Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

O objetivo geral deste experimento é gerar bibliotecas de sequenciamento de próxima geração a partir do DNA e do RNA de pequenas populações de células sem dividir a amostra em nenhum ponto. Este método fornece aos pesquisadores uma nova abordagem para estudar as variações estruturais do DNA na expressão de genes. Quando pensamos no Gel-seq pela primeira vez, não havia protocolos para sequenciar simultaneamente o DNA e o RNA da mesma amostra.

Felizmente, agora existem três abordagens publicadas que resolvem esse problema. A principal vantagem dessa técnica é que as informações genômicas e transcriptômicas podem ser obtidas do mesmo conjunto de células por um custo adicional insignificante. O Gel-seq foi originalmente desenvolvido com verticais, no entanto, este protocolo pode ser adaptado para funcionar com qualquer de eletroforese em gel padrão.

Prepare o enchimento, as misturas precursoras de alta densidade e baixa densidade em três tubos. Adicione os reagentes na ordem descrita e vortex a mistura. Não adicione prematuramente APS ou Temed.

Espere até ser direcionado. Em seguida, desgaseifique cada solução de monômero de gel inserindo primeiro uma agulha na tampa. Em seguida, conectando a agulha a uma linha de vácuo da casa e submergindo esse conjunto em um banho ultrassônico.

Aguarde cerca de um minuto até que não saiam mais bolhas do líquido. Em seguida, à mistura precursora de enchimento, adicione o Temed e o APS e o vórtice brevemente. Em três minutos, use uma pipeta de um milímetro para adicionar seis milímetros a cada de gel sem derramar.

Certifique-se de que o fluido esteja nivelado posicionando os na vertical em uma mesa nivelada. Em seguida, complete gradualmente os com água ionizada desgaseificada, tomando cuidado para minimizar a mistura da mistura de polimerização com a água. Em seguida, deixe o polímero curar por uma hora durante a noite.

Assim que o polímero estiver curado, despeje a camada de água e, a quinze centímetros de distância, use um fluxo suave de ar comprimido para secar a superfície do gel. Em seguida, adicione Temed e APS ao precursor de gel de alta densidade e vortex brevemente. Em três minutos, transfira 320 microlitros para cada e espalhe-o sobre a camada de gel de enchimento balançando o para frente e para trás algumas vezes.

Em seguida, complete os com água desionizada e desgaseificada e deixe o polímero curar por cerca de uma hora. Depois de curado, seque o polímero como antes. Finalmente, adicione Temed e APS à mistura precursora de gel de baixa densidade e vórtice.

Em seguida, encha rapidamente o restante dos com esta mistura e insira os pentes de gel antes que comece a curar. Agora, adicione o excesso de precursor de reserva sobre o favo a ser adsorvido durante a polimerização. Após a cura, o está pronto para uso.

Depois de converter o RNA em cDNA, use um gel para recuperar a fração de interesse. Primeiro, limpe completamente a câmara de eletroforese usando vários mililitros de um produto de remoção de DNA e um pano sem fiapos. Em seguida, encha a câmara com cinco XTBE limpos e coloque todo o aparelho em um forno de reticulação UV de 254 nanômetros e esterilize por 15 minutos.

Agora, insira um Gel-seq na câmara de eletroforese e trave-o no lugar. Em seguida, remova lentamente o pente de gel puxando suavemente para cima sem rasgar o gel. Agora, carregue as amostras usando uma pipeta.

Insira totalmente a ponta nos poços ao carregar amostras para minimizar a chance de contaminação entre os poços. Aplique um campo elétrico de 250 volts no Gel-seq por 30 minutos para separar o gDNA dos híbridos cDNA/RNA. Depois de carregar, executar e coletar o gel, use um bisturi para cortar o gel ao meio, logo abaixo da camada de alta densidade, e descarte a metade do gel de preenchimento.

Em seguida, retire suavemente o gel restante do, usando cuidadosamente uma ferramenta de raspagem. Depois de verificar a separação usando um gel doc, use um transiluminador para extirpar as bandas. O gDNA deve estar localizado no início do gel de baixa densidade e o cDNA deve estar na interface das regiões de baixa e alta densidade.

Agora, use um bisturi para cortar as regiões do gel que contêm gDNA e cDNA. Remova também as mesmas seções da faixa de controle negativo. Usando uma pinça cega, transfira suavemente as seções do gel para tubos de tira.

Se o gel quebrar, encontre e transfira todos os pedaços quebrados para o tubo. Em seguida, triture cada gel usando movimentos circulares e pressionando com uma ponta de pipeta. Antes de remover as pontas, adicione 40 microlitros de água livre de nuclease ao gDNA e 80 microlitros às amostras de cDNA.

Em seguida, remova e descarte as pontas com cuidado. Agora, prenda os tubos de tira em um misturador de vórtice a 37 graus Celsius e agite-os por oito a 12 horas. O DNA irá assim escapar do gel.

Após a agitação, pipetar as amostras para uma placa de filtro de malha de oito mícrons. Em seguida, gire a placa a 2.600 g por cinco minutos para coar os fragmentos de gel. Em seguida, levante a placa do filtro de malha para longe da placa do invólucro e use uma pipeta para transferir as amostras sem gel da placa para novos tubos de tira de 200 microlitros.

Para cada amostra contendo gDNA, adicione um microlitro de protease e pipete para cima e para baixo para misturar bem. Em seguida, incube as amostras a 50 graus Celsius por 15 minutos. Siga com uma ativação de aquecimento a 70 graus Celsius por 15 minutos.

Esta etapa de depleção de nucleossomos é crítica. Em seguida, use uma agulha de calibre 18 para fazer um furo na tampa de cada tubo de amostra. Em seguida, use um aspirador para reduzir as amostras de gDNA para cinco microlitros e as amostras de cDNA para 10 microlitros.

Se o volume cair abaixo do alvo, adicione água livre de nuclease conforme necessário. Os híbridos de gDNA e cDNA/RNA foram fisicamente separados usando o dispositivo Gel-seq. O controle negativo não tem fluorescência automática do gel nas interfaces.

As escadas de DNA mostram apenas uma faixa escura na interface entre as membranas de baixa e alta densidade, revelando que pequenos fragmentos podem passar pelo gel de baixa densidade. Uma amostra biológica de 500 células PC3 mostra a separação desejada de DNA genômico e híbridos de cDNA/RNA. Uma faixa escura no topo da membrana de baixa densidade é o DNA genômico em escala de megabase, enquanto os híbridos de cDNA / RNA são empilhados na interface das regiões de baixa e alta densidade.

Os pequenos fragmentos de pares de bases sub-100 são produtos fora do alvo gerados a partir de oligonucleotídeos de primer durante a transcrição reversa e são esperados. As bibliotecas foram geradas a partir de 500 células PC3 ou 750 células HeLa. As distribuições de fragmentos das bibliotecas correspondentes geradas a partir do Gel-seq foram comparadas com amostras não correspondentes geradas com protocolos padrão.

A distribuição dos fragmentos de nucleotídeos foi semelhante com ambos os métodos. Os resultados do sequenciamento da biblioteca de células PC3 foram comparados com métodos tradicionais. As variações no número de cópias em todo o genoma foram comparadas.

Estatisticamente, os dois métodos obtiveram resultados semelhantes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar bibliotecas de sequenciamento de próxima geração emparelhadas para DNA e RNA a partir da mesma amostra inicial. Como acontece com qualquer experimento de sequenciamento de baixa entrada, é imperativo lembrar de manter um ambiente de trabalho limpo.

Você deve prestar muita atenção à esterilização de tubos e luvas de limpeza. Mesmo com essas precauções, os experimentos ocasionalmente falham devido à contaminação. Uma observação importante é que a onipresença e a segurança dos géis de poliacrilamida tornam fácil esquecer que os precursores de fabricação são neurotoxinas perigosas.

Você deve sempre trabalhar com esses reagentes em uma hotte e limpar imediatamente quaisquer derramamentos. Projetamos o Gel-seq para ser simples para os pesquisadores implementarem em seus próprios laboratórios e esperamos que isso facilite a rápida adoção dessa tecnologia.