (pBIBAC-GW), como outros derivados de pBIBAC, permite a inserção dos transgenes cópia única com alta eficiência. Como uma melhoria para o pBIBAC original, uma gaveta de Gateway foi clonada em pBIBAC-GW, para que as sequências de interesse podem agora ser facilmente incorporadas a transferência de vector DNA (T-DNA) clonando Gateway. Comumente, a transformação com pBIBAC-GW resulta em uma eficiência de 0,2-0,5%, segundo o qual metade dos transgênicos a transportar uma integração de cópia única intacta do T-DNA. Os vetores de pBIBAC-GW estão disponíveis com resistência ao glufosinato-amônio ou DsRed fluorescência em revestimentos de semente para seleção em plantas e com resistência à canamicina como uma seleção em bactérias. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas usando pBIBAC-GW: a partir de recombinar as sequências de interesse em vetor de escolha, para plantar a transformação com pBIBAC-GW Agrobacterium, seleção dos transgênicos e teste as plantas para integridade e cópia número de inserções usando a DNA mancha. Atenção é dada a concepção de uma estratégia de mancha de DNA para reconhecer integrações de single e multi cópias em único e múltiplos loci.

Usando o sistema de BIBAC-GW, construções de repórter para estudar ODM em plantas foram gerados10. Construções foram projetadas no Gateway de entrada vetor pENTR-gm12 e inseridas no pBIBAC-BAR-GW (Figura 1), usando a reação de recombinação Gateway LR.
Arabidopsis foram transformados com pDM19, um BIBAC-BAR-GW plasmídeo com um repórter de mTurquoise-eYF...

Usando um vetor binário pBIBAC-GW faz gerar plantas transgénicas com inserções de cópia única intactas, um processo fácil. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas de Arabidopsis e teste as plantas para integridade e copiar o número de inserções.

Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

O objetivo geral desta metodologia é gerar plantas transgênicas carregando inserções intactas de cópia única de um DNA de transferência, ou T-DNA, de maneira eficiente. O vetor BIBAC-Gateway é uma ferramenta valiosa para gerar plantas transgênicas que carregam inserções intactas de cópia única de sequências de interesse que mostram expressão gênica estável. Com o vetor BIBAC-Gateway, pode-se usar a tecnologia de recombinação Gateway para inserir sequências de interesse com o mínimo de esforço.Todos os derivados do BIBAC, incluindo os vetores BIBAC-Gateway, são adequados para transferir grandes fragmentos de DNA transgênico para genomas de plantas. Os vetores BIBAC-GW podem ser usados para inserir sequências de interesse em muitos sistemas de plantas, como milho, arroz e tomate. Existem dois plasmídeos BIBAC-GW disponíveis.O plasmídeo BIBAC-RFP-GW contém um gene DsRed que é expresso em tegumentos. O plasmídeo BIBAC-BAR-GW contém um gene que fornece resistência ao glufosinato. Ambos os vetores contêm um gene resistente à canamicina como marcador de seleção em bactérias.Para inserir as sequências de interesse no vetor binário, primeiro prepare a entrada do gateway e os vetores binário

generating-transgenic-plants-with-single-copy-insertions-using-bibac

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Neste vídeo, demonstramos a geração de plantas transgênicas de Arabidopsis expressando transgene estável por meio da transformação gênica baseada em cromossomos artificiais bacterianos binários mediada por Agrobacterium.

Transformação gênica baseada em vetor cromossômico artificial bacteriano binário em plantas de Arabidopsis: uma técnica para gerar plantas transgênicas com inserção de cópia única

Agroinfiltração e agroinfecção PVX são ensaios funcionais de rotina para expressão ectópica transitória de genes nas plantas. Esses métodos são ensaios eficientes em estratégias de efeitoomia (resistência rápida e descoberta genética de avirulência) e cruciais para pesquisas modernas em patologia molecular vegetal. Eles atendem à demanda por uma análise funcional robusta de alto rendimento nas plantas.

Agroinfiltração e Agroinfecção PVX em Batata e Nicotiana benthamiana

Este trabalho descreve um novo método para alvejar seletivamente organelas subcelulares nas plantas, analisadas usando o BioRad Gene Gun.

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

Metodologias de direcionamento de genes podem ser usadas para gerar camundongos transgênicos com alelos knockout, knock-in e marcados.  Aqui, descrevemos um método aprimorado de recombinação em E. coli, que chamamos de 'subclonagem mais inserção', que pode ser usado para gerar vetores de direcionamento de genes personalizados rapidamente.

Subclonagem Além disso Inserção (SPI) - Um Método recombineering Novel para a construção rápida de Gene Segmentação Vetores

Aqui, apresentamos um protocolo de transformar o linho usando Agrobacterium transformação de plantas mediada por via floral-dip. Este protocolo é simples de executar e barato, ainda produz uma taxa de transformação maior do que os actuais métodos disponíveis para transformação de linho.

Floral-Dip Transformação de linho ( Linum usitatissimum) Para gerar Transgênicos Progênies com uma alta taxa de Transformação

Usando o conjunto de DNA, vectores de múltiplos CRISPR podem ser construídos em paralelo numa única reacção de clonagem, tornando a construção de um grande número de vectores CRISPR uma tarefa simples. Tomate raízes peludas são um excelente sistema modelo para validar vetores CRISPR e gerar materiais mutantes.

De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

Aqui, apresentamos um método para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila , substituindo o primeiro exon codificação de genes com drivers de transcrição. O método baseado em CRISPR/Cas9 coloca uma sequência liberada sob o Regulamento endógena de um gene substituído e, consequentemente, facilita a expressão de transctivator exclusivamente em padrões spatiotemporal gene-específico.

Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma

Aqui, apresentamos os protocolos para utilizando o inseto sistema expressão da proteína celular e baculovirus para produzir grandes quantidades de proteínas vegetais secretada por cristalização de proteínas. Um vetor de expressão de baculovirus foi modificado com GP67 ou inseto hemolin peptídeo sinal planta secreção na expressão de proteínas nas células de inseto.

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

Aqui, descrevemos a geração e aplicação de um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana linhas permitindo expressão inducible, tecido-específica nos três os meristemas principais, a meristema apical de atirar, a meristema apical de raiz e o cambium.

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.

Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar mutante materno que acopla uma linha knock-in zpc:cas9 estável com a entrega mediada por Tol2 de de expressão de sgRNA.

Geração de mutantes maternos usando zpc:cas9 knock-in zebrafish

Aprenda a gerar plantas transgênicas com inserções de cópia única intactas usando o vetor binário BIBAC-GW. Este método utiliza tecnologia Gateway para inserir grandes fragmentos de DNA em genomas de plantas como Arabidopsis, milho e arroz.

Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

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