Replicação do requisitado, biblioteca não redundante de estirpe Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon mutantes de inserção

O objetivo geral deste protocolo é gerar cópias de alta qualidade da biblioteca mutante de transposon ordenada e não redundante da cepa PA14 de Pseudomonas aeruginosa conhecida como conjunto PA14NR. Este protocolo preserva a integridade do conjunto PA14NR durante a replicação, gerando cópias de alta qualidade desta biblioteca. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece uma descrição detalhada de todas as etapas envolvidas na replicação da biblioteca, controle de qualidade e armazenamento adequado de mutantes individuais.

Embora este protocolo tenha sido projetado para replicar o conjunto P14NR, ele pode ser adaptado para replicar outras bibliotecas bacterianas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao risco de contaminação durante o processo de replicação. Portanto, este protocolo fornece instruções detalhadas passo a passo para reduzir esse risco.

Nosso laboratório distribui o conjunto PA14NR para a comunidade científica global. E recomendamos que as bibliotecas sejam replicadas pelo usuário final. Para fornecer orientação, oferecemos um protocolo detalhando como gerar cópias de alta qualidade da biblioteca.

A demonstração visual desse protocolo é crítica, especialmente as etapas projetadas para evitar a contaminação cruzada. Para autoproteção, bem como proteção das culturas bacterianas, um jaleco, luvas e máscara devem sempre ser usados ao manusear a biblioteca mutante de inserção de transposon não redundante da cepa PA14 de P aeruginosa, designada conjunto PA14NR. Prepare as placas de ágar LB despejando aproximadamente 60 mililitros de ágar LB fundido em placas retangulares.

Seque as placas em um capuz estéril por aproximadamente uma hora antes de usar. Crie um campo estéril com um bico de bunsen em uma bancada limpa com etanol. E configure os recipientes com soluções apropriadas para esterilização de pinos replicadores.

Remova uma placa mestra do conjunto PA14NR do freezer de 80 graus Celsius negativos e coloque-a sobre gelo seco em uma panela de gelo de 4 litros. Pegue a placa mestra de 96 poços para ser replicada do gelo seco e coloque-a na bancada para permitir um breve descongelamento. Alinhe a placa principal e a placa de ágar com a coordenada A1 de ambas as placas no canto superior esquerdo.

Marcar a posição da coordenada A1 na placa de ágar rectangular. Para esterilizar os pinos do replicador, mergulhe os pinos em 250 mililitros de hipoclorito de sódio a 0,3 a 0,5% por 30 segundos. Bata levemente no replicador para remover o excesso de líquido e mergulhe os pinos em 250 mililitros de água ultrapura estéril por 10 segundos, seguidos por 250 mililitros de etanol a 70% por 30 segundos e 250 mililitros de etanol a 95% por dois minutos.

Esterilize os pinos do replicador segurando o replicador perpendicularmente à chama do bico de bunsen, aproximando-se lentamente da chama até que o etanol acenda e, em seguida, retirando-o imediatamente da chama. A chama se extinguirá assim que todo o etanol queimar. Resfrie os pinos prendendo em uma placa retangular não utilizada contendo ágar LB estéril por 30 segundos.

Enquanto os pinos do replicador estão esfriando, aqueça brevemente a vedação de alumínio da placa mestra do conjunto PA14NR com a mão e, em seguida, retire-a com cuidado, certificando-se de que a vedação não retoque a placa. Use uma pinça para retirar quaisquer restos da vedação de alumínio. Insira os pinos do replicador na placa mestra, empurrando e girando suavemente o replicador em todas as quatro direções para garantir que os pinos entrem em contato com as culturas bacterianas congeladas em cada um dos 96 poços.

Preste atenção extra aos poços localizados na borda externa da placa, empurrando os pinos replicadores contra culturas congeladas nos poços localizados na borda da placa. Coloque suavemente os pinos do replicador na superfície das placas de ágar. Mova o replicador em um leve movimento circular para formar muitos gramados de aproximadamente quatro a cinco milímetros para cada cepa mutante.

Sele a placa mestra do conjunto PA14NR com uma nova vedação de alumínio estéril. Use um rolo de placa para garantir que cada poço e as bordas da placa estejam completamente selados. Retorne a placa mestra de 96 poços para gelo seco.

Depois de manusear o conjunto PA14NR, limpe todas as superfícies de trabalho com 70% de etanol. Transfira a placa de ágar replicada para uma incubadora de 37 graus Celsius e incube durante a noite. Antes de iniciar este procedimento, certifique-se de que a coifa de fluxo laminar esteja livre de equipamentos desnecessários e ligue o soprador da coifa por no mínimo 10 minutos.

Limpe as superfícies do capô e todos os itens colocados no capô usando etanol a 70%. Usando uma pipeta eletrônica de 50 a 1200 microlitros e 12 canais, encha cada poço de um bloco de poço de 12 mililitros de profundidade com 525 microlitros de caldo líquido LB contendo antibióticos apropriados. Em seguida, sele o bloco do poço profundo antes de removê-lo da capela de fluxo laminar.

Em seguida, transfira o bloco de poço profundo cheio de mídia para uma bancada limpa com etanol. Crie um campo estéril com um bico de bunsen na bancada e configure os recipientes com soluções apropriadas para a esterilização do pino do replicador. Mergulhe os pinos do replicador em cada solução, conforme demonstrado anteriormente.

Esterilize com chama os pinos do replicador. Em seguida, resfrie os pinos prendendo em uma placa retangular não utilizada contendo ágar LB por 30 segundos. Coloque cuidadosamente os pinos do replicador na placa de ágar que contém as estirpes mutantes crescidas e verifique se os pinos estão em contacto com todos os 96 mutantes na placa de ágar.

Em seguida, mergulhe os pinos nos poços profundos contendo caldo líquido LB por cinco a 10 segundos. Evite tocar nas laterais dos poços com os pinos. Sele o bloco de poço profundo com uma membrana de vedação respirável estéril.

Use um rolo de placa para garantir que cada poço individual esteja devidamente vedado. Limpe todas as superfícies de trabalho com 70% de etanol após manusear o conjunto PA14NR. Cultive as culturas líquidas inoculadas em um agitador de alta velocidade a 37 graus Celsius e 950 rpm por 15 a 16 horas.

Comece limpando a coifa de fluxo laminar e ligando o soprador da coifa por no mínimo 10 minutos. Limpe todas as superfícies do capô e quaisquer itens colocados no capô com etanol a 70%. Remova as placas de 96 poços do filme plástico.

Retire o rótulo da placa para cada placa e coloque-o ao longo da borda da placa mais próxima dos poços A1 a H1 da placa de destino. Levante levemente a tampa da placa de destino e coloque a etiqueta na borda inferior para exibir a etiqueta quando a placa estiver coberta com uma tampa. Remova o bloco de poço profundo do agitador de alta velocidade e transfira o bloco para a capela de fluxo laminar estéril.

Remova cuidadosamente a membrana de vedação respirável e substitua por uma vedação de alumínio. Gire o bloco de poço profundo em velocidade muito baixa para coletar a condensação. Como a transferência das culturas para as placas de destino apresenta o maior risco de potencial contaminação entre poços, é fundamental seguir cuidadosamente todos os procedimentos para manter a esterilidade.

Retorne o bloco de poço profundo para o exaustor estéril. Usando uma pipeta eletrônica de 50 a 1200 microlitros de 12 canais e pontas filtradas estéreis, adicione 525 microlitros de mistura de caldo líquido de glicerol LB a cada poço. Misture pipetando suavemente 300 microlitros para cima e para baixo três vezes com uma pipeta eletrônica.

Toque as pontas ao lado dos poços, antes de injetar as pontas para evitar gotejamento. Recarregue a pipeta com novas pontas filtradas estéreis e encha a próxima fileira de poços com a mistura de caldo líquido de glicerol LB. Depois que todos os poços tiverem sido preenchidos com a mistura de caldo líquido de glicerol LB, use a pipeta eletrônica de 12 canais e as pontas filtradas para retirar 900 microlitros de mistura de cultura mutante de glicerol de cada linha do bloco de poço profundo e dispense 150 microlitros em poços da linha correspondente nas placas de destino para gerar seis cópias da placa de biblioteca.

Use a vedação de alumínio estéril para cobrir cada placa de destino de 96 poços e use um rolo de placa para selar completamente as bordas da placa e todos os poços. Certifique-se de não cobrir o identificador da etiqueta com o lacre de alumínio. Remova as placas seladas do exaustor e coloque-as em uma superfície plana e plana em um freezer de 80 graus Celsius negativos.

Limpe todas as superfícies de trabalho com etanol 70% após manusear a biblioteca. Usando o protocolo demonstrado neste vídeo, 12 cópias do conjunto PA14NR, incluindo placas de controle que consistem em poços inoculados e não inoculados do tipo PA14 intercalados em um padrão predefinido, foram replicadas. As placas de controle foram inspecionadas visualmente após a replicação em placas de ágar LB para garantir a presença de padrões de crescimento esperados.

38 cepas mutantes foram selecionadas aleatoriamente de uma das cópias recém-geradas do conjunto PA14NR, e a amplificação por PCR usando primers arbitrários foi realizada para confirmar a identidade dos mutantes do transposon. O sequenciamento subsequente dos fragmentos de DNA confirmou a identidade mutante de 35 dos 38 mutantes testados. Uma vez dominada, a replicação de toda a biblioteca leva cerca de 80 horas.

Ao usar este protocolo, é importante ter sempre em mente a esterilidade da área de trabalho. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar cópias de alta qualidade do conjunto P14NR ou de outras bibliotecas bacterianas. Não se esqueça, trabalhar com Pseudomonas pode ser perigoso e equipamentos de proteção individual devem sempre ser usados durante a execução deste protocolo.

Este protocolo preserva a biblioteca mutante não redundante de Pseudomonas aeruginosa PA14, que continua a ser um recurso importante, não apenas para triagem de alto rendimento, mas também como fonte de mutações individuais na maioria dos genes de Pseudomonas aeruginosa.