Name: Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprenda a criar tumores ortotópicos sinogênicos bioluminescentes em camundongos para modelar câncer de próstata andrógeno-dependente e resistente à castração. Este método permite estudar respostas terapêuticas em ambiente clinicamente relevante.

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Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subvenções de saúde Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Abdulkadir Sarki (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) e Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).

Todos os animais procedimentos descritos no presente protocolo devem ser executadas em conformidade com as normas éticas e a aprovação da Universidade apropriada cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC).
1. preparação de materiais cirúrgicos e células de câncer
<ol><li>Antes do dia da cirurgia, autoclave a tesoura microdissecando, pinça Graefe, fórceps do tecido Graefe, porta-agulha com cortadores de sutura e o número apropriado de cortinas. Esterilize agulhas de calibre 28 e uma seringa de 50 µ l de gás de óxido de etileno (Figura 1).</li>
	<li>Antes do dia da cirurgia, células de cultura Myc-CaP em pratos de 10 cm em RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S) numa incubadora 37 ° C 5% CO2 . Para o monitoramento de tumor bioluminescente e/ou fluorescente, transfect 293T células com os vetores apropriados e posteriormente transduce células Myc-CaP com 0,45 µm filtrada lentivirus31. Classificar as células para gerar uma linha celular estável com 100% de positividade de transdução. Nota: Executar toda cultura de tecido em condições estéreis e verifique se todas as linhas de célula livre de micoplasma. A linha de celular de câncer de próstata murino utilizada neste estudo, Myc-CaP32, é transfectada para expressar estàvel tanto luciferase de vaga-lume e mCherry. A Myc-CaP célula linha iss isolada de um c-myc-superexpressão Hi-myc mouse e essas células contêm um receptor de andrógeno amplificado (AR), que são andrógeno-dependentes32 e formar tumores CRPC após castração murino33. Todos os mouses neste estudo são camundongos FVB/NJ machos de 6 e 8 semanas de idade. Linhas de células de câncer de próstata murino alternativo podem ser usadas com os ratos de fundo genético adequado, bem como linhas de células de câncer de próstata humano ou células de câncer de próstata derivado de paciente primário com camundongos imunodeficientes. O número ideal de células por injecção deve ser determinado empiricamente para linha celular alternativo. Além disso, a alternativa modalidades de imagem pode ser utilizada para visualizar tumores, incluindo tomografia por emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética (RM) ou tomografia computadorizada (CT), bem como as boas práticas agrícolas como alternativa à mCherry.</li>
	<li>A noite anterior à cirurgia, coloque matrigel matriz de membrana basal e vermelho de fenol-livre no gelo a 4 ° C para descongelar.</li>
	<li>No dia da cirurgia, recolha as células de lavá-las com solução salina tamponada fosfato (PBS) e desanexando com 0,25% do trypsin-EDTA. Neutralizar a tripsina com RPMI com 10% FBS e 1% P/S.</li>
	<li>Centrifugar as células a 400 x g por 5 min.</li>
	<li>Lavar as células com 10 mL de RPMI sem FBS ou P/S.</li>
	<li>Contar as células e ressuspender as células em PBS em uma concentração de 6.67x107 células/mL (1 × 106 15 células / µ l).</li>
	<li>Adicionar um volume igual de matrigel para criar uma suspensão de células de PBS/matrigel 1:1 em uma concentração final de 1 × 106 células/30 µ l e manter as células no gelo até injeção para evitar a solidificação. Nota: Efectuar injecções intraprostática dentro de 3 h de preparar matrigel suspensões celulares. Se executar a injeções intraprostática em mais de 5 ratos, repita os passos acima para preparar uma suspensão de células frescas matrigel.</li>
</ol>2. preparação do rato pré-operatório
Nota: casa ratos na Universidade animal instalação para pelo menos uma semana antes da cirurgia para permitir a adaptação adequada e minimizar o estresse animal. Etapas 2.1-2.6 são executadas pelo assistente do cirurgião. Todas as etapas cirúrgicas subsequentes são realizadas pelo cirurgião usando luvas estéreis e instrumentos cirúrgicos com técnica estéril.
<ol><li>Anestesia os ratos com isoflurano (2-5% para indução através de câmara, 1-3% para manutenção através do cone de nariz). Verifique se a indução completa pela perda do reflexo de pitada de dedo do pé.</li>
	<li>Pesar os ratos e administrar pelo menos 0,05 mg/kg da buprenorfina analgésico s.c. Nota: O Mouse peso ≥ 20 g é ideal para injeções intraprostática bem sucedidas.</li>
	<li>Aplica lubrificação pomada oftálmica de ambos os olhos para evitar a secura da córnea.</li>
	<li>Raspe todos os pelos do abdome.</li>
	<li>Esterilize o abdômen por três rodadas de aplicação circular do esfoliante cirúrgico utilizando as pastilhas não-aderindo estéril seguidas de toalhetes com álcool estéril. Permitir que o abdômen secar. Nota: Para o resto do procedimento cirúrgico, apenas luvas estéreis e instrumentos cirúrgicos podem contactar o abdômen do mouse esterilizado.</li>
	<li>Transferi o mouse em decúbito dorsal sobre uma superfície limpa em uma almofada de aquecimento diretamente no âmbito do objectivo de um microscópio cirúrgico limpo.</li>
	<li>Cubra o mouse com um pano estéril com um pequeno buraco ao longo do abdômen.</li>
</ol>3. Intraprostática injeção
Nota: Execute todas as etapas cirúrgicas sob condições estéreis. Ajustando o microscópio, o posicionamento do mouse ou qualquer outros objetos não esterilizados devem ser feitos pelo assistente do cirurgião.
<ol><li>Executar um aproximadamente 1cm incisão da pele exterior ao longo da linha mediana do abdômen superior para o pênis e glândulas prepuciais (Figura 1).</li>
	<li>Separe o tecido conjuntivo entre o exterior da pele abdominal e a musculatura abdominal interna, abrindo a tesoura entre as camadas.</li>
	<li>Realize uma incisão semelhante da musculatura abdominal interna durante o uso de fórceps para levantar a musculatura para evitar perfurar os intestinos ou bexiga (Figura 1).</li>
	<li>Localize uma das vesículas seminais bilaterais (figura 1A, branco) / anterior da próstata lóbulos (figura 1A, preto), que são, muitas vezes, posterior, lateral e ligeiramente superior da bexiga (figura 1A, amarelo), mas isto podem variar entre ratos . Os lóbulos anteriores da próstata são translúcidas e anexado para a curvatura menor do brancas vesículas seminais.</li>
	<li>Levante suavemente a ponta da vesícula seminal, usando a pinça de tecido Graefe para criar tensão no tecido, sem perfurar a vesícula seminal (Figura 1E).</li>
	<li>Misturar a solução de matrigel Myc-CaP pipetando gentile (interpretada por assistente do cirurgião), como células podem ter peletizado e Aspire lentamente 30 µ l (1 x 106 células) para a agulha para evitar bolhas de ar.</li>
	<li>Insira cuidadosamente o chanfro do paralelo ao eixo longo do lobo anterior da próstata de agulha. Injecte lentamente 30 µ l para o lobo e retraia lentamente a agulha para evitar vazamento (Figura 1F). Verificar injeção adequada por ingurgitamento do lobo anterior da próstata (Figura 1).</li>
	<li>Segure cuidadosamente a vesícula seminal e lobo da próstata injetado fora o mouse para aproximadamente 30 s para permitir matrigel parcialmente solidificar dentro do lóbulo. Durante este tempo, recolha algum vazamento de solução de célula no abdômen usando um aplicador de ponta de poliéster estéril para prevenir o desenvolvimento de tumor não-ortotópico, sem pressionar no injetado lobo da próstata.</li>
	<li>Retorne cuidadosamente a vesícula seminal e o lobo da próstata injetado no abdómen sem exercer pressão sobre o lobo. Substitua quaisquer tecidos exteriorizados.</li>
	<li>Realize suturas contínuas para fechar a musculatura abdominal interna com as suturas do agulha corte reverso absorvível vicryl 5-0.</li>
	<li>Realize suturas interrompidas para fechar a pele abdominal exterior com suturas de agulha 4-0 nylon monofilamento não absorvível corte reverso. Nota: Staples 9mm esterilizados também podem ser usados para fechar o exterior da pele abdominal. No entanto, em contraste com suturas, eles interferem com qualquer tumor bioluminescente e fluorescente subsequente, sinal de imagem.</li>
	<li>Limpe todas as ferramentas com álcool etílico estéril toalhitas (inauguradas pelo assistente do cirurgião) e colocá-los em um esterilizador de grânulo de vidro para permitir s. 30 as ferramentas para secar antes de usar o mouse próximo.</li>
	<li>Lave a seringa e agulha em soro fisiológico estéril (inaugurado pelo assistente do cirurgião) para evitar o entupimento por matrigel remanescente. Nota: Um assistente do cirurgião deve estar presente para todas as operações, realizar preparação de rato pré-operatória não-estéreis e cuidados pós-operatórios do mouse, bem como como para misturar a solução de matrigel Myc-CaP antes de injeções. Para minimizar o tempo, como cada procedimento de rato intraprostática exigirá 20-30 min, o assistente do cirurgião pode começar a preparar o próximo mouse como o cirurgião é suturar o mouse atual.</li>
</ol>4. pós-operatório Mouse cuidados
<ol><li>Administrar 1 mg/kg do meloxicam analgésico s.c. imediatamente, 24 h e 48 h após a cirurgia.</li>
	<li>Permitir que os ratos se recuperar em uma gaiola com nenhum fundamento colocado na metade do caminho em uma almofada de aquecimento. Monitorar os ratos pelo menos 30 min após a cirurgia até que recupere mobilidade normal e atividade, depois que colocá-los em uma gaiola limpa com comida no chão da gaiola.</li>
	<li>Mais monitorar camundongos diariamente para cicatrização adequada, peso corporal, aliciamento e deambulação após a cirurgia. Ratos separados em gaiolas individuais em quaisquer provas de luta.</li>
	<li>Remova qualquer suturas restantes dentro de 14 dias após a cirurgia.</li>
</ol>5. bioluminescentes Tumor Imaging
<ol><li>Prepare-se estéril filtrada nd+ ou K+ D-luciferina, como descrito pelo fabricante e protegido da luz.</li>
	<li>Injete camundongos intra peritoneally com 10 µ l/g de peso corporal de luciferina.</li>
	<li>Pelo menos 10 min depois, ratos de imagem com um IVIS Spectrum Imaging System, como descrito anteriormente34,35.</li>
	<li>Analise imagens usando o Software de imagem vivendo, como descrito anteriormente34,35. Nota: IVIS análise de imagem é útil para determinar o sucesso injeções intraprostática e desenvolvimento do tumor inicial para normalizar a carga de tumor entre grupos experimentais. No entanto, dependendo da intensidade do sinal fluorescente ou bioluminescente, saturação pode causar um platô na quantificação imagem apesar de um aumento no tamanho do tumor real. Portanto, nas fases posteriores de crescimento do tumor, IVIS imagem pode ser mais útil para determinar a diminuição do tamanho do tumor ao tratamento bem sucedido, em vez de aumentos no tamanho após a saturação da imagem.</li>
</ol>6. tumor coleção, análise do Tumor, sobrevivência Endpoint
<ol><li>Se coletar tumor para análise, humanamente eutanásia em ratos por exposição de CO2 e deslocamento cervical secundário, ou por métodos alternativos de IACUC aprovado e dissecar os tumores do abdome. Tumores devem ser orthotopically localizado na próstata. Nota: Tumores ligado à parede abdominal anterior ou semeado ao longo do abdômen indicam pobre ou com vazamento de injeção intraprostática e não devem ser considerados tumores ortotópico.</li>
	<li>Pese os tumores.</li>
	<li>Calcular o volume do tumor como π/6 × L × W × H (L = comprimento do eixo maior do tumor, W = largura perpendicular, H = altura perpendicular).</li>
	<li>Tumores podem ser analisados pela histologia (correção em formol tamponado a 10% neutro), citometria de fluxo (criar suspensões celulares único), proteína (preparar o tecido lisado no buffer RIPA), ou RNA (imediatamente lugar tecido em RNAlater).</li>
	<li>Para a análise imunológica, também colete os próstata tumor-drenagem pará-aórtica linfonodos (figura 1B, laranja) e o baço. Nota: Se você seguir os ratos para a sobrevivência, o ponto de extremidade deste modelo é definido como o aparecimento de ascite abdominal hemorrágica36 e/ou diminuiu a deambulação, higiene, e/ou Piloereção37. Ratos para análise de sobrevivência recebem analgesia pré e pós-operatória (etapas protocolo 2.2, 4.1) e devem ser monitorados regularmente. Os ratos devem ser separados em gaiolas individuais se qualquer combate ocorre e deve ser humanamente euthanized sobre a aparência de qualquer um das leituras acima de ponto de extremidade.</li>
</ol>7. castração para modelar CRPC
<ol><li>Para modelar o CRPC, executar acima protocolo injeção intraprostática (protocolo as etapas 1 a 5).</li>
	<li>Pelo menos uma semana mais tarde, após o desenvolvimento do tumor, realizar castração cirúrgica através de cauterização, como descrito anteriormente,38.</li>
	<li>Regressão de tumor de monitor e recorrência por imagem bioluminescente. Depois da castração, regressão de tumor ocorrerá dentro de 3 dias e recorrência de tumor ocorrerá dentro de aproximadamente 30 dias, que representa o CRPC.</li>
</ol>

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Os autores não têm nada para divulgar.

Neste manuscrito descrevem o protocolo para efectuar injecções de células de câncer prostático intra cirúrgica. Utilizamos o andrógeno-dependentes e MYC -superexpressão (MYC superexpressão é visto acima de 80-90% de câncer de próstata humano39) linha de celular murino câncer de próstata, Myc-CaP, originalmente isolada da Hi-Myc rato32 ,33. Esta linha de celular foi estàvel transfectada para expressar tanto luciferase e mCherry, para não-invasivo na vivo de imagem tumor bioluminescentes e fluorescente, respectivamente. Castração cirúrgica, mais também foi realizada após o desenvolvimento do tumor andrógeno-dependentes, levando à regressão do tumor e posterior reincidência. Portanto, nós fornecemos detalhes para modelar tanto ortotópico câncer de próstata andrógeno-dependentes e CRPC em um host de imunocompetentes.
Células de Myc-CaP foram injetadas lobo anterior da próstata de ratos. A próstata de rato consiste dos lóbulos da próstata dorsolateral, ventrais e anteriores, e a próstata humana consiste em uma zona periférica, zona de transição e zona central dentro de um único lobo40. Enquanto estudos prévios anatomicamente e histologicamente compararam o lóbulo dorsolateral do mouse ao periférico humano de zona, o site da maioria dos cancros da próstata41e o lóbulo anterior do mouse para a zona central humano42, 43, mais recente e abrangente análise demonstrou que o lobo anterior e lobo dorsolateral exibem padrões de expressão de gene intimamente relacionadas, em comparação com o lóbulo ventral. 44 contínua, desenvolvimento de câncer de próstata tem sido observado no lobo anterior de gemas40, e, para o procedimento intraprostática, o lobo anterior permite a injeção do volume necessário de solução de célula de câncer com vazamento mínimo e variabilidade.
Usando s.c. e transgênica GEM modelos de câncer tem várias falhas e limitações. S.c. tumores cultivados em um TME artificial têm respostas diferenciais para quimioterapias, em contraste com os dois tumores ortotópico da mesma linha de celular e doença humana20,21,22. Isto pode ser devido a vasculatura alterada de tumores s.c., como exemplificado pela sua resposta diferencial para antiangiogênico terapia18,19. Pelo contrário, tumores ortotópico desenvolvem com uma adequada TME, drenagem dos gânglios linfáticos e vasculatura e podem ser executadas com linhas de células murino, permitindo desse modo também a análise de Imunologia do tumor e resposta a imunoterapias.
GEMs transgénicas desenvolvem tumores com uma adequada TME em um host de imunocompetentes, no entanto, estes modelos normalmente simplificar câncer humano através do desenvolvimento de tumores com única ou poucas alterações genéticas29. Uma análise de Myc-CaP e outras linhas de células de câncer de próstata revelou que contivessem muito maiores alterações de número de cópia somática e alterações cromossômicas do que tumores de ratos Hi-Myc e outras gemas do qual eles eram derivadas de29. Além disso, gemas são limitadas pelo aumento do custo e tempo necessário para os ratos de reprodução para realizar experimentos de alimentação suficiente. Modelagem de tumor ortotópico pode superar essas limitações. Linhas de células de câncer de próstata humano e murino contêm muitas alterações genéticas relevantes para doenças humanas29e, como câncer humano, mostram também grande heterogeneidade entre as células individuais de30. Ortotópico murino tumores syngeneic permitam análises imunológicas, enquanto ortotópico tumores xenogénicas humanas permitem análises da terapêutica em células humanas. Finalmente, ao contrário com gemas, célula linhas podem ser modificadas antes de injeção, permitindo a expressão de bioluminescentes ou fluorescente de moléculas de imagem para monitorar o crescimento do tumor, normaliza o fardo de tumor entre grupos experimentais, monitorar a resposta ao tratamento e a Siga a regressão do tumor e CRPC recorrência após castração cirúrgica.
Passos críticos neste protocolo incluem a localização e a externalização da vesícula seminal e anexado lobo anterior de próstata sem danificar outros tecidos ou perfuração da vesícula seminal, executando uma bem sucedida injeção intraprostática da 30 µ l de célula suspensão sem escapamento e coletando corretamente quaisquer fugas para prevenir o desenvolvimento de tumor não-ortotópico em todo o abdômen. A grande limitação de injecções intraprostática é atingir a habilidade técnica necessária para minimizar a variabilidade de tumor entre ratos. Isto é especialmente importante para a modelagem de CRPC, que tem a variável adicionada de castração cirúrgica. Intra-prostatically injetados e castrados ratos devem também ser seguidos de perto para recuperação e efeitos adversos, como eles foram submetidos a duas cirurgias de sobrevivência maior. Outra limitação é o momento de cada injeção intraprostática. Isto pode ser reduzido para baixo como 20 min, e o cirurgião assistente pode preparar o mouse próximo como o mouse atual é ser suturado. Finalmente, ortotópico Myc-CaP tumores são agressivos, crescimento rápido tumores que atingem o ponto de extremidade de sobrevivência em aproximadamente 46 dias (e logo em 35 dias) devido o tumor primário em massa. Estudos que exijam mais lento desenvolvimento de tumor ou tratamentos a longo prazo devem ser otimizados empiricamente para o regime de contagem e tratamento de célula injeção inicial. Em contraste com as limitações do s.c. tumores e pedras preciosas, todas as limitações acima do modelo ortotópico tumor podem ser superadas, e modificações adicionais do protocolo podem ser feitas com baseadas nas necessidades individuais de experimentais.
Como o ortotópico modelo tumor envolve o uso de in vitro-células manipuladas, estas células podem ser modificadas dependendo das necessidades do estudo. Aqui, nós modificamos a estas células para expressar estàvel luciferase e mCherry na vivo tumor monitoramento. Também efetuamos um nocaute CRISPR-Cas9 do supressor tumoral PTEN, para gerar uma linha de celular mais agressivo, clinicamente relevantes que cresce mais rápido como tumores ortotópico (manuscrito em revisão). Com as vantagens do modelo de tumor ortotópico, a capacidade de estudar o câncer de próstata andrógeno-dependentes e CRPC e o potencial para expressar as modalidades de imagem ou nocaute ou overexpress selecionados genes, este protocolo serve como um recurso valioso para todos pesquisa sobre o câncer de próstata.

Câncer de próstata é estimado para ter a maior incidência (161.360 homens) e causar a morte de terceiro-a maioria de câncer masculino (84.590 homens) em 20171. Após o diagnóstico, tumores da próstata são andrógeno-dependentes e são tratados pela prostatectomia cirúrgica, radioterapia e/ou terapia de privação do andrógeno (ADT), no entanto cada tratamento está associado a vários principais morbidades e complicações2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. regressão de tumor após ADT, apesar de quase todos os tumores reincidência como câncer de próstata resistente a castração (CRPC). Nesta fase, aprovadas terapias incluem docetaxel, imunoterapia Sipuleucel-T e a enzalutamide de pequenas moléculas anti-andrógeno abiraterone, ainda não há terapia individual confere uma vantagem de sobrevivência de mais de 5,2 meses11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. portanto, os homens em todos os estágios do câncer de próstata precisam tanto as opções de tratamento melhorado e gestão das morbidades, qual doença pré-clínica ideal de modelagem é crucial.
Com o procedimento correto, linhas de células de câncer de próstata podem ser cirurgicamente instiladas na próstata murino, levando ao desenvolvimento de ambos os tumores syngeneic ou xenogénica ortotópico. Modelagem de tumor ortotópico é ideal para todos os tumor biologia e drogas desenvolvimento pesquisa, permitindo desenvolvimento de tumor com um microambiente do tumor clinicamente representativa (TME). Estudos prévios demonstraram que tumores subcutâneos de (s.c.) tem uma vascularização do tumor alterado, levando a diferenciais e menos respostas clinicamente precisas para antiangiogênico terapias18,19. Além disso, vários estudos têm observado aumentada ou diminuição da eficácia de vários chemotherapeutics no tratamento da mesma linha de célula, dependendo se foi administrada s.c. ou orthotopically, o último dos quais melhor representado o que é visto em humanos câncer de21,20,22. Além disso, apenas em um modelo ortotópico de câncer de cólon, mas não no modelo s.c., tumores produzem as enzimas degradativos corretas necessárias para induzir a metástase23. Finalmente, como imunoterapias continuam a surgir na vanguarda da terapia do câncer, e especialmente como eles ainda têm que fornecer um benefício significativo para o câncer de próstata24,25, syngeneic modelos pré-clínicos com TME preciso e drenagem dos gânglios linfáticos em hospedeiros imunocompetentes são críticos.
Há muitos fatores responsáveis por estes resultados inconsistentes com base no local do tumor. Com uma altura diferente, as células cancerosas estão expostas a diferente endotélio tecido-específica e alteraram a angiogênese, afectando assim o tumor desenvolvimento26,27. Ortotópico tumores com o correto TME permitem a entrega da droga clinicamente relevantes, condições de hipóxicos e avaliação de antiangiogênico terapias28. Enquanto modelos geneticamente modificados (gemas) contêm um TME preciso, requerem tempo tempos para reprodução, custo elevado e são muitas vezes baseiam em manipulações de único ou poucos genes nocauteado ou overexpressed além níveis clinicamente relevantes. Em contraste, as linhas de células de câncer de próstata humano ou murino usadas em tumores ortotópico, como tumores humanos, são geneticamente muito mais complexas dentro de células individuais e na heterogeneidade entre células29,30de exibição. Também ao contrário de pedras preciosas, ortotópico linhas de células de câncer podem ser projetadas para expressar as modalidades de imagem ou aumento ou diminuição dos níveis de outras moléculas de interesse e in vitro e in vivo de resultados experimentais pode ser directamente comparado. Ortotópico tumores também podem ser formados de células derivadas de paciente primárias. Aqui, nós relatamos a metodologia para a realização de injeções intrabenigna de células de câncer de próstata que formam tumores de ortotópico andrógeno-dependentes e, após a castração, se repetirá como ortotópico CRPC.

<table><tbody><tr><td>Linha celular Myc-CaP</td><td>ATCC</td><td>CRL-3255</td><td>Verifique se está livre de micoplasma antes de usar</td></tr><tr><td>Tesoura de micro-dissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Graege</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de tecido Graefe</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha Olsen-Hegar com cortadores de sutura</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; L Seringa 705 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td>Esterilizar por gás óxido de etileno</td></tr><tr><td>28-gauge Agulhas Small Hub RN</td><td>Hamilton</td><td>7803-02</td><td>Estilo de ponta 4, Ângulo 45&deg;, Comprimento 0.75 in. Esterilizado por gás óxido de etileno</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>18875-093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,25% de tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal Matrigel, sem vermelho de fenol, sem LDEV</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>Descongele no gelo em 4&deg; C durante a noite antes do uso</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>11695-0500-2</td><td>Adquirido do Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM)</td></tr><tr><td>26 seringa de calibre 5/8</td><td>BD</td><td>309597</td><td>Para injeções de meloxicam e buprenorfina</td></tr><tr><td>Cloridrato de buprenorfina 0,3 mg/mL</td><td></td><td>12496-0757-5</td><td>Substância controlada, adquirida da Northwestern University CCM</td></tr><tr><td>Oftálmica lubrificação de pomada</td><td>Akron</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Esfoliante cirúrgico Betadine (iodopovidona, 7,5%)</td><td>Produtos Purdue</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas estéreis não aderentes</td><td>Moore Medical</td><td>10775</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes estéreis com álcool</td><td>Microscópio cirúrgico Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Stemi DV4</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores estéreis com ponta de poliéster</td><td>Puritan</td><td>25-806 1PD</td><td></td></tr><tr><td>5-0 vicryl absorvível suturas de agulha de corte reverso</td><td>eSutures</td><td>J493G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 fio de nylon monfilamento inabsorvível suturas de agulha de corte reverso</td><td>eSutures</td><td>699H</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas de vidro</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina estéril 0,9% cloreto de sódio</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-02</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Eloxiject) 5 mg / mL</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6925-1</td><td>Adquirido da Northwestern University CCM</td></tr><tr><td>D-luciferina Firefly, monohidrato de sal de sódio Goldbio</td><td></td><td>LUCNA</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cauery caneta cirúrgica</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>CD3&épsilon; anticorpo (clone 2GV6)</td><td>Ventana</td><td>790-4341</td><td></td></tr><tr><td>Calibre</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo do receptor de andrógeno</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9030-P1</td><td>1:500 diluição de coloração</td></tr><tr><td>Anticorpo sinaptofisina (clone Z66)</td><td>Life Technologies</td><td>18-0130</td><td>1:200 diluição de coloração</td></tr></tbody></table>

um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Modelagem de tumor ortotópico é uma ferramenta valiosa para pesquisa do câncer de próstata pré-clínicos, como tem várias vantagens sobre os dois subcutânea e geneticamente modificado geneticamente modelos do rato. Ao contrário dos tumores subcutâneos, ortotópico tumores contêm vasculatura clinicamente mais precisa, microambiente do tumor e respostas a várias terapias. Em contraste aos modelos do rato geneticamente modificados, ortotópico modelos podem ser realizados com menor custo e em menos tempo, envolvem o uso de mouse altamente complexo e heterogêneo ou linhas de células cancerosas humanas, prefiro que única alterações genéticas e estas células linhas podem ser geneticamente modificados, tais como express agentes de imagem. Aqui, apresentamos um protocolo para cirurgicamente, injetando uma linhagem de células de câncer de próstata murino luciferase - e mCherry-expressando no lobo anterior da próstata de ratos. Estes ratos desenvolveram ortotópico tumores que foram monitorados não invasiva na vivo e ainda mais analisaram para tumor volume, peso, sobrevivência de rato e infiltração imune. Além disso, ortotópico tumor-rolamento ratos foram castrados cirurgicamente, levando a regressão do tumor imediata e subsequente recorrência, representando o câncer de próstata resistente a castração. Embora a habilidade técnica é necessária para efectuar este procedimento, este modelo ortotópico syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e resistente a castração é de grande utilidade para todos os investigadores no campo.

Neste manuscrito, cirurgicamente injetamos a linha celular de câncer de próstata murino, Myc-CaP, no lobo anterior da próstata (figura 1A), levando ao desenvolvimento de tumores de próstata ortotópico com um TME clinicamente relevante e o correto próstata-drenagem dos gânglios linfáticos (figura 1B). Esta foi realizada usando tesouras microdissecando, Graefe fórceps, Graefe fórceps do tecido, um porta-agulha com cortadores de sutura e uma seringa de 50 µ l, com uma agulha de calibre 28 (Figura 1). Após executar um aproximadamente 1 cm da linha média incisão abdominal acima as glândulas prepuciais (Figura 1), uma vesícula seminal e anexado lobo da próstata anterior foram localizados e exteriorizado (Figura 1E) e 30 µ l (1 x 106 células) de um Suspensão de células de PBS/matrigel 1:1 foi injetado a próstata (Figura 1F), inicialmente verificada pelo ingurgitamento do lobo e a falta de escapamento (Figura 1).
Para monitorar o crescimento do tumor ortotópico, nós estàvel transfected células Myc-CaP para expressar tanto luciferase de vaga-lume e mCherry, permitindo a tumores a ser seguido por não-invasivo na vivo bioluminescência (Figura 2A) e fluorescência (Figura 2B), respectivamente. Uma limitação desta imagem é que, dependendo da força do sinal, quantificação de imagem pode saturar enquanto o tumor continua a aumentar de tamanho. Portanto, com intensidades de sinal elevado, esta imagem na vivo é mais útil para normalizar inicialmente fardo de tumor através de grupos experimentais e para depois determinar reduções no tamanho do tumor após tratamentos experimentais. Modalidades de imagem adicionais também podem ser utilizadas, como o pequeno animal, ressonância magnética, PET ou tomografia.
Ortotópico tumores foram dissecados do abdome no dia 30, após a injeção intraprostática (Figura 3A). Ortotópico tumores devem ser localizados no site do lobo anterior da próstata. Tumor massas ao longo do abdômen ou fixada na parede abdominal anterior indicar vazamentos e injeção intraprostática imprópria. Com a técnica adequada, tumor volume (Figura 3B) e peso (Figura 3) podem ser gravadas com o erro-padrão relativamente pequeno. No entanto, como observado, haverá alguma variabilidade com massas de tumor de pequenas e grandes. Portanto, o uso inicial de pré-tratamento de imagem quantificação para equalizar a carga de tumor entre armas experimentais é crítico para todos os experimentos. Além disso, como estas células de câncer murino foram injetadas nos imunocompetentes camundongos FVB/NJ, o TME pode ser analisado por imuno-histoquímica (IHC) ou citometria de fluxo ou de outras técnicas para células T CD3 (Figura 3D) (ou outros tipos de células imunes). Finalmente, este modelo fornece um ponto de extremidade do objetivo de sobrevivência, como o tumor primário grandes causas massa hemorrágica ascite abdominal36 (Figura 3E) e/ou diminuição da deambulação, higiene, e/ou Piloereção37. Ocasionalmente, a morte também pode ser causado pelo crescimento tumoral, bloqueando a saída de urina.
Finalmente, este modelo pode ser utilizado para estudar tanto o câncer de próstata andrógeno-dependentes e o CRPC, o último dos quais confere prognóstico pobre e precisa de opções de tratamento de novela. Após o desenvolvimento do tumor ortotópico, ratos foram cirurgicamente castrados, como descrito anteriormente,38. Como esta é a segunda cirurgia de sobrevivência maior, um cuidado especial deve ser dada para monitorar a recuperação e quaisquer efeitos adversos ou complicações. Dentro de 3 dias após a castração, observou-se regressão do tumor forte, seguido de recorrência do tumor subsequentes após cerca de 30 dias, representando CRPC (Figura 4A). CRPC tumores podem ser dissecação e analisaram histologicamente e não exibem qualquer diferenciação neuroendócrina, como manter altos níveis de AR e são negativos para o marcador neuroendócrino, Sinaptofisina (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig1.jpg"> Figura 1: lobo Anterior da próstata, drenagem dos gânglios linfáticos e representante técnica para injeções intraprostática celular. Imagens do (A) lobo da próstata anterior direita (preto, *), anexado a vesícula seminal direita (branco), certo testículo e do tecido (verde) e bexiga (amarelo), (B) bilateral próstata-drenagem pará-aórtica linfonodos (laranja), (C) tesoura microdissecando, Graefe fórceps, Graefe fórceps do tecido, uma porta-agulha com cortadores de sutura e 50 µ l seringa com agulha de calibre 28 (esquerda para a direita), (D) incisões de linha média, vesícula seminal de (E) e lobo anterior da próstata exteriorização, (F), injeção intraprostática e ingurgitamento (G) do lobo anterior da próstata. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig2.jpg"> Figura 2: No vivo imagem bioluminescentes e fluorescente tumor. (A) e (B) Luciferase - mCherry-expressando tumores ortotópico Myc-CaP foram fotografadas usando um espectro de IVIS Imaging System. Bioluminescência foi quantificada pelo fluxo total (fótons/s). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig3.jpg"> Figura 3: análises de tumor ortotópico por tumor volume, peso, histologia para infiltração imune e sobrevivência. Ortotópico tumores foram dissecados no dia 30, após a injeção intraprostática e analisados pelo (A) de imagem, (B) tumor volume bruto (π/6 × L × W × H; L = comprimento do eixo maior do tumor, W = largura perpendicular, H = altura perpendicular), peso de tumor (C) , (D) CD3 IHC (barra de escala = 100 µm) e (E) de sobrevivência, com o ponto de extremidade objetiva como a aparência de hemorrágica abdominal ascite. (A-B) Dados representados como média ± erro padrão da média. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57301/57301fig4.jpg"> Figura 4: injeções Intraprostática com castração cirúrgica subsequente para modelar tanto o câncer de próstata andrógeno-dependentes e o CRPC. (A) rolamento ortotópico luciferase-expressando tumores de ratos foram pelo bioluminescência pré e pós castração (Cx), e (B) se repetiu CRPC tumores foram dissecados (preto = ortotópico tumor da próstata; amarelo = bexiga) e analisados por H &amp; E, AR IHC e Sinaptofisina IHC (com controlo positivo murino) (barra de escala = 50 µm). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57301/57301fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O objetivo do presente protocolo é demonstrar a injeção intrabenigna de células de câncer de próstata, com posterior castração. Ortotópico modelos pré-clínicos de câncer de próstata andrógeno-dependentes e resistente a castração são críticos para estudar a doença no contexto de um microambiente do tumor clinicamente relevantes e um host imunocompetentes.

Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma injeção intraprostática de células cancerígenas murinas para induzir a formação de tumores ortotópicos singênicos que podem modelar câncer de próstata dependente de andrógenos e resistente à castração. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do câncer de próstata, como o que impulsiona o desenvolvimento do câncer de próstata e quais tratamentos funcionam melhor na eliminação desses tumores. As principais vantagens dessa técnica são que os tumores ortotópicos são geneticamente mais complexos, se desenvolvem em um microambiente tumoral clinicamente representativo e podem ser geneticamente modificados antes da injeção.As implicações dessa técnica se estendem à terapia do câncer de próstata humano, pois os tumores ortotópicos respondem às terapias de maneira semelhante à observada em pacientes humanos. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, aplique pomada nos olhos do camundongo e raspe todo o pelo do abdômen do animal. Esterilize a pele exposta com três rodadas de esfoliação cirúrgica usando compressas estéreis não aderentes, seguidas de lenços umedecidos com álcool estéreis.Quando a pele estiver seca, coloque o mouse em decúbito dorsal em uma superfície limpa sobre uma almofada de aquecimento diretamente sob a objetiva de um microscópio cirúrgico limpo. E cubra o animal com uma cortina estéril com um pequeno orifício cortado sobre o abdômen. Faça uma incisão de um centímetro na pele externa e na musculatura abdominal interna ao longo da linha média do abdômen superior ao pênis e às glândulas prepuciais.Localize uma das vesículas seminais bilaterais e os lobos anteriores da próstata anexados que são tipicamente posteriores, laterais e ligeiramente superiores à bexiga Peça a um assistente para misturar a solução de células cancerígenas MIC-CAP Matrigel com pipetagem suave e aspirar lentamente 30 microlitros de células em uma agulha de calibre 28 conectada a uma seringa de 50 microlitros. Em seguida, usando a pinça de tecido Graefe, levante suavemente a ponta de uma vesícula seminal para criar tensão no tecido sem perfurar a vesícula e insira cuidadosamente o chanfro da agulha paralelo ao eixo longo do lobo anterior da próstata. Injete lentamente todo o volume de células no lobo, seguido de uma retração lenta da agulha para evitar vazamentos.Uma injeção bem-sucedida será aparente por um ingurgitamento do lobo anterior da próstata. Mantenha com cuidado e firmeza a vesícula seminal e o lobo da próstata injetado fora do camundongo por aproximadamente 30 segundos para permitir que o Matrigel se solidifique parcialmente dentro do lóbulo. Use um aplicador estéril com ponta de poliéster para coletar qualquer vazamento de solução celular no abdômen para evitar o desenvolvimento de tumor não ortotópico.Uma injeção intraprotética precisa é fundamental para o desenvolvimento de tumores não ortotópicos. Tomar cuidado extra para evitar perfurar a vesícula seminal, injetar lentamente a suspensão de células cancerígenas e coletar qualquer vazamento de células aumentará o sucesso deste procedimento. Agora, retorne suavemente a vesícula seminal e o lobo injetado ao abdômen sem pressionar o lobo e substitua os tecidos externalizados.Usando suturas de agulha de corte reverso absorvíveis vicryl 5-0, feche a musculatura abdominal interna com pontos contínuos seguidos de fechamento da pele abdominal externa com pontos interrompidos usando suturas de agulha de corte reverso não absorvíveis de monofilamento de náilon 4-0. Em seguida, administre analgesia pós-operatória e coloque o camundongo em uma gaiola sem cama a meio caminho em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recuperação total. A transfecção estável de células Myc-CaP para luciferase de vaga-lume e expressão de mCherry permite que os tumores de próstata sejam seguidos por bioluminescência e fluorescência não invasivas in vivo.Aqui, são mostrados tumores representativos dissecados do abdômen no dia 30 após a injeção intraprostática Com a técnica adequada, o volume e o peso do tumor podem ser registrados com um erro padrão relativamente pequeno, embora seja esperada alguma variabilidade entre pequenas e grandes massas tumorais. As células cancerígenas murinas injetadas intra-prostaticamente também podem ser analisadas por imuno-histoquímica para a presença de células T CD3-positivas infiltrantes de tumor ou outras células imunes de interesse.Além disso, este modelo fornece um desfecho de sobrevida objetivo, pois a grande massa tumoral primária causa ascite abdominal hemorrágica e/ou diminuição da deambulação e/ou piloereção. A castração três dias após a injeção intraprostática resulta em regressão robusta do tumor, seguida por eventual recorrência do tumor após aproximadamente 30 dias, representativa do câncer de próstata resistente à castração. A dissecção e a análise histológica de tumores de câncer de próstata resistentes à castração não revelam diferenciação neuroendócrina, pois os tumores mantêm altos níveis de receptores de andrógenos e são negativos para o marcador neuroendócrino sinaptofisina.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 20 a 30 minutos, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de administrar analgésicos pré e pós-operatórios e realizar todas as cirurgias usando técnica estéril e com o auxílio de um assistente cirúrgico. Após esse procedimento, outros métodos como imuno-histoquímica, citometria de fluxo e avaliação do volume e peso do tumor e sobrevivência animal podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre respostas a imunoterapias e outras terapias experimentais.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como injetar células de câncer de próstata no lobo anterior da próstata de camundongos para eventual castração cirúrgica e regressão tumoral e análise de recorrência. Não se esqueça de que trabalhar com células cancerígenas pode ser extremamente perigoso e há precauções como usar o equipamento de proteção individual correto que sempre deve ser tomado durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra um modelo ortotópico de câncer de pâncreas que utiliza Matrigel para entrega celular localizada e imagens de bioluminescência in vivo para monitoramento não invasivo da progressão do tumor. O modelo ortotópico é adequado para modelos singênicos e de xenoenxerto e pode ser usado em ensaios pré-clínicos para investigar o impacto de novas terapias anticâncer no crescimento do tumor pancreático primário e metástase.

Modelo de camundongo com câncer de pâncreas ortotópico bioluminescente: uma técnica não invasiva para monitorar a progressão do câncer em camundongos

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para administrar injeção intraprostática de células de câncer de próstata em um modelo de camundongo. Modelos murinos ortotópicos podem ser usados para estudar a origem da doença e a resposta às terapias de tratamento em um ambiente não invasivo e clinicamente relevante.

Injeção intra-prostática de células cancerígenas: uma técnica para entregar células cancerígenas para estabelecer o modelo ortotópico de camundongo com câncer de próstata

Para demonstrar imagem molecular do câncer MR com um pequeno peptídeo alvo MRI agente de contraste específico para proteínas do plasma coagulado no estroma tumoral em um modelo de câncer de próstata do rato.

MR Imagem Molecular do cancro da próstata com um pequeno Molecular CLT1 Peptide alvejado agente de contraste

Este modelo ortotópico de cancro de próstata humana permite a quantificação do tamanho do tumor, as células tumorais, e a formação de metástases distinta circulante para o pulmão. Como as células deve escapar o principal órgão, entrar na corrente sanguínea, e implantar em um site secundário, este modelo recapitula efetivamente o cenário em seres humanos.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Este manuscrito detalha um método usado para gerar xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de próstata (PDXs) a partir de células tumorais circulantes (CTCs). A geração de modelos PDX a partir de CTCs fornece um modelo experimental alternativo para estudar o câncer de próstata; o tumor mais comumente diagnosticado e uma causa frequente de morte por câncer em homens.

Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

Este manuscrito descreve os protocolos de próstata micro-dissecção e castração cirúrgica no rato de laboratório. Nós também retratam resultados representativos produzidos por estes protocolos. Finalmente, discutimos as vantagens e utilização desses protocolos.

Murino próstata Micro-dissecção e castração cirúrgica

O câncer de próstata é a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Um modelo de câncer ortotópico fornece uma abordagem útil para entender a biologia do câncer de próstata e avaliar a eficácia dos regimes terapêuticos. Este protocolo descreve as etapas detalhadas necessárias para estabelecer um modelo ortotópico de camundongo com câncer de próstata.

Pré-clínica Ortotópico Modelo murino de cancro da próstata humano

Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga ortotópico de murídeo em Ratinhos C57BL / 6J e a monitorização do crescimento do tumor.

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

Este protocolo descreve um método recentemente estabelecido para a entrega do vírus para a próstata murino. Usando tecnologia CRISPR/Cas9, superexpressão do gene ou entrega de recombinase Cre, a técnica permite ortotópico alteração da expressão gênica e implementa um modelo de romance do rato para câncer de próstata.

Entrega de vírus de CRISPR guias de próstata murino para alteração do Gene

Apresentamos um modelo de câncer de mama murino ortotópico e modelo de mastectomia radical com tecnologia de bioluminescência para quantificar a carga do tumor para imitar a progressão do câncer de mama humano.

Gerar um modelo de câncer de mama metastático murino ortotópico e realizando a mastectomia Radical murino

Aqui, apresentamos um protocolo para a injeção intracardíaca de células humanas de câncer de próstata para gerar um modelo de camundongo com lesões de metástase óssea.

Injeção intra-cardíaca de células humanas de câncer de próstata para criar um modelo de xenoenxerto de metástase óssea em camundongos

Aprenda a criar tumores ortotópicos sinogênicos bioluminescentes em camundongos para modelar câncer de próstata andrógeno-dependente e resistente à castração. Este método permite estudar respostas terapêuticas em ambiente clinicamente relevante.

Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente (Vídeo) | JoVE Journal

Um modelo murino de ortotópico bioluminescentes e fluorescente Syngeneic de câncer de próstata andrógeno-dependentes e castração resistente

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