Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços

O objetivo geral deste modelo é criar um fenótipo de neurotrauma clinicamente relevante em um formato de 96 poços para facilitar a comparação eficiente e simultânea de lesões sofridas em várias condições experimentais. O objetivo principal deste modelo é permitir triagens fenotípicas de descoberta de drogas de alto conteúdo em neurotrauma, com neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. As placas usadas neste modelo mantêm a geometria de placa de 96 poços padrão da indústria, mantendo sua compatibilidade com as máquinas de triagem de alto conteúdo existentes, como braços robóticos e microscópios automatizados.

Para começar, coloque uma placa sem fundo de 96 poços com o lado inferior para cima dentro de um limpador de plasma de 200 watts por 60 segundos em alta potência. Em seguida, coloque a placa em 200 mililitros de 1,5% APTES recém-preparado em água deionizada, com o lado inferior voltado para baixo, por 20 minutos em uma hotte. 10 minutos após o início da incubação, use uma pinça para posicionar uma membrana de silicone tratada com plasma em cima de um retângulo de papel manteiga de 7,5 por 11 centímetros e alinhe uma placa de alumínio de 7,5 por 11,05 centímetros na parte inferior da braçadeira de fabricação da placa.

Em seguida, use uma pinça para alinhar a membrana de silicone e o papel manteiga na placa de alumínio. No final do período de revestimento, remova a placa sem fundo do banho APTES e sacuda o excesso de solução. Mergulhe a placa sem fundo em dois banhos-maria deionizados consecutivos de 200 mililitros por cinco segundos cada mergulho e sacuda o excesso de água.

Após a secagem completa com ar comprimido, coloque a placa sem fundo na parte superior da braçadeira de fabricação da placa e feche suavemente a braçadeira para pressionar a placa sem fundo e o silicone juntos. Para alinhar o bloco penetrador, use stage clamps para prender a placa no stage do dispositivo de alongamento sob uma câmera com uma transmissão ao vivo e coloque uma luz de cúpula sobre o dispositivo. Inicie o software de controle do instrumento no computador conectado ao dispositivo de lesão e clique na janela Iniciar para executar o projeto de neurotrauma in vitro.

Na janela do projeto, clique duas vezes nos instrumentos virtuais do controle de movimento e do rastreador de posição. Feche a gaiola ao redor do dispositivo de lesão e clique na seta no instrumento virtual de controle de movimento para executar o instrumento. Clique perto da parte inferior para abaixar o stage para dentro de dois milímetros de contato com os indentadores e, em seguida, clique em parar para parar o instrumento virtual.

Na janela do projeto, clique com o botão direito do mouse em Axis One e clique em Interactive Test Panel. Insira 500 unidades no campo Posição de destino na janela que aparece para definir o tamanho do passo para 50 micrômetros. Em seguida, clique em Ir repetidamente, até que a placa entre em contato com qualquer recuo, verificando se há contato na imagem ao vivo exibida pela câmera.

A posição vertical do palco será relatada no canto superior esquerdo da janela do painel de teste interativo. Abaixe ainda mais a placa até que todos os poços tenham feito contato com os indentadores, movendo a câmera e o palco conforme necessário para visualizar toda a placa. Observe a posição do palco vertical relatada quando todas as postagens estão em contato e feche o painel de teste interativo.

Em seguida, execute o instrumento virtual de controle de movimento e clique em Superior para levantar o palco, usando o botão de parada para parar o instrumento virtual quando o palco estiver em posição. Abra a porta para desativar o dispositivo, depois solte o parafuso seth no canto que fez contato primeiro para abaixar o canto e aperte o parafuso oposto para levantar o canto que fez o contato por último. Repita o bloco abaixando, observando e ajustando até que a placa entre em contato com todos os penetradores simultaneamente.

O alinhamento cuidadoso do bloco penetrador é importante para obter uma lesão uniforme em todos os poços da placa. Abra a porta para desativar o dispositivo novamente e insira os parafusos de amarração em seus orifícios no bloco do penetrador. Em seguida, aperte os parafusos na posição e observe a posição do estágio relatada pelo painel de teste interativo quando a placa faz contato.

Para esticar a placa, altere o nome do arquivo no campo Caminho do arquivo no instrumento virtual de verificação de posição para um nome de arquivo exclusivo e clique na seta Executar. Defina a profundidade e a duração do recuo e os campos Lesão e Duração da lesão no instrumento virtual do painel de controle de movimento. Com a placa na posição zero, execute o instrumento virtual do painel de controle de movimento e clique em Ferir para recuar a placa.

Clique em Superior para mover o palco para cima, clicando em parar quando a placa estiver na posição superior e abra a porta para desativar o dispositivo de lesão. Em seguida, inspecione o histórico de deslocamento do estágio apresentado no instrumento virtual do rastreador de posição para confirmar se o deslocamento máximo especificado foi aplicado e exporte os dados para um programa de planilha apropriado. Para avaliar o estiramento da membrana de silicone, após o tratamento com plasma, coloque a placa em uma superfície macia e aplique a pequena saliência em um carimbo com tinta de um marcador permanente.

Insira o carimbo no primeiro poço a ser testado e bata para garantir uma boa transferência de tinta. Quando todos os poços tiverem sido stamped, coloque a câmera de alta velocidade em um suporte de lança sobre o dispositivo de lesão com a lente ajustada para o menor F-stop numerado para que o campo de view contenha 12 penetradores em uma grade de três por quatro. Com o local na posição de ponto zero, clique no botão de gravação no software da câmera para que ele leia o gatilho e acenda a luz axial difusa brilhante.

Em seguida, recue a placa como acabamos de demonstrar e desligue a luz axial. Para ferir uma cultura de células, adicione 100 microlitros de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos tratados com laminina a cada poço da placa tratada com plasma e permita que as células se fixem ao fundo da placa por 15 minutos em temperatura ambiente antes de colocar a placa na incubadora de cultura de células. Após dois a três dias de cultura, prenda a placa no estágio do dispositivo de lesão e ajuste a posição da tampa para prender a placa sem expor as culturas ao ar ambiente.

Em seguida, com a placa na posição de ponto zero, recue a placa conforme demonstrado. Uma cultura ideal não lesionada terá poucos ou nenhum aglomerado de mais de cinco células, e os neuritos serão individuais, longos, delgados e curvos, com pouco ou nenhum beading. Em condições ideais, a viabilidade das culturas deve aproximar-se da viabilidade especificada na ficha técnica do fabricante, e as culturas em silicone devem assemelhar-se às mantidas em substratos de cultura rígidos convencionais.

O aumento da densidade celular aumenta o número e o tamanho dos aglomerados que se formam na cultura, enquanto o aumento da concentração de laminina normalmente neutraliza esse efeito. Em culturas lesionadas com um pico de tensão de 57%, quatro horas após a lesão, os neuritos são encurtados ou ausentes, e alguns têm grânulos com aglomeração demonstrada pelas células viáveis restantes. Notavelmente, os tratamentos com laminina em doses mais altas reduzem a gravidade da lesão nas culturas de células de maneira dependente da concentração, como evidenciado pelo aumento do comprimento dos neuritos e da viabilidade celular nas culturas tratadas com laminina em doses mais altas.

Ao tentar este procedimento, é importante considerar os prazos de entrega. Por exemplo, a desintoxicação da membrana leva três dias e as placas fabricadas devem curar durante a noite antes do uso. Não se esqueça de que o dispositivo de lesão contém uma poderosa bobina de voz para conduzir seu movimento, e deve-se sempre ficar longe do dispositivo quando ele estiver ativo e apenas desligar o dispositivo quando o stage estiver no topo de seu curso.