Name: Sinal de nanossondas rápida realce pela síntese de nanopartículas de ouro em Situ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprenda a amplificar sinais de nanossondas em biossensores por redução de ácido cloroáurico in situ. Este método versátil aumenta 100 vezes a detecção de nanopartículas de ouro, prata e óxido de ferro em ensaios colorimétricos.

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Financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (FP/2007-2013) / ERC Grant acordo n. º 615458, o Conselho Sueco de pesquisa e excelência Pronova centro de tecnologia de proteína (VINNOVA - Sueco Agência governamental para sistemas de inovação) é reconhecida com gratidão.

De acordo com as exigências éticas e legais do país de coleção, ou seja, obtiveram-se amostras de soro humano. com a aprovação de um Comitê de ética (ou similar) e com o consentimento por escrito do doador.
1. preparação da solução reforço:
<ol><li>Prepare um 10 mM de tampão de pH 6 MES, suspendendo o MES, sal de sódio em água desionizada. Ajuste o pH a 6 usando uma solução de NaOH 4m.</li>
	<li>Prepare uma solução de4 HAuCl de 10 mM de tampão de pH 6 MES (solução 1) de 5 mM.</li>
	<li>Prepare uma solução de2 1,027 M H2O em 10 mM de tampão de pH 6 MES (solução 2). Nota: Os volumes da solução 1 e 2 de solução depende o número e tamanho de microarrays para ser aprimorado. Por exemplo, um microarray de 10 x 10 mm requer 100 μL total volume (solução 1 + solução 2) Certifique-se de que a área de microarray é em contacto com a solução de realce. Após a diluição, o H2O2 deve ser usado dentro de aproximadamente 30-45 dias.</li>
</ol>2. preparação de nanopartículas:
<ol><li>Preparar 40 nm AuNPs conforme descrito por Bastús et al. 16 brevemente, Injete 1 mL de precursor de4 HAuCl aquosa 25 mM em uma solução fervente de citrato de sódio 2,2 mM (149 mL). Espere até que uma cor vermelho-vinho é observada. Use esta solução de nanopartículas como sementes para etapas de semente-crescimento.</li>
	<li>A 90 ° C, Injete 1 mL de citrato de sódio 60 mM, seguido por 1 mL de HAuCl4 de 25 mM para a semente que contém a solução. Depois de 30 min, a reação é completa. Repita o passo de semente-crescimento cinco vezes até 40 nm nanopartículas são obtidas, como descrito por Bastús et al. 16
</li>
	<li>Medir a absorvância da solução final de nanopartículas para determinar o tamanho das nanopartículas do UV-vis. 17 como alternativa, micrografias de elétron de transmissão (TEM) podem ser adquiridas e utilizadas para determinar o tamanho das nanopartículas.</li>
	<li>Preparar a 90 nm AgNPs conforme descrito por Rivero et al. 18 brevemente, adicionar dimethylaminoborane (DMAB) para uma solução vigorosamente mexida de poli (ácido acrílico, sal de sódio) (PAA) e AgNO3. O volume final da solução é de 50 mL e a concentração final de DMAB, PAA e AgNO3 são 1, 6mm, 10mm e 3,33 mM, respectivamente. Nota: 100 nm IONPs modificados com grupos carboxila e 50 nm SiNPs modificados com grupos carboxila foram comprados.</li>
	<li>Funcionalizar o AuNPs com anticorpos seguindo o protocolo descrito por Puertas et al. 19 brevemente, adicionar 1 mg de COOH-PEG-SH (5000 g·mol− 1) para uma solução de 1.2x10-9 AuNPs M (10 densidade óptica, OD). Ajuste o pH a 12 com uma solução de 4 M de NaOH.<ol>
<li>Deixe a solução incubar durante a noite, a temperatura ambiente (~ 22 ° C), em condições de agita suaves.</li>
		<li>Retire o excesso de PEG por centrifugação a solução a 13800 x g, durante 15 min.</li>
		<li>Resuspenda o pellet com 500 μL de água desionizada.</li>
		<li>Incubar a AuNPs PEG-modificado com 5 μmol N-(3-Dimethylaminopropyl)-n '-cloridrato de ethylcarbodiimide (EDC) e 7.5 μmol de sal de sódio de N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) em 10mm MES de pH 6 de buffer por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Remova o excesso de EDC e sulfo-NHS por centrifugação a solução a 13800 x g por 5 min.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 500 µ l de tampão de pH 6 de MES de 10 mM e adicionar 100 g·mL-1 de anticorpo. Deixe a solução incubar durante 2 h a 37 ° C.</li>
		<li>Retirar o excesso de anticorpos por centrifugação a solução a 13800 x g durante 10 minutos, duas vezes e resuspenda o pellet em 500 μL de 10mm de sódio fosfato pH 7,5, buffer de NaCl 0,3 M. Deixe a solução incube durante 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Remover os anticorpos inespecíficos acoplado por centrifugação a solução a 13800 x g durante 10 minutos, duas vezes e resuspenda o pellet em 500 μL de 1% albumina de soro bovino (BSA) em 10 mM de tampão de pH 6 MES. Incube as amostras a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Lave o excesso de BSA por centrifugação a solução a 13800 x g durante 10 minutos, duas vezes e resuspending a pelota em 500 μL de tampão de pH 6 MES 10 mM.</li>
		<li>Siga as etapas 2.5.1 através de 2.5.9 para a modificação de 5m AgNPs, 0,5 mg de IONPS e 0,5 mg de SiNPs com anticorpo, ajustando as quantidades de EDC e sulfo-NHS adequadamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. vertical fluxo ensaios baseados em papel:
<ol><li>Prepare os microarrays depositando uma gradiente concentração da proteína G na membrana de nitrocelulose papel com uma impressora robótica. Após a impressão, deixe a microarrays secar durante a noite em temperatura ambiente (~ 22 ° C).</li>
	<li>Realizar o ensaio de fluxo vertical com a fechadas em um suporte de filtro de membrana. Fluxo de uma solução de 8 M de AuNPs IgG-modificado usando uma bomba de seringa ultra a uma taxa de 1 mL·min− 1. Repita esta etapa com uma solução de 17 M IgG-modificado AgNPs, 0.1 mg·mL− 1 SiNPs IgG-modificado e 0.1 mg·mL− 1 IONPs IgG-modificado.</li>
	<li>Deixe os microarrays secar à temperatura ambiente (~ 22 ° C) por 30 min e digitalizá-las em um scanner de mesa com uma resolução de 4800 dpi. Salve as imagens como arquivos TIFF de 24-bits de cores.</li>
</ol>4. referência comerciais ensaios baseados em vidro:
<ol><li>Incube duas lâminas de vidro para 120 min para a deteção de componentes alérgeno com 4 amostras de soro humano diferente à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os microarrays com água desionizada.</li>
	<li>Incubar um slide com um anticorpo de IgE de anti-humano conjugado fluorescente à temperatura ambiente (~ 22 ° C) por 30 min. Incubar o segundo slide com IgE anti-humano anticorpo-modificado AuNPs por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os microarrays com água desionizada.</li>
	<li>Medir a intensidade de fluorescência de microarray que foi incubado com anticorpo fluorescente anti-humano IgE com um instrumento de exploração do laser. Digitalizar o microarray que foi incubado com o anti-humano IgE AuNPs anticorpo-modificado com um scanner de mesa para a aquisição do sinal colorimétrico.</li>
	<li>Após a digitalização, incube o microarray com a solução de reforço à temperatura ambiente (~ 22° C) por 5 min.</li>
	<li>Enxágue-o com água desionizada e deixe secar por 10 min à temperatura ambiente (~ 22 ° C).</li>
	<li>Digitalizar o microarray com um scanner de mesa com uma resolução de 4800 dpi para aquisição do sinal colorimétrico. Salve as imagens como cinza de 16 bits, arquivos TIFF.</li>
</ol>5. Microarray incubação com solução de realce:
<ol><li>Pré-misturar a mesma quantidade de solução 1 e 2 de solução ou misturá-los diretamente na superfície do sensor e certifique-se de que a área de interesse sobre o microarray é coberta com a mistura da solução.</li>
	<li>Deixe o sensor incubar a temperatura ambiente com a solução de realce para cima para 5 min. de incubação mais longa, tempo pode render sensibilidade melhorada, bem como maior relação sinal/ruído, especialmente para microarrays baseados em papel.</li>
	<li>Lave o microarray submergindo-o em água desionizada, uma vez por 5 s. deixe-o secar à temperatura ambiente. Nota: O tempo da etapa de secagem depende do material do microarray. Para um microarray baseados em papel, a etapa de secagem requer aproximadamente 30 min. Para um microarray com base em vidro, a etapa de secagem requer aproximadamente 5-10 min.</li>
</ol>6. imagem latente de análise:
<ol><li>Analise as intensidades de fluorescência com a ferramenta de software. Considere todos os resultados que são igual ou superior a 0,3 unidades estandardizar Isac (ISU), seguindo as instruções de uso (DfU) do fabricante do sensor.</li>
	<li>Analise as intensidades colorimétricas, utilizando uma ferramenta de software. Inverta os arquivos de imagem, medir a intensidade de cada ponto e calcular a intensidade média de pixel. Use os valores dos três vias locais para calcular o valor final do sinal como uma média das três intensidades pixel ponto médio.</li>
</ol>

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<li>Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+optimization+of+gold+nanoparticle-based+silver-enhanced+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Atualmente, técnicas de realce de sinal para ensaios com detecção baseada em nano-sonda são ambos enzimáticos12, exigem um segundo conjunto de nanopartículas para a deteção nanosondas21 de destino ou, no caso de técnicas de coloração, são limitadas a o uso de AuNPs ou AgNPs, como detecção de sondas. 22 aqui, um método simples, rápido e livre de enzima é descrito para o realce do sinal dos ensaios de detecção-baseado de nanossondas. Com este método, foi possível melhorar o sinal colorimétrico fornecido por 4 tipos de nanosondas: AuNPs, AgNPs, IONPs e SiNPs.
O fator de amplificação observada para cada conjunto de nanosondas foi de 100-fold, exceto para o SiNPs onde a quantificação do fator de aprimoramento não foi possível devido à falta de sinais de pré-melhoramento. Este factor de intensificação sugere que a eficiência do protocolo é semelhante em todos os tipos de nanossondas. Além disso, quando o protocolo de realce foi executado em um suporte de papel, onde uma série de diluições de uma suspensão de AuNPs das ações foi impresso, observou-se um fator de 10000-fold de amplificação. Anterior ao realce, as manchas visíveis com o menor número de AuNPs foram onde aproximadamente 10000 nanopartículas foram impressos, realce as manchas abrigando nanopartículas de menos de 10 tornou-se visível. 20
As condições estabelecidas para o protocolo de realce aqui apresentado permitiram aproveitando-se da redução da Au3 + Au0 para melhorar o sinal, mantendo-se o ruído de fundo a um mínimo. O reforço pode ser realizado logo após o ensaio é realizado, bem como em Microarrays do que foram armazenados por até vários meses após o ensaio foi realizado. A solução de reforço consiste em uma mistura 1:1 de solução 1 e 2 de solução. Ambas as soluções podem ser previamente misturadas ou misturadas diretamente quando pipetado para o microarray. A diferença entre pré-mistura ou direto mistura afeta apenas a validade da solução de realce. Quando pré-misturados a validade é de 5-7 dias, aumentando para 30-45 dias se não pre-misturada.
Uma análise mais aprofundada dos resultados mostrou que o método de aprimoramento não interfere na análise quantitativa do biosensor. Uma correlação linear entre a intensidade observada e a concentração do analito foi mantida (tabela 1). Os dados obtidos para 4 amostras clínicas pré-caracterizadas usando o imunoensaio de microarray de componente alérgeno com base em vidro, com detecção de fluorescência padrão e Detecção colorimétrica, mostram uma boa concordância entre os dois métodos de detecção. Comparando a intensidade de fluorescência média (IFM) e a média intensidade colorimétrica (MCI), uma média R2 = 0,79 + /-0,08 obteve-se quando os dados são 10-conectado em ambos os eixos. Esta experiência mostrou que o método de reforço pode ser aplicado a um kit comercial se usa as nanosondas para deteção ou pode ser adaptado para detecção baseada em nano-sonda.
A eficácia do método de aprimoramento depende de dois aspectos críticos. É importante garantir que a mistura da solução 1 e 2 de solução é homogênea. Sem uma mistura homogênea, o sensor será em contacto com frações da solução de melhoria onde solução 1 ou 2 é predominante em relação a outras. Isso reduzirá a eficiência da redução da Au3 + Au0, assim, prejudicar a eficiência do reforço. Também é importante ter toda a área de interesse do microarray em contacto com a solução de reforço durante o período de incubação.
Para conseguir ultra-sensível realce de um sinal, um longo tempo de incubação (aproximadamente 5 min) com a solução de melhoria serão necessário. Para evitar o desenvolvimento do ruído de fundo que possa interferir com a aquisição de sinal, a superfície de microarray deve ser previamente bloqueados (por exemplo, BSA, PEG) para evitar a rápida deposição inespecífica de Au0 e consequente formação de um ouro camada.
Uma limitação para o método de realce é a eficácia intrínseca do ensaio. O ensaio requer ter controles positivos e negativos a garantir que o reforço de sinal observado pode ser atribuído ao verdadeiro-positivos resultados. Se houver uma interação não-específica das nanosondas com o alvo, sinais adquiridos após realce não será válido.
Outras técnicas de realce são baseadas em qualquer agregação de nanopartículas ou coloração das nanopartículas com um material que permite a aquisição do sinal melhorado. Promovendo o encontro do número de nanopartículas no local da deteção, a aquisição de sinal será possível também visualmente ou medidas de UV-Vis. 5 estas técnicas de reforço de sinal dependem de um sistema de detecção de duas etapas, a detecção inicial do analito de interesse e uma segunda etapa, onde o repórter é necessário para vincular a detecção inicial de construção. Tais estratégias faltam universalidade devido à exigência de otimização de protocolo acessório específico para cada tipo de ensaio.
As técnicas de realce de coloração, tais como prata, coloração, bem como o protocolo aqui apresentado, permitam o reforço direto das construções de deteção de sinal. No entanto, ao contrário do protocolo que é mostrado aqui, coloração prata só foi mostrado para ser aplicado a AuNPs ou AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
A aplicabilidade desse método provavelmente poderia abranger qualquer ensaio que usa AuNPs, AgNPs, IONPs ou SiNPs, como agentes de deteção. Prosseguir o trabalho está sendo realizado para estudar a aplicação do método em sensores de outras matérias.

A utilização de nanomateriais como nanopartículas de ouro (AuNPs) ou nanopartículas de óxido de ferro (IONPs) permitiu as aplicações em biosensing com versatilidade e sensibilidade melhorada. 1 a pletora de métodos desenvolvidos para a decoração da superfície de nanopartículas com vários ligantes, como tirar proveito de sua superfície elevada à relação do volume, permitiram a concepção de sensores com sensibilidade melhorada. 2 não obstante, uma ferramenta de biosensing é dependente do número de nanosondas necessários para conseguir um sinal detectável. Por exemplo, no caso de 40 nm AuNPs, para adquirir um sinal através de espectroscopia UV-vis, aproximadamente 90 × 106 nanosondas é necessária para detectar eficazmente o alvo de interesse. 3 essa limitação de densidade de nano-sonda pode ser contornada com o uso de amplificação de sinal. Tais estratégias4 pode basear-se na agregação interpartícula ou aglomeração, onde a densidade de nanosondas iniciais é aumentada por acumular um segundo conjunto de nanosondas após o primeiro. 5 aumento do número de nanopartículas em um determinado local na superfície sensor permite visual ou aquisição de sinal de UV-vis. No entanto, a sensibilidade do ensaio será inerentemente ligada à capacidade de direcionamento do segundo conjunto de nanopartículas para o conjunto inicial de nanosondas. Outras estratégias dependem da coloração de ouro e de prata nanosondas. 6 , 7 a coloração é conseguida através da redução de íons de prata para a superfície de nanopartículas, permitindo um visual ou detecção de UV-vis. 8 esses métodos aumentar o sinal de existir ouro ou prata nanosondas por potenciando a plasmon de superfície ressonância do sinal, não dependendo de eventos alvos secundários como métodos de aglomeração interpartícula. No entanto, métodos de coloração prateado só foram relatados com o uso de ouro ou prata nanosondas. 8 , 9
Em 2005, Zayats et al. 10 relataram a redução de íons Au para a superfície de ouro nanosondas para aumentar o sinal de ressonância de plasmon de superfície. Neste trabalho dependente da enzima, peróxido de hidrogênio foi gerado por catálise de glicose oxidase e juntamente com cloreto de cetyltrimethylammonium, permitida a redução do ácido cloroáurico.
Mais recentemente Wang et al. relatou um método de aprimoramento, onde uma camada de ouro é produzida na superfície da nanosondas existentes. 11 estes nanosondas alargadas exibido peroxidase-como a atividade catalítica contra o substrato 3 ', 5, 5 '-tetrametilbenzidina (TMB) que permite a visualização de uma cor azul brilhante olho nu.
Stevens et al . relatado o desenvolvimento de um ensaio de ELISA-baseado plasmônico. 12 após a detecção de um antigénio específico da próstata (PSA) através de uma estratégia de ELISA a tradicional, um anticorpo secundário marcado com catalase foi incubado com o sensor, após o qual o sensor estava imerso em uma solução contendo peróxido de hidrogênio e Ácido cloroáurico. A presença de catalase-modificado anticorpo secundário (resultado positivo) irá promover o consumo de água oxigenada, retardando a redução de Ácido cloroáurico e rendendo quase esférica monodispersas AuNPs com uma cor vermelha. A ausência do anticorpo da catalase-modificado (resultado negativo) permitiu a concentração de peróxido de hidrogênio permaneceu intacto, promovendo assim a redução rápida cloroáurico e rendendo AuNPs com morfologias mal-definidas responsáveis por uma cor azul/roxo . A concentração de peróxido de hidrogênio, determinado pela atividade da catalase, foi mostrada para ser correlacionada com a concentração do analito de interesse. A necessidade de um anticorpo secundário da catalase-modificado e o controle das condições da atividade catalítica são dois fatores que dificultam a universalidade desse método. Além disso, a formação de clusters de ouro, independentes do AuNPs existentes, pode apresentar problemas de ruído de fundo a estratégia de amplificação.
As técnicas acima mencionadas, como também vários outros13,14,15, tornaram possível para biossensores baseados em nano-sonda atingir limites de detecção, a par com as técnicas tradicionais.
Aqui, um método de aprimoramento de ouro romance é demonstrado, onde o sinal de um nano-sonda existente é amplificado por potenciando ou introduzir um sinal de ressonância de plasmon de superfície. Após a deteção é realizada com o uso de ouro, prata, quartzo ou nanopartículas de óxido de ferro, o sensor é permitido para incubar com uma solução de uma mistura de peróxido de hidrogênio e o Ácido cloroáurico em 2-(N-Morpholinos) etanesulfónico ácido tampão de pH 6 (MES). As concentrações dos componentes da solução de realce foram otimizadas para favorecer a deposição de Au0 na superfície da nanosondas existentes. Para todos estudaram tipos de nanossondas, i. e. AuNPs, nanopartículas de prata (AgNPs), nanopartículas de sílica (SiNPs) e IONPs, a formação de uma camada mal-definidas renderam ou aumentada a dispersão da luz, o que resultou em um sinal visível aumento ou detectável. Um aumento de sinal com um fator de amplificação de 100 vezes foi conseguido para nanosondas em microarrays baseada em vidro e papel e o processo leva menos de 5 min para adquirir um sinal. A aquisição de sinal poderia ser feita a olho nu, espectroscopia UV-vis ou imagem ferramentas low-end, tais como uma câmera digital ou um scanner de mesa. Além disso, foi demonstrado que este protocolo de aprimoramento pode ser aplicado facilmente em um ensaio de diagnóstico de alergia comercialmente disponível sem a necessidade de otimização específica.

<table><tbody><tr><td>Ácido cloroáurico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254169 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilaminoborano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>476668 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Poli(ácido acrílico, sal de sódio)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>416037 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de prata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204390 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>100 nm nanopartículas magnéticas</td><td>Ademtech</td><td>021111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm nanopartículas de sílica</td><td>Corposcular</td><td>140510-10</td><td></td></tr><tr><td>COOH-PEG-SH&nbsp;</td><td>RAPP Polymere</td><td>135000-4-32</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.06462&nbsp; EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449&nbsp; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>N-Hidroxisulfosuccinimida sal de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485&nbsp; Solução</td> de peróxido de hidrogênio ALDRICH <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95313 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morfolino)ácido etanossulfônico hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>IgG anticorpo</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483&nbsp; ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>VWR&nbsp;</td><td>422351S</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G</td><td>Thermo Scientific</td><td>21193</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de papel de nitrocelulose</td><td>Whatman</td><td>10402096</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplotter 2.1 impressora robótica</td><td>GeSIM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suporte de filtro</td><td>Merck</td><td>XX3001200</td><td></td></tr><tr><td>PhD2000 Bomba Ultrasyring</td><td>Harvard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner de mesa CannonScan 9000F Mark II</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano IgE Anti-humano IgE modificado AuNPs&nbsp;</td>Scanner de mesa <td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner a laser LuxScan 10/K</td><td>Capital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epson Expression 1600 pro</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112</td><td>Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-IgE humano conjugado com fluorescência&nbsp;</td>Analisador de Imagem <td>Microarray Phadia Thermofisher</td><td>81-1011-01</td><td></td></tr><tr><td>MIA 1.2.4&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sinal de nanossondas rápida realce pela síntese de nanopartículas de ouro em situ

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

O uso de nanosondas tais como ouro, prata, quartzo ou nanopartículas de óxido de ferro como reagentes de detecção em ensaios bioanalíticos pode permitir alta sensibilidade e conveniente leitura colorimétrica. No entanto, altas densidades de nanopartículas são normalmente necessários para a deteção. Os protocolos disponíveis baseado em síntese realce são nanopartículas ou limitadas a ouro e prata ou dependem de otimização e controle preciso enzimático. Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar a leitura colorimétrica de ouro, prata, sílica e óxido de ferro nanosondas. Observou-se que o sinal colorimétrico pode ser melhorado por até um 10000-fold fator. A base para tais estratégias de reforço de sinal é a redução química de Au3 + Au0. Existem várias reações químicas que permitem a redução de Au3 + Au0. No protocolo, do bom buffers e H2O2 são utilizados e é possível favorecer a deposição de Au0 para a superfície da nanosondas existentes, em detrimento da formação de nanopartículas de ouro novas. O protocolo consiste a incubação do microarray com uma solução composta por Ácido cloroáurico e H2O2 no 2-(N-Morpholinos) tampão de pH ácido 6 etanesulfónico após o ensaio de detecção baseada em nano-sonda. A solução de reforço pode ser aplicada a sensores baseados em vidro e papel. Além disso, ele pode ser usado em imunoensaios comercialmente disponíveis como demonstrado pela aplicação do método para um microarray do alérgeno comercial. O desenvolvimento do sinal requer menos de 5 min de incubação com a solução de realce e a leitura pode ser avaliada ao olho nu ou dispositivos de aquisição de imagem low-end como um scanner de mesa ou uma câmera digital.

Depois é realizado um ensaio, usando nanosondas como agentes da deteção, a área de detecção do sensor pode ser preenchida com nanosondas (Figura 1um). Se o número de nanosondas estiver abaixo do limite para uma detecção visual, a detecção do analito será, inicialmente, considerada negativa. Usando o protocolo aqui apresentado (Figura 1b), o sinal das nanosondas é potencializado com a introdução de uma camada mal definida de Au (Figura 1c).
Realizou-se um imunoensaio baseado em papel, concebido para a detecção da proteína G como para mostrar a eficácia do protocolo de reforço (Figura 2). AuNPs, AgNPs, SiNPs e IONPs foram modificados com anticorpos IgG e usados e deteção de agentes. Microarrays de papel foram preparados quanto ter um gradiente de um número de moléculas de proteína G para cada local.
Depois que o ensaio foi realizado, observou-se que IgG AuNPs modificados (IgG-AuNPs) foram capazes de detectar tão baixo como 2 × 105 moléculas por ponto (Figura 2um), IgG AgNPs modificados (IgG-AgNPs) foram capazes de detectar tão baixo como 2 × 104 moléculas por ponto (Figura 2c), IgG modificado IONPs (IgG-IONPs) foram capazes de detectar tão baixo como 2 × 107 moléculas por local (Figura 2e) e IgG modificado SiNPs (IgG-SiNPs) não foram capazes de fornecer um sinal visual ( Figura 2g).
Incubando os microarrays com a solução de realce, foi possível aumentar o sinal pelo 100-fold em todos os tipos de nanopartículas usados. No caso SiNPs, a solução de melhoria, foi possível observar um sinal onde nenhum sinal visual foi observado sem a solução de reforço (Figura 22f 2d, b e 2 h).
Foi avaliada a possibilidade de aplicação do método para um imunoensaio comercial existente. O reforço foi realizado em um imunoensaio de microarray de componente alérgeno com base em vidro. Um conjunto de 4 validado e caracteriza-se amostras de pacientes alérgicos foram avaliadas com o microarray de soro (amostras foram designadas como a, b, c e d). A detecção de fluorométrica padrão deste ensaio foi comparada com coloração com anti-IgE rotulado AuNPs seguido do reforço de sinal (Figura 3). Antes da realce, sem manchas foram detectadas nos microarrays onde a deteção foi realizada com anti-IgE rotulado AuNPs. Depois do realce, vários pontos eram visíveis a olho nu e sua intensidade foi registrada por digitalização de imagem (Figura 3). Com a detecção de fluorescência, uma variedade de pontos foram detectados (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig1.jpg"> Figura 1 . Ilustração das etapas uma microspot sofre da detecção do analito para sinal avançado. (um) dois anticorpos-modificado nanosondas após a detecção de um analito imobilizada em uma microspot, (b) incubação do microarray com o protocolo de realce e semente-crescimento subsequente do anticorpo-modificado nanosondas e ( c) microspot onde o tamanho das nanosondas aumentado após incubação 5 min com a solução de reforço. Esta figura tem sido dapted de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig2.jpg"> Figura 2 . Imagens digitalizadas de microarrays para a detecção de proteínas G. À esquerda de cada microarray são o microspots observados antes da melhoria da detecção realizada com (um) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs e (g), IgG-SiNPs. À direita de cada microarray são o microspots depois do realce de (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPS, (f) IgG-IONPs e (h), IgG-SiNPs. Cada concentração de proteína G foi depositada sobre o microarray em triplicado. Um cálculo do número de proteínas que g foi feito com base na concentração da proteína impresso em cada microspot. Esta figura tem sido adaptada de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57297/57297fig3.jpg"> Figura 3 . Correlação entre a intensidade fluorescente e intensidade colorimétrica obtidos para os ensaios realizados com o ensaio de diagnóstico de alergia comercial. Quer dizer a intensidade da fluorescência (IFM) e significa intensidade colorimétrica (MCI), medida para a detecção de alérgenos nas amostras a, b, c e d. inserções são os dados de log 10 transformado nos intervalos onde observou-se uma correlação linear entre os dois métodos. A intensidade da microspots observada para a detecção baseada no anticorpo fluoróforo-modificado (fluoróforo-Ab) é a emissão de fluorescência. O brilho do microspots observada para a detecção baseado no ensaio de Ab-AuNPs foi obtido após a digitalização do microarray e invertendo a imagem com software de imagem. Microarrays são concebidos de forma a ter triplica vertical com controlos positivos para a deteção de fluorescência na parte inferior da extrema-direita. Os outros três cantos são utilizados para avaliação do software. Analisaram-se imagens em escala de cinza de 16 bits. Esta figura tem sido adaptada de Dias et al. 20 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57297/57297fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Realce de prévia do R2</td>
			<td>R2 depois do realce</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-AuNPs</td>
			<td>8.70E-01</td>
			<td>7.80E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-AgNPs</td>
			<td>9.10E-01</td>
			<td>9.60E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-IONPs</td>
			<td>9.17E-01</td>
			<td>9.30E-01</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-SiNPs</td>
			<td>-</td>
			<td>8.50E-01</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. R2 valores para detecção da proteína G, antes e depois do realce, usando diferentes conjuntos de nanopartículas. Obtiveram-se os valores de2 R depois correlacionando a intensidade das manchas com a concentração do analito medida.

Neste trabalho, é apresentado um protocolo para reforço de sinal da biosensing baseado em nano-sonda. O protocolo é baseado na redução do ácido cloroáurico na superfície do nanosondas existentes que consistem em ouro, prata, quartzo ou nanopartículas de óxido de ferro.

Sinal de nanossondas rápida realce pela síntese de nanopartículas de ouro em Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

O objetivo geral deste procedimento é amplificar os sinais de sondas baseadas em nanopartículas em ensaios realizados em suportes de papel ou vidro. Usando este método, você pode adquirir um sinal colorimétrico para pontos que contêm apenas 10 nanopartículas. A principal vantagem desta técnica é a sua versatilidade.Pode ser aplicado sem grandes modificações a diferentes nanopartículas em papel, vidro e potencialmente outros suportes. Para iniciar o procedimento, prepare pelo menos 10 mililitros de uma solução MES de 10 milimolares em água deionizada. Ajustar o pH da solução para seis com uma solução de hidróxido de sódio de quatro molares.Em seguida, combine um mililitro de 1,2 vezes 10 para a suspensão do nono molar negativo de nanopartículas de ouro de 40 nanômetros com um miligrama de alfa mercapto ômega carboxi PEG e vortex a mistura. Ajustar o pH da mistura a 12 com uma solução de hidróxido de sódio de quatro molares. Mexa delicadamente a mistura em temperatura ambiente durante a noite.Em seguida, centrifugue a mistura a 3.800 vezes G durante 15 minutos e elimine o sobrenadante. Ressuspenda o pellet de nanopartículas de ouro modificadas com PEG em 500 microlitros de água deionizada por pipetagem suave. Em seguida, dissolva cinco micromoles de EDC em 250 microlitros do tampão MES de pH 10 milimolar seis.Dissolva 7,5 micromoles de sulfo-NHS em outros 250 microlitros do tampão MES. Combine essas soluções com as nanopartículas de ouro modificadas com PEG e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Centrifugue a mistura durante cinco minutos e elimine o sobrenadante.Ressuspenda o pellet em 500 microlitros do tampão MES. Adicionar à suspensão uma quantidade suficiente de anticorpos IgG para uma concentração de anticorpos de 100 picogramas por mililitro. Incube a mistura a 37 graus Celsius por duas horas.Centrifugue a mistura por 10 minutos e remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros do tampão MES e repita a centrifugação. Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de um tampão de pH 7,5 de fosfato de sódio 10 milimolar e cloreto de sódio 0,3 molar em água deionizada.Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos. Centrifugue a mistura por 10 minutos duas vezes, conforme descrito anteriormente. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de 1% BSA em tampão MES de pH 10 milimolar e seis e incube a mistura a quatro graus Celsius durante a noite.Centrifugue a mistura por 10 minutos duas vezes. Finalmente, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão MES para obter as nanopartículas de ouro modificadas com IgG. Use uma impressora robótica para depositar microarrays de um gradiente de concentração de proteína G em membranas de nitrocelulose.Em seguida, carregue um microarray em um porta-filtro de aço inoxidável de tamanho apropriado. Conecte uma seringa contendo uma suspensão de oito picomolares de nanopartículas de ouro modificadas com IgG à entrada do porta-filtro. Monte a seringa em uma bomba de seringa.Configure um tubo de 50 mililitros para coletar o fluxo de saída do porta-filtro. Em seguida, passe a suspensão pelo porta-filtro a um mililitro por minuto. Depois, deixe o microarray secar por 30 minutos em temperatura ambiente.Limpe e seque o porta-filtro com água e papel de filtro. Digitalize o microarray seco em um scanner de mesa a 4.800 DPI e salve a imagem como um arquivo TIFF colorido de 24 bits. Em seguida, preparar uma solução de ácido cloroáurico de cinco milimolares e uma solução de peróxido de hidrogénio a 1,027 molares em tampão MES de pH 10 milimolar e seis.Para pré-misturar a solução de realce, coloque valores iguais das soluções de ácido cloroáurico e peróxido de hidrogênio em um tubo de microcentrífuga e misture bem as soluções. Aplique a solução de aprimoramento pré-misturada na superfície do sensor de microarray. Como alternativa, aplique volumes iguais de soluções de ácido cloroáurico e peróxido de hidrogênio na superfície do sensor e misture-os completamente diretamente no sensor.Incube o sensor com a solução de aprimoramento por até cinco minutos e, em seguida, mergulhe o microarray em água deionizada por cinco segundos para enxaguar a solução de aprimoramento. Deixe o microarray secar ao ar livre à temperatura ambiente. Repita este processo para cada microarray a ser aprimorado.Digitalize os microarrays aprimorados e salve as imagens. Em um imunoensaio padrão baseado em papel, nanopartículas de ouro, prata e óxido de ferro modificadas com IgG detectaram concentrações de proteína G em duas vezes 10 elevado à quinta, duas vezes 10 elevado à quarta e duas vezes 10 elevado à sétima molécula por ponto, respectivamente. Nenhum sinal visual foi observado de nanopartículas de silício modificadas com IgG.A incubação dos microarrays em solução de aprimoramento resultou em um aumento de sinal de 100 vezes nas nanopartículas de ouro, prata e óxido de ferro. No caso das nanopartículas de silício, esse aprimoramento permitiu que um sinal visual fosse observado. Esse aprimoramento foi aplicado a um imunoensaio comercial de microarray de componentes de alérgenos à base de vidro de quatro amostras de soro humano.A coloração com nanopartículas de ouro marcadas com anti-IgE e o aumento do sinal tiveram resultados comparáveis ao ensaio fluorométrico padrão. A correlação linear média entre a intensidade média de fluorescência e a intensidade colorimétrica média foi de 0,79. Uma vez aprendida, essa técnica pode ser feita em menos de 10 minutos se executada corretamente.

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