Name: Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprenda a isolar ilhotas pancreáticas de murinos para rastrear produtos químicos ambientais que induzem ROS e avaliar seu potencial diabetogênico em estudos de toxicologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por uma concessão do projeto piloto do centro CREH patrocinado pela NIEHS e pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 31572626).

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as orientações pertinentes, regulamentos e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrado foi realizado sob a orientação e aprovação do cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do Texas A & M Instituto de Medicina Genômica.
1. preparação da solução
<ol><li>Diluir a solução de sal equilibrada do Hank x 10 x 1 com água destilada dobro H2O e armazenar a 4 ° C.</li>
	<li>Prepare a solução de isolamento adicionando HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) e glicose (5 mM). Ajustar o pH para 7,4 e manter no gelo.</li>
	<li>Prepare a solução de colagenase da colagenase tipo 4. Nota: Especificamente, colagenase tipo 4 contém 160 U por mg de peso seco. 1 g de colagenase tipo 4 é diluído em 5 mL duplo destilada H2O com uma concentração de 200 mg/mL. 2 mL da colagenase diluído é adicionado para 30 mL de solução de isolamento frio gelo e 6 mL de solução de colagenase é transferido para um tubo de 50 mL para cada rato.</li>
	<li>Prepare a solução de lavagem, adicionando 1 mM CaCl2 para a solução de isolamento.</li>
	<li>Prepare a solução de purificação com solução de diatrizoate de sódio polysucrose frio (1,1119 g/mL, 5 mL).</li>
	<li>Prepare 500 mL de meio de cultura de ilhota pela adição de L-glutamina (20 mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e soro fetal bovino (FBS) (10%) em meio RPMI.</li>
	<li>Preparar a solução Diniz Melo-DA-mãe, dissolvendo o pó em água destilada a 200 µM e loja a-20 ° C. Nota: O ROS coloração solução recém feito diluindo a solução para a concentração final de 5 µM em RPMI Diniz Melo-DA. Este reagente deve ser protegido da luz.</li>
</ol>2. cirúrgica preparação
<ol><li>Intraperitonealmente injete (I.P.) um rato com avertin (2,5% avertin, 0,4 mL/20 g). Depois que o mouse é completamente anestesiado e não responde mais os pés hind pitadas, eutanásia o mouse e mover para o capô biológico.</li>
	<li>Coloque o mouse euthanized com a abdominal virados para cima e pulverizar a pele com álcool 70% para a esterilização.</li>
	<li>Abrir a cavidade abdominal com um U-incisão de 1 cm em cima do abdômen superior e retrair a pele no sentido rostral sobre o peito para expor na cavidade abdominal.</li>
</ol>3. remoção e perfusão pâncreas
<ol><li>Conforme ilustrado na Figura 1, encontre a localização na ampola. Use um par de pinças curvas para fixar o duodeno perto a posição do esfíncter de Oddi. Use outro par de pinças curvas para fixar a parede do duodeno para bloquear o caminho de bile no duodeno. Nota: A ampola não foi inserida nesta etapa. Esta etapa destina-se a bloquear o caminho de bile no duodeno.</li>
	<li>Reposicione o mouse com a cabeça proximal e distal em relação ao pesquisador os pés.</li>
	<li>Encontrar o ducto biliar comum e lentamente injete 3 mL de solução de colagenase com uma seringa de 5 mL e agulha de 30g. Certifique-se que o ducto biliar e o pâncreas estão inflacionados após a injeção.</li>
	<li>Remova o pâncreas distendido, usando a pinça curvada e tesouras bem para separá-lo do descendente do cólon, intestinos, estômago e baço. Coloque o pâncreas em um tubo de 50 mL contendo 3 mL de solução de colagenase e mantê-lo no gelo.</li>
</ol>4. pâncreas digestão
<ol><li>Coloque cada tubo de 50 mL em um banho-37 ° C. Incubar durante 15-20 minutos (tempo varia com a tensão e a idade dos ratos).</li>
	<li>Vibre o tubo usando um vórtice.</li>
	<li>4-5 pâncreas digerido em um coador grande coletor estéril da piscina e use uma colher para fazer com que o pâncreas desmoronar completamente. Use uma seringa de 10 mL e agulha 23G contendo solução de lavagem para pipetar com força as células digeridas fora da tela. Recolha a solução de lavagem em um tubo de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 97 x g a 4 ° C por 1 min e decante o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 25 mL de solução de lavagem para tubos e ressuspender o tecido vortexing suave. Spin para baixo os tecidos a 97 x g a 4 ° C por 1 min e decante o sobrenadante. Repita por 3 vezes. Tenha cuidado para não deslocar o tecido granulado.</li>
</ol>5. purificação de Ilhéus
<ol><li>Adicionar 10 mL de solução de purificação para a pelota de tecido lavado e ressuspender delicadamente o conteúdo.</li>
	<li>Delicadamente sobreposição de 5 mL de solução de isolamento sobre a solução de purificação. Tenha cuidado para manter uma interface líquida acentuada entre as duas soluções.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 560 x g a 4 ° C por 15 min com aceleração lenta e sem freio. Introduza a pipeta a interface e recolher a camada de ilhotas para novos tubos de 50 mL.</li>
	<li>Lave os ilhéus, conforme descrito na etapa 3.5.</li>
</ol>6. chapeamento e tratamento de células das ilhotas
<ol><li>Resuspenda as ilhotas em 10 mL de solução de cultura de Ilhéus, delicadamente misture bem e coloque 100 µ l/poço com uma pipeta multicanal para uma placa de 96 poços. Coloque aproximadamente 5 ilhotas por 96 bem.</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora de cultura de tecido para 12h.</li>
	<li>Centrifugar (112 x g) a placa de 96 poços e remover o meio de cultura.</li>
	<li>Dilua os químicos ambientais em meio de cultura de Ilhéus. Adicione 100 µ l de cada um dos diluentes a química em cavidades separadas da placa. Resuspenda as ilhotas em cada poço e incubar durante 12 horas a 37 ° C (a concentração varia para os diferentes produtos químicos ambientais).</li>
</ol>7. ROS manchando e medição
<ol><li>Após o tratamento de Ilhéus, lave com 1X PBS (200 µ l de cada poço-96). Nota: A concentração das substâncias químicas é como segue: AFB1: 3 µM, atrazina: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-estrogênio, PCB126: 10 µM, nonilfenol e BPA: 100 µM.</li>
	<li>Use o N-acetil cisteína (NAC) como um antioxidante para saciar ROS. Adicionar 5 mM do NAC para o diluente químico induzida por ROS e incubar durante 12 horas a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugue a placa de 96 a 112 x g e com solução de 5 µM de sonda fluorescente (H2-Diniz Melo-DA dissolvido na mídia RPMI), incubar a 37 ° C por 60 min.</li>
	<li>Lavar as células da ilhota tratada 3 vezes com PBS e medir a fluorescência com um leitor de microplacas em 488 nm. Nota: O acúmulo de DCF nas células pode ser medido por um aumento na fluorescência 530 nm quando a amostra está animada em 488 nm.</li>
	<li>Executar a secreção (GSIS) de insulina glicose-estimulada ensaio9 na indução ROS xenobiótico tratados ilhotas e Ilhéus não tratadas para medir os efeitos de xenobióticos sobre a função fisiológica das ilhotas pancreáticas.</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acumular evidências sugere que a exposição a substâncias químicas ambientais desempenha um papel importante no desenvolvimento do T2DM. Induzida por xenobióticos ROS tem sido reconhecida como um fator etiológico potencial, contribuindo para o desenvolvimento do T2DM. Os seres humanos são expostos a uma ampla gama de produtos químicos xenobióticos e há uma grande necessidade de técnicas de pesquisa de romance para efetivamente identificar os tóxicos do pâncreas e para investigar o mecanismo de toxicidade específico para a...

Aumento na prevalência de T2DM tornaram-se uma crise de saúde global nos últimos anos posando uma séria ameaça à saúde pública1. Muitos fatores foram encontrados para ser causalmente ligada ao desenvolvimento do T2DM, entre os quais, recorrentes achados sugerem que um ponto convergente comuns a esses fatores é a indução de estresse oxidativo, que leva à geração de excessiva ROS2 , 3.
Um amplo espectro de produtos químicos ambientais incluindo PCBs, dioxinas e BaP foi encontrado para induzir o estresse oxidativo, que pode prejudicar a função das células β do pâncreas e levar à resistência à insulina e T2DM4. Embora o nível fisiológico de ROS desempenha um papel importante nas funções celulares, exposição a ROS que excede a capacidade do sistema antioxidante resulta em danos de tecidos/células e leva a doenças5. Células β do pâncreas expressam um baixo nível de enzima antioxidante e assim são um alvo sensível para o dano mediada por estresse oxidativo6,7. A exposição crônica a níveis elevados de ROS foi mostrada para causar disfunção de células pancreáticas induzida por estresse5 bem como resistência à insulina no fígado e tecido adiposo8.
O objetivo geral deste projeto é desenvolver um ensaio baseada em célula de substâncias químicas de tela para seus potenciais de diabetogenic com base na sua indução de ROS em células pancreáticas. O pâncreas carece de desintoxicação metabólica e é um alvo sensível para dano induzido por xenobiótico6,7. Portanto, medindo diretamente o ROS gerado nas células do pâncreas, este ensaio deve fornecer uma aproximação direta da lesão induzida por produto químico no pâncreas. Para desenvolver este método, nós isolado de ilhotas pancreáticas do mouse, culta o ilhéu isolado sob condição de cultura celular com produtos químicos e utilizou a geração de ROS induzida por substância química como a leitura. Este procedimento é simples e eficaz na identificação de produtos químicos ROS-induzindo o ilhéu isolado; Isso pode ser desenvolvido para a investigação dos mecanismos de toxicidade que são específicos para o pâncreas em vitro.

<table><tbody><tr><td>10 vezes; Hank' s solução salina balanceada&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>solução de polissacarose/diatrizoato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA)</td>Leitor de microplacas de fluorescência <td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA de insulina de rato / camundongo</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>para centrífuga de placas de 96 poços</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>para leitura de fluorescência</td></tr></tbody></table>

um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais diabetogenic

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposição a certas substâncias químicas ambientais em humanos e animais foi encontrada para causar dano celular das células β do pâncreas que conduzirá ao desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Embora os mecanismos para o danos nas células β induzida em química foram clara e susceptível de ser complexo, uma constatação recorrente é que estes produtos químicos induzem o estresse oxidativo levando a geração de espécies de excessiva reativas de oxigênio (ROS) que induzem danos a célula β. Para identificar potenciais produtos químicos ambientais diabetogenic, isolamos as células de ilhotas pancreáticas de camundongos C57BL/6 e de células da ilhota cultivadas em placas de cultura de células 96 poços; em seguida, as células das ilhotas foram tratadas com produtos químicos e a geração de ROS foi detectada por 2', tintura fluorescente 7'-diclorofluoresceína (Diniz Melo-DA). Usando esse método, nós encontrou que o bisfenol A (BPA), Benzo [a] pireno (BaP) e os bifenilos policlorados (PCBs), poderia induzir altos níveis de ROS, sugerindo que eles podem potencialmente induzir danos nas células das ilhotas. Este método deve ser útil para a seleção diabetogenic xenobióticos. Além disso, as células das ilhotas culta também podem ser adaptadas para análise em vitro de toxicidade induzida por substância química nas células do pâncreas.

Uma micrografia de ilhéu isolado do saudável é mostrada na Figura 2, em que ilhéus tem uma forma redonda ou oval com relativamente uniforme tamanho (apesar de uniformidade de tamanho pode variar de cepa para cepa). Em seguida, investigamos as funções de ilhotas pancreáticas em um ensaio em vitro isolando o ilhéu e estimulando a secreção de insulina em ilhotas a cultura. A Figura 3 mostra a nossa análise típica do ensaio ...

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar células de ilhotas pancreáticas do mouse para as induções ROS de triagem pelos xenobióticos para identificar os potenciais químicos xenobióticos de diabetogenic.

Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

As células do pâncreas são um alvo sensível para danos induzidos por ROS, que estão associados ao desenvolvimento de diabetes tipo 2. Um ensaio baseado em células do pâncreas ajudará a identificar produtos químicos indutores de ROS. A principal vantagem desta técnica é usar células isoladas das ilhotas do pâncreas para identificação simples e eficaz dos produtos químicos indutores de ROS que podem ter os potenciais diabetogênicos adicionados.Este método também pode ser usado para uma análise in vitro dos efeitos de produtos químicos em uma função fisiológica do pâncreas, como uma secreção de insulina estimulada por glicose. Use um par de pinças curvas para prender o duodeno perto da posição do esfíncter de Oddi. Com outro par de pinças curvas, prenda a parede do duodeno para bloquear a via biliar.Encontre o ducto biliar comum e com uma agulha de calibre 30 e uma seringa de cinco mililitros, injete lentamente três mililitros de solução de colagenase. Em seguida, reposicione o mouse com a cabeça proximal e os pés distais. Certifique-se de que o ducto colédoco e o pâncreas estejam inflados após a injeção.Usando a pinça curva e uma tesoura fina, remova o pâncreas distendido para separá-lo do cólon descendente, intestinos, estômago e baço. Em seguida, coloque o órgão em um tubo de 50 mililitros contendo três mililitros de solução de colagenase e mantenha-o no gelo. Coloque cada tubo de 50 mililitros em um banho-maria a 37 graus Celsius e incube-os por 15 a 20 minutos.Vortex os tubos, depois agrupe de quatro a cinco órgãos digeridos em uma grande peneira estéril e use uma colher para quebrar completamente o pâncreas. Com uma agulha de calibre 23 e uma seringa de dez mililitros contendo solução de lavagem, pipete vigorosamente as células digeridas para fora da tela. Em seguida, colete a solução de lavagem em um tubo de 50 mililitros.Centrifugar os tubos a 97 g e quatro graus Celsius durante um minuto e decantar o sobrenadante. Adicione 25 mililitros de solução de lavagem aos tubos e ressuspenda o tecido por vórtice suave. Em seguida, gire o tecido e decanta o sobrenadante.Repita a lavagem três vezes, tomando cuidado para não desalojar o tecido peletizado. Para purificar as ilhotas, adicione dez mililitros de solução de purificação ao pellet de tecido lavado e ressuspenda suavemente o conteúdo. Aplique suavemente cinco mililitros de solução de isolamento na solução de purificação.Certifique-se de que uma interface líquida nítida seja mantida entre as duas soluções. Centrifugue o tubo a 560g a quatro graus Celsius por 15 minutos, com aceleração lenta e sem interrupção. Em seguida, insira a pipeta na interface e colete a camada de ilhotas.Transfira a solução para novos tubos de 50 mililitros antes de lavar a ilhota como acabamos de demonstrar. Depois de remover a lavagem final, adicione dez mililitros de solução de cultura de ilhotas e misture delicada e completamente para ressuspender as ilhotas. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microlitros por poço para os poços de uma placa de 96 poços.Incubar a placa em uma incubadora de cultura de tecidos por 12 horas. Em seguida, centrifugue a placa a 112g e remova o meio de cultura. Diluir os produtos químicos ambientais no meio de cultura das ilhotas.Adicione 100 microlitros de cada um dos diluentes químicos em poços separados da placa. Ressuspenda as ilhotas em cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por 12 horas. Após o tratamento químico das ilhotas, use 1x PBS para lavar as amostras.Em seguida, adicione cinco N-acetilcisteína milimolar ou NAC aos poços, como antioxidante para extinguir ROS e incubar as placas a 37 graus Celsius por 12 horas. Centrifugue a placa de 96 poços a 112g e, em seguida, adicione cinco soluções micromolares de sonda fluorescente e incube a placa a 37 graus Celsius por 60 minutos. Use PBS para lavar as células das ilhotas tratadas três vezes e use um leitor de microplacas a 480 nanômetros para medir a fluorescência.Finalmente, realizar a secreção de insulina estimulada por glicose, ou ensaio GSIS, nas ilhotas xenobióticas tratadas e não tratadas indutoras de ROS, para medir os efeitos xenobióticos na função fisiológica das ilhotas pancreáticas. Mostradas aqui, são ilhotas pancreáticas saudáveis, isoladas de camundongos C57 Black / 6, que são redondas ou ovais e são relativamente uniformes em tamanho. Neste ensaio GSIS, usando ilhotas isoladas estimuladas com glicose para secretar insulina, foi observada uma resposta dose-dependente.Quando ilhotas isoladas foram tratadas com os xenobióticos listados aqui, vários produtos químicos, incluindo Atrazina, BaP, BPA e PCB, causaram uma indução significativa de espécies reativas de oxigênio. No entanto, a adição de NAC foi capaz de extinguir a produção de ROS pelos tratamentos químicos. Além disso, as ilhotas pancreáticas pré-tratadas com PCB126 e BPA mostraram uma diminuição significativa na secreção de insulina em comparação com o grupo controle, confirmando o importante papel das EROs em causar danos à função fisiológica das células beta pancreáticas que levam ao DM2.Uma vez dominado, o isolamento das ilhotas do pâncreas pode ser feito em duas horas se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante usar a centrifugação gradiente para purificar as ilhotas dos outros detritos pancreáticos. Após este procedimento, outros métodos, como a secreção de insulina estimulada por glicose, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como os efeitos dos produtos químicos nas funções fisiológicas das ilhotas do pâncreas.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da toxicologia explorarem os potenciais diabetogênicos dos produtos químicos ambientais em células isoladas de ilhotas de pâncreas de camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar as ilhotas do pâncreas do camundongo e usar essas células das ilhotas para identificação.

a-murine-pancreatic-islet-cell-based-screening-for-diabetogenic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Isolamento Islet murino de pâncreas

Ensaiando in vitro a função das células β usando o mouse ilhotas isoladas de Langerhans é um componente importante no estudo da fisiopatologia do diabetes e terapêutica. Embora muitas aplicações a jusante estão disponíveis, este protocolo descreve especificamente a medida da intracelular monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) como um parâmetro essencial para definir a função das células β.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Em ensaios de colónias in vitro para a detecção de auto-renovação e diferenciação de células progenitoras isoladas a partir de pâncreas de murino adulto são concebidos. Nestes ensaios, progenitores pancreáticas dar origem a colónias de células no espaço 3-dimensional em meio semi-sólido contendo metilcelulose. Protocolos para a manipulação de células individuais e caracterização de colónias individuais são descritos.

In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas

desafios críticos para o campo de pesquisa do diabetes estão a compreender os mecanismos moleculares que regulam a replicação de células β dos ilhéus e desenvolver métodos para estimular a regeneração de células-β. Aqui um método de alto teor de rastreio para identificar e avaliar a actividade de promoção da replicação de células β de moléculas pequenas é apresentada.

A-alta conteúdo<em&gt; In Vitro</em&gt; Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

Nós descrevemos um método para o isolamento de células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal, seguidos por sequenciação do ARN de célula única. Esse método permite que as análises do desenvolvimento de linhagem endócrina do pâncreas, heterogeneidade e transcriptomic dinâmica de células.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intercelular na patogênese do Diabetes Induzido por Pancreatite Aguda.

Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Este protocolo descreve um método padronizado para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de rato Lewis, permitindo preparações de alto rendimento e alta pureza para uso direto em transplantes ou estudos in vitro .

Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Um método de evolução dirigida novo específico para o domínio da engenharia termoestabilidade foi desenvolvido e, consequentemente, para as enzimas bacteriolytic validado. Depois de apenas uma rodada de mutagénese ao acaso, uma enzima evoluiu bacteriolytic, PlyC 29C3, exibido duas vezes maior do que a actividade residual quando comparada com a proteína de tipo selvagem, após incubação a temperatura elevada.

Novo método de triagem para a evolução dirigida de enzimas termoestáveis ​​Bacteriolytic

Aprenda a isolar ilhotas pancreáticas de murinos para rastrear produtos químicos ambientais que induzem ROS e avaliar seu potencial diabetogênico em estudos de toxicologia.

Um rastreio de baseada em célula de murino ilhotas pancreáticas para produtos químicos ambientais Diabetogenic

Explorar mais vídeos