Adaptação 3' rápida amplificação do CDNA termina para mapear transcritos em câncer

O objetivo geral deste procedimento é determinar as sequências de transcritos de mRNA da extremidade tripla primária para regiões dentro da região codificadora da proteína, usando primers aninhados específicos para transcritos em dois PCRs subsequentes e sequenciando os produtos de PCR purificados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo genético, como determinar o sinal de poliadenilação, o códon de parada e a sequência da região não traduzida de três primos do transcrito. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser aplicada a qualquer transcrição se a sequência da pequena região do quadro de leitura aberto for A implicação dessa técnica se estende ao diagnóstico do câncer, pois pode detectar genes de fusão específicos do tumor e variantes de emenda.

Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando identificamos novas transcrições com regiões não traduzidas anteriormente não caracterizadas e com três primos. Para iniciar o protocolo, descongele a mistura de células de isotiocianato de fenol e guanidina no gelo. Depois de descongelado, adicione 100 microlitros de clorofórmio ao tubo de microcentrífuga em uma coifa de PCR.

Vortex a amostra por 10 a 15 segundos até que a mistura fique rosa e opaca. Em seguida, incube a amostra no gelo por 15 minutos. Após a incubação, centrifugue a amostra por 15 minutos a 20, 800 g e quatro graus Celsius.

Remova cuidadosamente a fase aquosa incolor superior e transfira-a para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, passe para a precipitação e adicione um volume igual de isopropanol à amostra. Adicione um microlitro de co-precipitante à amostra para atuar como um transportador para o RNA e ajudar a visualizar o RNA nas etapas subsequentes.

Incube as amostras a 80 graus Celsius por pelo menos quatro horas. Após a incubação, transfira a amostra para uma centrífuga resfriada e gire por 35 minutos a 20.800 g e quatro graus Celsius. Após a rotação, o RNA aparecerá como uma especificação azul na parte inferior do tubo.

Remova cuidadosamente o isopropanol da amostra. Adicione 500 microlitros de etanol a 80% e ressuspenda o pellet por um breve vórtice por três segundos. Centrifugue novamente a amostra.

Remova todo o etanol da amostra e deixe a amostra secar ao ar por cerca de 10 minutos. Quando a amostra estiver seca, ressuspenda-a em 35 microlitros de água livre de RNase. Em seguida, coloque a amostra em um bloco de calor.

Defina a 65 graus Celsius por cinco minutos para garantir que o RNA esteja totalmente em solução. Após o aquecimento, coloque imediatamente o tubo no gelo. Para um volume de reação final de 50 microlitros, adicione quatro microgramas de RNA total com água adicionada a um volume total de 22 microlitros a um novo tubo.

Adicione dois microlitros do primer Oligo dT 25 da solução de primer 10 micromolar. Do kit de transcrição reversa, adicione dois microlitros do inibidor de RNase, oito microlitros do tampão de reação 5x, quatro microlitros de dNTPs de 10 milimolares e dois microlitros da transcriptase reversa. Configure uma reação sem transcriptase reversa para atuar como um controle negativo.

Incube o tubo a 42 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, transfira o tubo diretamente para o gelo antes de transportá-lo para o bloco de aquecimento. Em seguida, aqueça o tubo a 75 graus Celsius por cinco minutos.

Depois de aquecê-lo a 75 graus Celsius, coloque o tubo no gelo. Transfira dois microlitros do cDNA para um novo tubo de PCR de 0,5 mililitro. Adicione um microlitro do primer direto e um microlitro do primer reverso de uma solução de primer 10 milimolar.

Faça até 12,5 microlitros adicionando 8,5 microlitros de água livre de nuclease e adicione 12,5 microlitros de 2x PCR para mistura master de gel. Em seguida, insira as condições de ciclo térmico de PCR listadas na tela e execute o PCR. Após a PCR, prepare um gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio.

Dissolver um grama de agarose em 100 mililitros de triacetato ou tampão TAE num balão de 250 ml. Ferva o conteúdo no micro-ondas. Deixe o gel esfriar por um minuto e adicione 7,5 microlitros de solução de brometo de etídio em uma capela

Misture bem girando o frasco. Deitar o conteúdo num aparelho de gel horizontal e deixar solidificar o gel à temperatura ambiente na hotte durante, pelo menos, 30 minutos. Cubra o gel com 1x tampão TAE e carregue 10 microlitros do produto de PCR no gel de agarose junto com três a cinco microlitros da escada de peso molecular do DNA.

Execute o gel a 175 volts por 10 minutos. Para a primeira PCR, transfira um microlitro de cDNA para um tubo de PCR e adicione cinco microlitros de tampão de reação 10x Pfu. Adicione um microlitro do primeiro primer direto aninhado, um microlitro do primer T7 Oligo dT 25 e um microlitro de dNTPs de uma solução de 10 milimolares.

Faça até 49 microlitros de volume total adicionando 40 microlitros de água. Adicione um microlitro de DNA polimerase Pfu e misture bem. Em seguida, execute o PCR.

Em seguida, prepare o segundo PCR. Transfira dois microlitros dos produtos do primeiro PCR para um novo tubo de PCR e misture com cinco microlitros de tampão de reação 10x Pfu ultra two. Adicione um microlitro do segundo primer de PCR aninhado, um microlitro do primer T7 e um microlitro de dNTPs.

Faça até 49 microlitros de volume total de reação adicionando 39 microlitros de água e adicione um microlitro de DNA polimerase de Pfu. Execute o PCR usando o mesmo perfil de PCR da primeira configuração de PCR. Alternativamente, em vez de usar a DNA polimerase de Pfu, uma DNA polimerase quimérica pode ser usada nas duas PCRs diferentes.

Pegue de cinco a dez microlitros do segundo produto de PCR e execute-o em um gel de agarose. Por fim, visualize o resultado em um gerador de imagens. Este gel de agarose mostra dois produtos de PCR distintos que usam o mesmo primer direto, mas diferentes primers reversos e um produto de PCR distinto que possui um primer direto e reverso distinto.

Os primers ideais para usar na reação baseada em PCR são aqueles que fornecem um produto de PCR distinto. Os produtos da segunda reação de PCR com Pfu DNA polimerase e DNA polimerase quimérica produziram os mesmos produtos de PCR de tamanho, apesar de terem diferentes condições de ciclagem de PCR para o RACE de três primos. Os controles negativos da transcriptase reversa não mostraram contaminação genômica do RNA usado na síntese de cDNA, bem como nas reações subsequentes a jusante.

Os produtos de PCR purificados em gel foram enviados para sequenciamento. Uma sequência de Sanger representativa de um cromatograma de sequência identificou a localização do códon de parada, o sinal de poliadenilação putativo e o local, bem como a cauda poli A no produto RACE de três primos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar equipamentos de proteção e luvas o tempo todo.

Além disso, use DNase e RNase estéreis para seus tubos de reagentes e outros descartáveis. Não se esqueça de que trabalhar com fenol e clorofórmio pode ser extremamente perigoso. E precauções como usar os reagentes em um exaustor e descartar o material em um recipiente de lixo designado devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.