Caracterização de células imunes no tecido adiposo humano usando citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é usar citometria de fluxo para isolar a fração vascular estromal do tecido adiposo humano para fenotipagem das diferentes populações de células imunes encontradas no tecido adiposo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa metabólica, como quais células imunes se acumulam no tecido adiposo de indivíduos obesos e em que medida. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a medição simultânea de múltiplos marcadores nas células imunes e a identificação e quantificação dessas células imunes no tecido adiposo.

Embora essa técnica possa fornecer informações cruciais sobre a inflamação do tecido adiposo, ela também pode ser aplicada a outros órgãos e tecidos. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica lutam principalmente com a contaminação das células vasculares estromais e a perda de células durante o procedimento de coloração. Dois dos meus candidatos a doutorado, Suzan Wetzels e Mitchell Bijnen, executarão o protocolo.

Comece usando um bisturi para picar um grama de biópsia de tecido adiposo em pedaços de aproximadamente dois milímetros quadrados. Transfira as peças para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de solução de colagenase às amostras. Incube os fragmentos de tecido por 60 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius a 60 ciclos por minuto.

Seguido de filtração através de um filtro de 200 micrômetros em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue o filtro com sete mililitros de PBS antes da centrifugação. Em seguida, use uma pipeta para remover o sobrenadante sem submergir toda a ponta da pipeta na solução.

O pellet deve ser claramente visível e remover quase todo o sobrenadante para evitar a contaminação da fração vascular estromal com células adiposas. Suspendemos o pellet de células vasculares estromais com cinco mililitros de PBS fresco e filtramos a fração vascular estromal através de um filtro de 70 micrômetros em um novo tubo. Após a centrifugação, suspendemos o pellet de fração vascular estromal lavado em três mililitros de tampão de lise eritrocitária por cinco minutos no gelo.

Em seguida, pare a lise com sete mililitros de PBS e pulverize as células por centrifugação. Para corar a fração vascular estromal para análise de citometria de fluxo, ressuspenda o pellet em 90 microlitros de classificação de células ativadas por fluorescência de quatro graus Celsius, ou tampão FACS, e bloqueie a coloração inespecífica com dez microlitros de IgG humana. Divida a suspensão celular entre dois poços de uma placa de fundo em V de 96 poços e coloque as células no gelo por 15 minutos.

No final da incubação, lave cada amostra com 100 microlitros de tampão FACS, virando a placa de cabeça para baixo em um movimento suave sem bater para descartar os sobrenadantes no final da centrifugação. Certifique-se de ver claramente o pellet na parte inferior da placa antes de virá-la de cabeça para baixo para evitar a perda de suas células durante o procedimento. Ressuspenda o primeiro chumbinho em 29,5 microlitros de coquetel de anticorpos para o primeiro painel FACS e o segundo projétil em 23 microlitros de coquetel de anticorpos para o segundo painel FACS.

Após 30 minutos no gelo no escuro, lave as células com 150 microlitros de tampão FACS por poço e fixe os grânulos celulares em 150 microlitros de solução de formaldeído a um por cento. Transferir as suspensões celulares de cada alvéolo para os tubos FACS correspondentes e colocar as amostras no gelo. Antes da análise, carregue um controle negativo não corado no citômetro de fluxo para definir os parâmetros de dispersão direta e lateral.

Em seguida, ajuste as tensões do citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante até que todas as populações de interesse sejam visíveis nos gráficos de dispersão direta e lateral, e uma distinção pode ser feita entre os detritos e as células vivas. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, vórtice a primeira amostra experimental a 800 rpm para ressuspender completamente as células e carregar a amostra no citômetro. Leia um mínimo de 50.000 eventos no portão ativo, depois faça um vórtice e carregue a segunda amostra para análise, conforme demonstrado.

Para permitir a análise das populações de macrófagos do tecido adiposo neste experimento representativo, outras células imunes, como células T, células B, neutrófilos e células natural killer foram excluídas para revelar a presença de macrófagos CD11b+CD11c+, macrófagos CD11B+CD11C e células dendríticas CD11Blow-CD11C+. A quantificação da intensidade de fluorescência principal dessas células revelou a expressão de células dendríticas citoides plasmáticas e marcadores genéricos de células dendríticas nas células CD11B+CD11C+ e CD11Blow-CD11C+, com maior expressão de ambos os marcadores observada nas células CD11Blow-CD11C+, confirmando que as células CD11Blow-CD11C+ eram de fato células dendríticas. A ativação das células CD45 positivas revelou populações de células T CD19 positivas e CD3 positivas, as quais poderiam ser subdivididas em CD3 + CD4 + T auxiliares e subconjuntos de células T CD3 + CD8 + citotóxicas e CD3-CD56 + células assassinas naturais.

A porcentagem de células imunes viáveis foi então calculada para cada indivíduo, revelando um aumento significativo na porcentagem de macrófagos CD11B+CD11C+ pró-inflamatórios no tecido adiposo visceral de indivíduos adultos obesos do sexo masculino. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante manter os tampões e frações celulares no gelo e, ao rotular as células com anticorpos, é muito importante mantê-las no escuro.

Após seu desenvolvimento, essa técnica permitiu que pesquisadores no campo da pesquisa metabólica explorassem as alterações das células imunes no tecido adiposo de humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células imunes do tecido adiposo e como realizar citometria de fluxo nessas células. Lembre-se de que você está trabalhando com materiais e substâncias humanas potencialmente infecciosas, como formaldeído, que podem ser perigosos.

Sempre tome precauções usando luvas e óculos de segurança.