Name: Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a criar um modelo de lesão por estiramento em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas em formato de 96 poços. Este método permite triagens fenotípicas de alta produtividade para descoberta de fármacos em neurotrauma.

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Este trabalho é financiado em parte por uma concessão do National Institutes of Health (R21NS098129). Nós gostaríamos de reconhecer a excelente assistência técnica de SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng e Feng Yuan Bu, que projetou e construiu uma estrutura para suportar as luzes usadas durante experimentos de imagem de alta velocidade descritos neste manuscrito .

<ol><li>Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaul%2C+M+%22Traumatic+brain+injury+in+the+United+States%3A+emergency+department+visits%2C+hospitalizations%2C+and+deaths%2C+2002-2006%22">Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006</a>. , (2010).</li>
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<li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Stapp+Car+Crash+J%22%5BJournal%5D)">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li>
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<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A chave para a obtenção de uma consistente, fenótipo biofidelic neste modelo está aplicando um insulto mecânico biofidelic consistente. Este modelo pode gerar pulso durações tão curtas quanto 10 a 15 ms, que são semelhantes para as durações de pulso para impactos de cabeça humanas de acordo com experimentos cadavérico12,13. A consistência deste insulto varia de acordo com o alinhamento da placa com o bloco do indenter e lubrificação consistente dos indenters. Quando o bloco do indenter está bem alinhado, não há nenhuma tendência a deformação aplicado através de linhas ou colunas (Figura 2). Uma fina camada de lubrificante normalmente cria menos atrito do que uma camada espessa e viscosas graxas não são recomendadas porque falta o silicone e obstruir a passagem da luz durante a microscopia. A amplitude de deslocamento de fase real pode aquém substancialmente a amplitude de deslocamento prescrito quando muitos indenters são utilizados, e a amplitude de deslocamento de fase prescrita é grande (> 3 mm). No entanto, enquanto o deslocamento real é menor do que o prescrito deslocamento em grandes amplitudes, continua a ser repetível (Figura 2B). Portanto, amplitudes de deslocamentos grandes, real podem ser obtidos confiavelmente inserindo um valor prescrito excedam o valor desejado. Amplitude de deslocamento é importante só porque é um proxy facilmente gravado para a tensão de membrana de pico, que mede diretamente o insulto mecânico que induz a patologia. Portanto, o procedimento descrito para determinar a tensão de membrana de deslocamento de fase é crítico. Este processo deve ser repetido se qualquer grandes mudanças são feitas no sistema que afetam a interação entre a placa e os indenters, por exemplo, se for diferente indenters de diâmetro, do indenter diferentes materiais ou revestimentos ou diferentes tipos de silicone placa de fundo são usados. O processo de realinhamento do bloco do indenter e determinar a posição de zero deve ser repetido no início de cada experimento. Um diagrama esquemático do dispositivo alongamento é mostrado na Figura 1. Modelos CAD necessários para reproduzir o dispositivo são fornecidos como materiais complementares: ' dispositivo de lesão - conjunto completo - 3D genéricos. PASSO '; a conta associada de materiais fornecidos comosuplementares tabela 1: Custom construiu dispositivos - BOM.xlsx. Consulte também complementar tabela 2 96 bem placa _loader – Pinout fiação Diagram.xlsx, que descreve as conexões cabos que conectam os vários componentes dos sistemas. 'Interconnector_circuit_board.dip' descreve uma placa de circuito que interliga os cabos.
Se o dispositivo está desativado com o palco no meio do seu curso, o estágio vai passar depois que a energia é cortada, porque é com mola. Quando a energia for restaurada, o circuito de retroalimentação irá detectar uma diferença grande entre a última posição prescrita e a posição real. Isso fará com que o estágio mover-se de repente para a posição que estava quando o dispositivo foi desativado. Este movimento repentino pode causar erros na saída do codificador, assim que cuidado deve ser tomado para desactivar o dispositivo somente quando ele é em sua energizados posição de descanso no topo da sua viagem.
A braçadeira de fabricação é projetada para reunir a placa inferior de silicone e corpo de uma forma que permite a ligação ideal. Para este efeito, existem três características principais no projeto apresentado no arquivo suplementar ' imprensa morrer - 3D genéricos. PASSO '. Primeiro, o suporte de corpo de chapa braçadeira é paralela ao fundo do silicone. Não se este é corretamente construído, exigirá nenhum ajuste após a instalação inicial. Em segundo lugar, a camada de espuma de borracha no grampo fornece uma pequena quantidade de conformidade sob a placa, como um sistema completamente rígido teoricamente iria experimentar um súbito aumento de zero força de aperto para infinita força de aperto quando o grampo foi fechado. A posição da trave e parafuso de fixação do grampo são ajustáveis para que a distância entre os dois lados da pinça pode ser afinada.
Todos os esforços devem fornecer um fundo brilhante, branco atrás do ponto na parte inferior bem durante experimentos de caracterização de estirpe. Melhor o contraste nestas imagens, mais fácil será para automatizar o processo de medir a altura e largura do ponto, que pode se tornar entediante para um operador humano analisando um grande experimento. Videografia de alta velocidade, de fundo de um poço em uma placa de 96 poços apresenta desafios porque as paredes do poço tendem a projetar sombras. O uso de uma cúpula de luz ou luz axial difusa que pode iluminar-se ao longo da linha de visão da câmera sem obscurecer a imagem elimina sombras ou reflexos especulares que surgem com uma fonte de luz convencional. A mais brilhante fonte de luz disponível deve ser usada porque a iluminação brilhante permite que as imagens a serem adquiridos com um tempo de exposição curto. Tempos de exposição curtos minimizam de motion blur. Atualizando a luz emitindo-se diodos (LEDs) na luz difusa axial permite tempos de exposição mais curtos durante a aquisição de vídeo de alta velocidade. Os LEDs podem ser atualizados através da abertura a luz difusa e axial, removendo o estoque de LEDs, montagem 4 de alta potência LED matrizes para o painel traseiro usando LEDs titulares, conectando-os a uma fonte de alimentação de corrente constante e voltar a montar a luz difusa axial (ver tabela de de Materiais para os números de catálogo). A desvantagem de atualizar os LEDs é que os LEDs passivamente resfriados não podem ser mantidos por mais de alguns segundos devido ao risco de sobreaquecimento. Portanto, uma luz diferente é necessária para o alinhamento do ajustamento pós-bloco e câmera.
O método apresentado de quantificar a tensão de membrana, medindo a dilatação de um ponto carimbado para a membrana é relativamente primitiva, mas ele pode escalar até vários poços de forma robusta. O campo de tensão através da parte inferior bem pode ser caracterizado em mais detalhes usando a correlação da imagem digital. Esta técnica envolve a pulverização um padrão salpicado na base do poço e depois de imagens em alta velocidade durante a deformação. Software comercial, então, pode ser usado para quantificar a tensão em cada ponto da imagem seguindo a evolução do padrão salpicado.
Este protocolo produz um fenótipo de lesão multi-facetada, clinicamente relevantes, estiramento em hiPSCNs. Morte celular e degeneração do axônio axônio perolização são tudo bem documentadas sequelas de TCE em humanos e animais modelos15. A chave para o sucesso deste modelo é estabelecer e manter culturas saudáveis. De um modo geral, um protocolo de cultura celular desenvolvido com placas rígidas convencionais é um ponto de partida útil para cultura de placa stretchable. No entanto, sempre deve ser considerada a possibilidade de que as células em questão podem responder diferentemente em silicone. Isto é particularmente verdadeiro de hiPSCNs, que são muito sensíveis às condições de cultura. Alguns exemplos de otimização de concentração de densidade e laminina células são fornecidos na seção de Resultados de representante (Figura 3, Figura 4). Ativação do silicone com tratamento de plasma é vital. Silicone é hidrofóbica e ́; em seu estado natural, não vinculará a laminina ou outras moléculas usadas para promover a fixação da célula. Tratamento de plasma processa a superfície hidrofílica e expõe os grupos reativos. Estas alterações permitem que moléculas de adesão ligar para o silicone e promover a fixação da célula. É importante notar que o efeito do tratamento de plasma dissipa-se em poucos minutos a menos que a superfície está submersa no líquido, e então os procedimentos que envolvem a secagem da superfície ativada devem ser realizados logo que possível. Uma maneira simples de verificar se o efeito do tratamento de plasma desgastou fora é colocar uma gota de água sobre a superfície. Em silicone não tratado, a gota será talão acima, Considerando que na plasma Tratado silicone, vai se espalhar para fora. Com o hiPSCNs que usamos (ver Tabela de materiais), o fabricante recomenda adicionando a laminina com a suspensão de células em vez de pre-revestimento. Este protocolo incorporou essa abordagem com êxito. Enquanto a segmentação pode, em teoria, ser realizada com software open source ou linguagens de programação de uso geral, um alto grau de proficiência com essas ferramentas é necessário para obter bons resultados. Neuritos são frequentemente difíceis de distinguir do sinal de fundo porque eles são tão esbelto. Portanto, recomendamos o uso de ferramentas de software comerciais distribuídos por empresas de elevado conteúdo de microscopia com módulos dedicados para segmentação e quantificação dos neurônios, se eles estiverem disponíveis. Mesmo com o software comercial, é sábio exportar imagens da segmentação para verificar visualmente a exactidão.
Existem algumas limitações associadas trabalhando em placas stretchable comparadas ao trabalhar com placas convencionais, rígidas. Stretchable placas podem ser fotografadas como normal com objectivos de ar. No entanto, a imagem latente com objectivos de imersão é muito difícil. Lente de petróleo pode danificar o silicone. Além disso, o objetivo exerce pressão sobre a membrana de silicone, enquanto se move para cima. Esta pressão desloca a membrana verticalmente, tornando difícil de levar a amostra em foco. As membranas de silicone usadas atualmente na fabricação das placas são aproximadamente 250 µm de espessura. Esta espessura excede a distância focal de muitos de alta potência, objectivos de imersão. Deve ter especial cuidado para colocar as membranas perfeitamente plana antes de fixar para alcançar o nivelamento necessário para microscopia. Sistemas de focagem automática de desvios podem compensar no nivelamento da placa terminada em certa medida. Versões futuras do protocolo podem pre-tensão da membrana antes que é ligado a parte superior da placa para garantir a planicidade. O procedimento sem cola para colagem da membrana do silicone para a placa top14 é considerado uma importante força do protocolo atual. Elimina o risco de neurotoxicidade do adesivo, bem como quaisquer desvios no nivelamento devido à não-uniforme de espessura da camada de adesivo.
Eletrodo multi matrizes são comumente usados em experimentos com hiPSCNs para avaliar a sua maturidade e funcionalidade. Infelizmente, esses sistemas são incompatíveis com este modelo porque o substrato de cultura de célula é rígido. É possível criar uma matriz de multi eletrodo stretchable, embora isto até agora só foi demonstrado em um único bem formato16,17. Observe que indenters podem ser removidos individualmente do bloco do indenter para que alguns poços não são recuados e podem servir como Souza. Remover o indenter impede recuo, mas não elimina completamente carregamento mecânico, desde que não há movimento ainda por inércia do fluido nos poços, enquanto o palco está se movendo. Vale a pena comparar esses poços poços em placas que foram nunca sujeitos a movimento de palco para medir qualquer influência patológica do movimento do fluido. Além disso, a matriz de indenters no bloco deve ser bisymmetric (simétrica da frente para trás e para os lados). Esta precaução garante que a placa é uniformemente carregada durante o recuo, para que o palco não inclinar para o lado e causar as barras vincular em seus rolamentos.
Um dos principais desafios para inovação terapêutica em neurotrauma é a complexidade e heterogeneidade da condição. Trauma aplica stress multimodal para cada tipo de célula no sistema nervoso central simultaneamente. Os neurônios foram confiantemente gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) e estão amplamente disponíveis de fornecedores comerciais. Inovação é avançar rapidamente neste campo, e outros tipos de células neurais como astrócitos18 e microglia19 também estão sendo derivados de hiPSCs. Logo é possível isolar as célula autónomos respostas de cada um desses tipos de célula para trauma em vitro e em seguida co-cultura diferentes tipos de células para entender como eles se comunicam após trauma. Desta forma, em última análise, pode ser possível recriar o desafio clínico do fundo acima de completamente compreendê-lo em um sistema humano. Esta abordagem difere da abordagem convencional, baseando-se em modelos de roedores e tem o potencial de gerar novos insights que levam para as terapias de primeiras para esta condição comum, devastador e intratável.

TCE é das principais causas de mortalidade e morbidade nos Estados Unidos, causando cerca de 52.000 mortes e 275.000 hospitalizações a cada ano1. Foram realizados mais de 30 ensaios clínicos de terapêutica candidato para TBI sem um único sucesso2. Essa falha uniforme sugere que processos humanos específicos separam TBI humana a fisiopatologia observada em modelos de roedores pré-clínicos comumente usados.
O advento do hiPSCNs criou a oportunidade de estudar neurotrauma em um modelo humano em vitro . Com modelos baseados em hiPSCN de rastreio de drogas podem entregar resultados que são mais preditivos de sucesso clínico do que modelos empregando células de roedores. Além disso, hiPSCNs pode ser manipulado geneticamente para isolar e estudar o efeito de variantes genéticas humanas individuais na patologia3.
O método descrito neste manuscrito é projetado para trazer as vantagens únicas da doença baseada em hiPSCN modelagem de neurotrauma. Em vitro modelos de lesão de estiramento de neurotrauma são bem estabelecidos4,5,6 com células primárias de roedores e de linhas de células cancerosas humanas neural. A maioria destes modelos gera trecho pneumaticamente carregando uma membrana de silicone. Esta abordagem é eficaz em um único formato bem mas provou difícil de escala até um formato multi bem7. Como resultado, nunca houve uma tela de alta produtividade para agentes tratar estiramento neurônios feridos.
Neste modelo, a membrana se estende devido ao recuo de baixo com um rígida do indenter. Esta abordagem tem demonstrada repetidamente para gerar patologia clinicamente relevantes em vitro em sistemas bem simples8,9,10. Nossos trabalhos mais recentes tem mostrado que é facilmente escalas para um formato de 96 poços, mantendo durações de pulso da ordem de dezenas de milissegundos11, que é o tempo fechado de domínio de cabeça impacto eventos12,13.
Em resumo, as principais vantagens deste modelo de lesão em vitro são o formato de 96 poços, o uso de hiPSCNs e o domínio do tempo clinicamente relevantes do insulto.

<table><tbody><tr><td>.010" Folha de Silicone</td><td>Specialty Manufacturing, Inc</td><td>#70P001200010 Folha de</td><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>#043204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 256665</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td># 12-565-600</td><td>Placa de 96 poços sem fundo</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>#PDC-001-HC</td><td></td></tr> <tr><td>(3-aminopropil) trietoxissilano</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 440140</td><td>APTES</td></tr><tr><td>Papel pergaminho</td><td>Reynolds</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Dome Light</td><td>CCS inc</td><td>LFX2-100SW</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação de Luz de Cúpula</td><td>CCS inc</td><td>PSB-1024VB</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Iluminação Difusa Axial&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Siemens</td><td>Nerlite DOAL-75-LED</td><td>Luz axial difusa</td></tr><tr><td>Matriz de LED de alta potência&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CREE</td><td>XLamp CXA2540</td><td>Matriz de LED de Alta Potência&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Suporte de LED</td><td>Molex</td><td>1807200001</td><td>Suporte de LED&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação LED</td><td>Mean Well</td><td>HLG-320H-36B</td><td>Fonte de Alimentação de Corrente Constante&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Software FastCam Viewer&nbsp;</td><td>Câmera de alta</td>velocidade <td>Fastcam</td><td></td></tr><tr><td>Mini UX50</td><td>Photron</td><td>N/A</td><td>Câmera de alta velocidade</td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td><td>Nikon</td><td>#1455</td><td>Lente de câmera de alta velocidade</td></tr><tr><td>0,1 mg/mL Poli-L-Ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4597</td><td></td></tr><tr><td>iCells</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>iCell media</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRM-100-121-001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento iCell</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRM-100-031-001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#H3570</tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>#C3099</tr><tr><td>atuador de bobina de voz&nbsp;</td><td>BEI Kimco</td><td>LA43-67-000A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>encoder linear óptico&nbsp;</td><td>Renishaw</td><td>T1031-30A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>servo drive</td><td>Copley Controls</td><td>Xenus XTL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Controlador</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9024 Controlador PowerPC em Tempo Real&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chassi cRIO</td><td>National Instruments Módulo</td> de entrada digital <td>cRIO 9113</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>NI 9411</td><td></td></tr><tr><td>Chassi de aquisição de dados</td><td>National Instruments</td><td>NI 9113</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>Software de controle de instrumentos</td>da <td>National Instruments</td><td></td></tr><tr><td>hiPSCNs</td><td>Cellular Dynamics International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatismo crânio-encefálico (TCE) é um grande desafio clínico com alta taxa de morbidade e mortalidade. Apesar de décadas de pesquisa pré-clínica, desenvolveram-se sem terapias comprovadas para TBI. Este trabalho apresenta um método novo para pesquisa pré-clínica neurotrauma destinado a complementar os actuais modelos pré-clínicos. Ele introduz a fisiopatologia humana através do uso de neurônios de células-tronco derivadas de humanas pluripotentes induzidas (hiPSCNs). Consegue o pulso de carregamento duração semelhante para as durações de carregamento da clínica fechada impacto cabeça lesão. Ele emprega um formato de 96 poços que facilita as experiências de alta taxa de transferência e faz o uso eficiente das células caras e reagentes de cultura. Membranas de silicone são primeiro tratadas para remover o polímero não polimerizado neurotóxico e então ligadas aos organismos comerciais placa de 96 poços para criar stretchable placas de 96 poços. Um dispositivo custom-built é usado para recuar alguns ou todos os fundos bem partir de baixo, induzindo equibiaxial esforços mecânicos que fere mecanicamente as células em cultura em poços. A relação entre a profundidade do recuo e esforços mecânicos é determinada empiricamente utilizando Videografia de alta velocidade de fundos bem durante o recuo. As células, incluindo hiPSCNs, podem ser cultivadas nestas membranas de silicone usando versões modificadas de protocolos de cultura de células convencional. Imagens microscópicas fluorescentes de culturas celulares são adquiridas e analisadas após a lesão de forma semi-automática para quantificar o nível de prejuízo em cada poço. O modelo apresentado é otimizado para hiPSCNs, mas poderia, em teoria, ser aplicado a outros tipos de células.

O dispositivo de maca é capaz de mover o palco repetidamente com durações de pulso tão curtos quanto 10 a 15 ms dependendo da amplitude do pulso (Figura 2A). As amplitudes de pulso são altamente repetitivo, mas a duração do pulso varia por aproximadamente 1 ms entre repetições. A amplitude de pulso real diverge a amplitude de pulso prescrita quando um grande número de poços é carregado, e a amplitude prescrita é elevada (ver Figura 2B). Como a amplitude de deslocamento de fase é aumentada além de 3 milímetros, a amplitude de deslocamento real cada vez mais fica aquém da amplitude de deslocamento prescrito (ver Figura 2B). Alinhamento cuidadoso do bloco post elimina qualquer tendência na tensão de membrana através de linhas ou colunas (Figura 2). A 3.5 mm prescrita a amplitude de deslocamento de fase (amplitude de deslocamento real de 3,3 mm) com 52 poços recuados, a tensão média de Lagrangiana em todos os locais bem era 0.451 (desvio-padrão dos meios para todas as localizações = 0,051, média dos desvios-padrão para todos os locais = 0.065, n = 5 medições por alvéolo). Estes resultados são aqui apresentados estão completos embora alguns deles já foram relatados11.
Uma cultura ideal, ileso terá poucas ou nenhumas grupos de mais de 5 células. Neuritos será individual, longo, esbelto e curvo com pouco ou nenhum sinal de tensão ou perolização (Figura 3A). Sob condições ideais, a viabilidade das culturas deve aproximar a viabilidade especificada na folha de dados do fabricante (normalmente 60-70%) e culturas em silicone devem se parecer com aqueles mantidos em substratos de cultura rígida convencional ( Figura 3B). Neuritos podem ou não ser visíveis em um microscópio de campo claro de baixa potência. Concentração de laminina e densidade celular ambos influenciam culturas na linha de base e após a lesão. Aumento da densidade celular aumentou o número e tamanho dos aglomerados que formaram na cultura. Aumentando a concentração de laminina frequentemente contrariadas este efeito (Figura 3A). No entanto, aumentar a laminina, concentração muito malhado a sensibilidade das culturas a lesão (Figura 4). A concentração de laminina ideal para culturas ilesos era 50 µ g/mL de laminina (Figura 3), mas a separação ideal entre as populações de feridos sham e estiramento obteve-se a 10 µ g/mL de laminina (Figura 4). Altas concentrações de laminina reduziram a sensibilidade das culturas a lesão em curto espaço de tempo pontos (Figura 4), mas também de base melhorada viabilidade celular em pontos de tempo mais longos (por exemplo, 7 dias). Em resumo, vale a pena para otimizar a concentração de laminina para cada cenário experimental.
Tensão de membrana, ponto da imagem latente do tempo pós-lesão, laminina concentração e densidade celular todos exerceram um efeito principal altamente estatisticamente significante sobre o comprimento do axônio por célula (ANOVA, p &lt; 0,001). O efeito da tensão de membrana no comprimento do axônio por célula tiveram interações altamente significativas com pós-lesão imagem tempo ponto e laminina concentração (ANOVA, p &lt; 0,001) e uma interação significativa com célula densidade (ANOVA, p &lt; 0,05). Da mesma forma, tensão de membrana, pós-lesão imagem ponto de tempo, cela a densidade, e laminina concentração todos exerceu um efeito principal altamente estatisticamente significativo na viabilidade celular (ANOVA, p &lt; 0,001). O efeito da tensão da membrana na viabilidade celular teve uma interação altamente significativa com o ponto de tempo pós-lesão de imagem (ANOVA, p &lt; 0,001) e uma interação significativa com a densidade celular (ANOVA, p &lt; 0,05). Estes resultados comprovam que sincronismo, densidade celular e laminina concentração exercem uma influência importante sobre a relação entre o insulto aplicado e resultados experimentais, para que cada um deve ser otimizado com cuidado.
Viabilidade celular baixa e neuritos frisados, juntamente com crescimento atrofiado axônio, indicam as condições de cultura tóxicos que podem surgir de forma inadequada preparado do silicone. Ignorando-o ou diminuindo o banho de água ou o forno seco pode deixar etanol absorvido ou água na membrana, respectivamente, que podem difundir na mídia e sublinhar as células. Culturas bem lesionadas serão ter reduzido viabilidade celular, neuritos reduzidos ou ausentes, frisados neuritos e neuritos aquele olhar tenso ou esticado. Lesão pode induzir aglutinação em culturas de células que estavam bem disperso pré-lesão. Grandes massas que podem confundir a análise morfológica. Para análise morfológica, o nível de prejuízo deve ser afinado que ocorrem mudanças perceptíveis, mas as células estão ainda presentes com alguns neuritos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> Figura 1 : A rotulado esquemática do dispositivo lesão. (A) vista superior, vista isométrica (B), (C) vista frontal, vista do lado direito (D). Barra de escala aplica-se para as vistas ortogonais (A, B e D). <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> Figura 2 : Cinemática do insulto mecânico. (A), o deslocamento de fase histórias sobre 5 pulsos em uma gama de amplitudes prescritas (amplitudes prescritos são listados na legenda) quando não há poços são carregados. (B) o deslocamento de fase histórias sobre 10 pulsos em uma gama de amplitudes prescritas (amplitudes prescritos são listados na legenda) quando 52 poços são carregados. (C) a tensão média em cada poço com amplitude de deslocamento de fase de 3,3 mm (n = 5 medições por alvéolo, média erro-padrão por alvéolo = 0,029). Observe que o C4-F4 e F9 C9 são poços de controle unstretched. Esta figura foi modificada de Sherman et al . 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> Figura 3 : Otimização de cultura condições em silicone. (A) o efeito da variação de concentração de densidade e laminina células em culturas de hiPSCN em silicone. Aglutinando aumenta com o aumento da densidade celular e diminuindo a concentração de laminina. Concentração de densidade e laminina células deve ser otimizada para atingir culturas mono-dispersos. Mono-dispersos culturas são menos vulneráveis aos artefatos durante a quantificação. Observe que a faixa dinâmica foi ajustada para otimizar a visualização dos neuritos. Como consequência, o soma muito mais brilhante estão saturados. Esta apresentação é preferível à alternativa de otimização da gama dinâmica com relação a soma, o que torna o muito redutor neuritos quase invisível. A condição, destacada-se a Praça Vermelha foi considerada ideal para em vitro experiências de lesão de estiramento. (B) sob condições ideais, culturas nas membranas de silicone parecem semelhantes às culturas em substratos rígidos convencionais. O painel esquerdo mostra hiPSCNs cultivadas em 33.750 células/cm2 com 3,3 µ g/mL de laminina em uma placa de 96 poços convencional, rígida (o substrato de cultura de células é um olefina cíclica de cultura de tecidos Tratado co polímero). O painel direito reproduz o painel delineado em vermelho do (A). Barras de escala = 100 µm. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> Figura 4 : O fenótipo da lesão e sua dependência na concentração de laminina. (A) cultura saudável, usando 10 µ g/mL laminina e 67.500 células/cm2. Neuritos são comprimento com sem grânulos. Existem alguns núcleos de morto e poucos pedaços. (B) cultura usando as mesmas condições de cultura, ferido com a tensão de pico de 57% e fotografada após 4 h. neuritos são encurtados ou ausente e alguns têm grânulos (indicados pelas setas). Existem menos células de calceína AM-positivo e mais calceína AM-negativo (ou seja, morto) núcleos. Lesão aumentou aglutinação entre as células sobreviventes. (C) 4 h após a lesão, o comprimento do axônio por célula declina com o aumento da tensão de uma forma que depende da concentração de laminina. (D) 4 h após a lesão, viabilidade celular diminui com o aumento da tensão de uma forma que depende da concentração de laminina. (E) 24 h após a lesão, o comprimento do axônio por célula declina com o aumento da tensão de uma forma que depende da concentração de laminina. (F) 24 h após a lesão, viabilidade celular diminui com o aumento da tensão de uma forma que depende da concentração de laminina. (n = 4 por bar, barras de erro são ± 1 desvio padrão, barras de escala = 100 µm). Valores de tensão são deduzidas a partir de deslocamento de fase usando os dados de uma publicação prévia por Sherman et al . 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Complementar Figura 1: técnicas de desenho do indenter. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Suplementares tabela 1: costume-construído dispositivos. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Suplementares tabela 2:96 placa bem-carregador Pinout diagrama de fiação. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Arquivo complementar de código 1: desenhos de projeto auxiliado por computador do dispositivo lesão. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementares código arquivo 2: desenhos de projeto auxiliado por computador da mordaça fabricação placa. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementares código arquivo 3: representação em 3D da geometria do carimbo, adequada para uso com uma impressora 3D. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementares código arquivo 4: SubVI para MuStLiMo_si_initialize.vi, que é um SubVI para motion_control.vi. Converte as entradas nas caixas de diálogo em parâmetros para o movimento. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementares código arquivo 5: SubVI para vários Moves_simplified.vi de linha reta, que é um SubVI para motion_control.vi. Converte as entradas nas caixas de diálogo em parâmetros para o movimento. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementares código arquivo 6: SubVI para position_tracker.vi. Deslocamento de faixas de balcão de entrada do codificador linear. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de código complementar 7: Base LabVIEW Project. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementares código arquivo 8: Top nível VI que move o dispositivo. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
9 de arquivo de código complementar: SubVI para motion_control.vi. Executa o deslocamento rápido que se estende a placa. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
10 de arquivo de código complementar: SubVI para motion_control.vi. Executa o deslocamento lento que move o palco. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementares código arquivo 11: SubVI para motion_control.vi. Parcelas de uma história de deslocamento (geralmente rarefeitas) no painel de controle motion_control.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementares código arquivo 12: Top nível VI que registra a história de deslocamento. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementares código arquivo 13: Variable2 contém, que se comunica entre motion_control.vi e position_tracker.vi. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Complementares código arquivo 14: esquemático para placa de circuito impresso. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
15 de arquivo de código complementar: Layout para placa de circuito impresso. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Aqui nós apresentamos um método para um modelo humano em vitro de lesão de estiramento em um formato de 96 poços, numa escala de tempo relevante para o impacto do trauma. Isto inclui métodos para a fabricação de placas stretchable, quantificando o insulto mecânico, cultivo e ferindo células, imagem e análise de conteúdo elevado de quantificar a lesão.

Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

O objetivo geral deste modelo é criar um fenótipo de neurotrauma clinicamente relevante em um formato de 96 poços para facilitar a comparação eficiente e simultânea de lesões sofridas em várias condições experimentais. O objetivo principal deste modelo é permitir triagens fenotípicas de descoberta de drogas de alto conteúdo em neurotrauma, com neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. As placas usadas neste modelo mantêm a geometria de placa de 96 poços padrão da indústria, mantendo sua compatibilidade com as máquinas de triagem de alto conteúdo existentes, como braços robóticos e microscópios automatizados.Para começar, coloque uma placa sem fundo de 96 poços com o lado inferior para cima dentro de um limpador de plasma de 200 watts por 60 segundos em alta potência. Em seguida, coloque a placa em 200 mililitros de 1,5% APTES recém-preparado em água deionizada, com o lado inferior voltado para baixo, por 20 minutos em uma hotte. 10 minutos após o início da incubação, use uma pinça para posicionar uma membrana de silicone tratada com plasma em cima de um retângulo de papel manteiga de 7,5 por 11 centímetros e alinhe uma placa de alumínio de 7,5 por 11,05 centímetros na parte inferior da braçadeira de fabricação da placa.Em seguida, use uma pinça para alinhar a membrana de silicone e o papel manteiga na placa de alumínio. No final do período de revestimento, remova a placa sem fundo do banho APTES e sacuda o excesso de solução. Mergulhe a placa sem fundo em dois banhos-maria deionizados consecutivos de 200 mililitros por cinco segundos cada mergulho e sacuda o excesso de água.Após a secagem completa com ar comprimido, coloque a placa sem fundo na parte superior da braçadeira de fabricação da placa e feche suavemente a braçadeira para pressionar a placa sem fundo e o silicone juntos. Para alinhar o bloco penetrador, use stage clamps para prender a placa no stage do dispositivo de alongamento sob uma câmera com uma transmissão ao vivo e coloque uma luz de cúpula sobre o dispositivo. Inicie o software de controle do instrumento no computador conectado ao dispositivo de lesão e clique na janela Iniciar para executar o projeto de neurotrauma in vitro.Na janela do projeto, clique duas vezes nos instrumentos virtuais do controle de movimento e do rastreador de posição. Feche a gaiola ao redor do dispositivo de lesão e clique na seta no instrumento virtual de controle de movimento para executar o instrumento. Clique perto da parte inferior para abaixar o stage para dentro de dois milímetros de contato com os indentadores e, em seguida, clique em parar para parar o instrumento virtual.Na janela do projeto, clique com o botão direito do mouse em Axis One e clique em Interactive Test Panel. Insira 500 unidades no campo Posição de destino na janela que aparece para definir o tamanho do passo para 50 micrômetros. Em seguida, clique em Ir repetidamente, até que a placa entre em contato com qualquer recuo, verificando se há contato na imagem ao vivo exibida pela câmera.A posição vertical do palco será relatada no canto superior esquerdo da janela do painel de teste interativo. Abaixe ainda mais a placa até que todos os poços tenham feito contato com os indentadores, movendo a câmera e o palco conforme necessário para visualizar toda a placa. Observe a posição do palco vertical relatada quando todas as postagens estão em contato e feche o painel de teste interativo.Em seguida, execute o instrumento virtual de controle de movimento e clique em Superior para levantar o palco, usando o botão de parada para parar o instrumento virtual quando o palco estiver em posição. Abra a porta para desativar o dispositivo, depois solte o parafuso seth no canto que fez contato primeiro para abaixar o canto e aperte o parafuso oposto para levantar o canto que fez o contato por último. Repita o bloco abaixando, observando e ajustando até que a placa entre em contato com todos os penetradores simultaneamente.O alinhamento cuidadoso do bloco penetrador é importante para obter uma lesão uniforme em todos os poços da placa. Abra a porta para desativar o dispositivo novamente e insira os parafusos de amarração em seus orifícios no bloco do penetrador. Em seguida, aperte os parafusos na posição e observe a posição do estágio relatada pelo painel de teste interativo quando a placa faz contato.Para esticar a placa, altere o nome do arquivo no campo Caminho do arquivo no instrumento virtual de verificação de posição para um nome de arquivo exclusivo e clique na seta Executar. Defina a profundidade e a duração do recuo e os campos Lesão e Duração da lesão no instrumento virtual do painel de controle de movimento. Com a placa na posição zero, execute o instrumento virtual do painel de controle de movimento e clique em Ferir para recuar a placa.Clique em Superior para mover o palco para cima, clicando em parar quando a placa estiver na posição superior e abra a porta para desativar o dispositivo de lesão. Em seguida, inspecione o histórico de deslocamento do estágio apresentado no instrumento virtual do rastreador de posição para confirmar se o deslocamento máximo especificado foi aplicado e exporte os dados para um programa de planilha apropriado. Para avaliar o estiramento da membrana de silicone, após o tratamento com plasma, coloque a placa em uma superfície macia e aplique a pequena saliência em um carimbo com tinta de um marcador permanente.Insira o carimbo no primeiro poço a ser testado e bata para garantir uma boa transferência de tinta. Quando todos os poços tiverem sido stamped, coloque a câmera de alta velocidade em um suporte de lança sobre o dispositivo de lesão com a lente ajustada para o menor F-stop numerado para que o campo de view contenha 12 penetradores em uma grade de três por quatro. Com o local na posição de ponto zero, clique no botão de gravação no software da câmera para que ele leia o gatilho e acenda a luz axial difusa brilhante.Em seguida, recue a placa como acabamos de demonstrar e desligue a luz axial. Para ferir uma cultura de células, adicione 100 microlitros de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos tratados com laminina a cada poço da placa tratada com plasma e permita que as células se fixem ao fundo da placa por 15 minutos em temperatura ambiente antes de colocar a placa na incubadora de cultura de células. Após dois a três dias de cultura, prenda a placa no estágio do dispositivo de lesão e ajuste a posição da tampa para prender a placa sem expor as culturas ao ar ambiente.Em seguida, com a placa na posição de ponto zero, recue a placa conforme demonstrado. Uma cultura ideal não lesionada terá poucos ou nenhum aglomerado de mais de cinco células, e os neuritos serão individuais, longos, delgados e curvos, com pouco ou nenhum beading. Em condições ideais, a viabilidade das culturas deve aproximar-se da viabilidade especificada na ficha técnica do fabricante, e as culturas em silicone devem assemelhar-se às mantidas em substratos de cultura rígidos convencionais.O aumento da densidade celular aumenta o número e o tamanho dos aglomerados que se formam na cultura, enquanto o aumento da concentração de laminina normalmente neutraliza esse efeito. Em culturas lesionadas com um pico de tensão de 57%, quatro horas após a lesão, os neuritos são encurtados ou ausentes, e alguns têm grânulos com aglomeração demonstrada pelas células viáveis restantes. Notavelmente, os tratamentos com laminina em doses mais altas reduzem a gravidade da lesão nas culturas de células de maneira dependente da concentração, como evidenciado pelo aumento do comprimento dos neuritos e da viabilidade celular nas culturas tratadas com laminina em doses mais altas.Ao tentar este procedimento, é importante considerar os prazos de entrega. Por exemplo, a desintoxicação da membrana leva três dias e as placas fabricadas devem curar durante a noite antes do uso. Não se esqueça de que o dispositivo de lesão contém uma poderosa bobina de voz para conduzir seu movimento, e deve-se sempre ficar longe do dispositivo quando ele estiver ativo e apenas desligar o dispositivo quando o stage estiver no topo de seu curso.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

O vídeo demonstra um método para gerar neurônios corticais excitatórios a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Após a indução da doxiciclina, as hiPSCs superexpressam a neurogenina-2, um fator de transcrição neural-específico. Ao usar meios específicos e co-cultura com astrócitos, esse processo facilita a diferenciação dos hiPSCs em neurônios com conexões sinápticas.

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Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços (Vídeo) | JoVE Journal

Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços

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