Name: Efeitos duplos de fatores derivado de células de Melanoma na diferenciação de adipócitos de medula óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a configurar um sistema de cocultura bidimensional para estudar a interação entre células de melanoma e adipócitos de medula óssea. Este método revela os efeitos duplos dos fatores derivados de tumores na diferenciação adiposa.

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Agradecemos Dov Zipori (Instituto de Ciência Weizmann, Rehovot, Israel) gentilmente para nos fornecer a célula do estroma murino medula óssea linha 14F1.1. Este estudo foi suportado por concessões do chinês Fundação Nacional da ciência Natural (n º 81771729) e a Universidade Yongchuan Hospital de Chongqing médica (n º s. YJQN201330; YJZQN201527).

Nota: Todas as células, usadas no presente protocolo devem ser adultos pelo menos três gerações após o descongelamento de células congeladas de estoque.
1. colheita fatores de derivado de células de Melanoma
<ol><li>
Preparações
	<ol>
<li>Obter células B16F10 e uma linhagem de células de melanoma de rato. Nota: Para este protocolo, uma linhagem de células de melanoma de rato foi obtida do banco de células-tronco da Academia Chinesa de Ciências.</li>
		<li>Fazer um meio completo para a cultura de células B16F10 (100 mL). Uso suplementado modificado águia de Dulbecco (DMEM) com 10% fetal de soro bovino (FBS), 50 U/mL de penicilina e 50 µ g/mL de estreptomicina.</li>
		<li>Fazer um meio livre de soro pela fome das células B16F10 (50 mL). Use DMEM meio sem FBS, 50 U/mL de penicilina e 50 µ g/mL de estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar o melanoma-condicionado médio (CM)
	<ol>
<li>Semente de 2,0 x 105 B16F10 células em um 100 mm prato com 10 mL de 10% FBS DMEM. Então Incube as células em uma incubadora de 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 por 24 h.</li>
		<li>Quando as células atingem cerca de 80% de confluência, remover o meio de cultura, lavar as células duas vezes com 5 mL de tampão fosfato salino (PBS) (1 x, pH 7,4) e substituir o medium com um 10 mL soro livre médio pela fome.</li>
		<li>Retorno das células para a incubadora para 18-24 h.</li>
		<li>Após a fome, recolher o meio condicionado (CM) com uma pipeta e transferi-lo para um tubo de centrífuga 50 mL. Nota: O meio condicionado é o sobrenadante das culturas de células B16F10. Certifique-se que as células B16F10 estão em boas condições antes de coletar o CM.</li>
		<li>Centrifugue o CM por 5 min a 1.000 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Pipetar o sobrenadante e transferir para um tubo estéril de fresco ou garrafa. Nota: Evite pipetagem fora o sedimento no fundo do tubo.</li>
		<li>Para remover os detritos de célula, filtre o CM por passagem através de um filtro de 0,45 µm seringa conectada em cima de um frasco estéril ou tubo. Nota: 0,22 µm de filtros são ideais para a CM de filtragem.</li>
		<li>Armazene o sobrenadante filtrado a-20 ° C até o uso. Nota: É melhor não armazenar o sobrenadante a-20 ° C por mais de um mês. Alternativamente, armazene o CM a-80 ° C por mais longos períodos de tempo para a diferenciação dos adipócitos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. indução de adipócitos de medula óssea por fatores de derivado de células de Melanoma
<ol><li>
Preparações
	<ol>
<li>Fazer 100 mL de adipogenic indução média28. Use um DMEM completo suplementado com 5 µ g/mL de insulina, 0.5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine e 1 µM de dexametasona. Armazená-lo para duas semanas a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare 100 mL de meio de manutenção de adipogenic. Usar um DMEM completa ou misturado com melanoma 50% CM suplementado com 5 µ g/mL de insulina.</li>
		<li>Fazer uma solução de óleo vermelho O estoque. Dissolver 30 mg de pó O vermelho de óleo em 10 mL de isopropanol (≥ 99.5%) e misturá-los bem pelo vórtice. Nota: Armazená-lo para 1 ano a 4 ° C.</li>
		<li>Fazer uma solução de óleo vermelho O trabalho. Na coifa, dilua a solução de estoque de óleo vermelho O (da etapa 2.1.3) com água deionizada na proporção de 3:2. Incubar a mistura durante 15 minutos à temperatura ambiente e filtrar através de um filtro de 0,22 µm antes da utilização. Nota: Utilize apenas a solução fresca de trabalho até 2 horas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diferenciação dos adipócitos
	<ol>
<li>Cultura uma célula do estroma linha 14F1.1 de medula óssea de rato29 em um prato de 60 mm com uma completa DMEM na confluência de 80% em uma incubadora de 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. Nota: Como alternativa, substitua 14F1.1 primário de células mesenquimais derivadas da medula óssea de30.</li>
		<li>Trypsinize as células com 1,5 mL de uma solução de tripsina 0,25% na incubadora para 1 a 2 min.</li>
		<li>Adicionar 5 mL de meio FBS de 10% para as células e contar o número de células com um hemocytometer de vidro; em seguida, ajuste a densidade de célula a aproximadamente 1 – 2 x 105/mL.</li>
		<li>Semente de 5 x 104 de 14F1.1 células por poço em uma placa de 24 com 0,5 mL de meio de indução de adipogenic. Após dois dias de incubação, as células atingir cerca de 90% de confluência. Nota: Este passo é muito crítico. Células do estroma da medula óssea não podem ser induzidas a adipócitos sem um meio de indução de adipogenic.</li>
		<li>Remover o meio de indução e lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS cada vez.</li>
		<li>Mude para 1 mL de meio de manutenção de adipogenic e continuar a cultura das células até a maturação dos adipócitos. Nota: Sob um microscópio, adipócitos parecem pequenas ou grandes bolhas de sabão e são muito fáceis de reconhecer. Geralmente, adipócitos maduros estão presentes em 6th ou 8° dia.</li>
		<li>Mancha os adipócitos maduros com óleo vermelho ou coletar os adipócitos para análise quantitativa do polymerase reação em cadeia (qPCR).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
A coloração dos adipócitos
	<ol>
<li>Lavagem a 14F1.1 diferenciadas células 2x com PBS e corrigi-los em 3,7% formaldeído por 1h.</li>
		<li>Enxagúe as células em 60% de isopropanol e deixe-os secar completamente.</li>
		<li>Adicionar 0,2 mL da solução de trabalho de óleo vermelho O nos poços e incube-lo à temperatura de 0,5 a 2 h.</li>
		<li>Lave as células com água para remover os corantes não acoplados.</li>
		<li>Fotografia os adipócitos tingidos sob um microscópio de luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coculture dos adipócitos de medula óssea com células de Melanoma
<ol><li>
Preparações
	<ol>
<li>Prepare o osso maduro adipócitos medula: induzir as células 14F1.1 em adipócitos maduros do BM em placas de 24 poços com o meio de indução de adipogenic por 2 dias e depois mantê-las em meio de manutenção de adipogenic por mais 6 a 8 dias.</li>
		<li>Preparar as células B16F10: cultura de células B16F10 em pratos de 60 mm com 5 mL de meio DMEM.</li>
		<li>Umedeça a inserção de membrana (por exemplo, transwell): Adicionar 150 µ l de meio DMEM FBS-livre para as 0,4 µm a inserções de tamanho dos poros da membrana e mergulhe-os em cima dos poços das placas 24-bem preenchidos com 500 µ l de meio DMEM FBS-livre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Configuração de coculture
	<ol>
<li>Lentamente a pipeta fora o médio de cada inserção. Nota: Não destrua a membrana ao remover o meio.</li>
		<li>As células B16F10 (0/103105106) a 0,4 µm poro insere de passo 3.2.1 de semente.</li>
		<li>Substitua o meio de manutenção de adipogenic dos poços com os adipócitos maduros da medula óssea da etapa 3.1.1. com 600 µ l de meio DMEM completo.</li>
		<li>Transferi as inserções preenchidas com as células B16F10 (da etapa 3.2.2) em cima dos poços com os adipócitos maduros da medula óssea (da etapa 3.2.3) para os experimentos de coculture.</li>
		<li>Incube as cocultures a 37 ° C e 5% de CO2 por 2 dias.</li>
		<li>Após 48 h de incubação, remover as inserções do coculture e depois lavar os adipócitos 2 x com 500 µ l de PBS 1x. Nota: Opcionalmente, colete as células B16F10 nas bulas para análise, se necessário.</li>
		<li>Mancha os adipócitos com a solução de óleo vermelho O trabalho ou coletar os adipócitos para análise de qPCR. Nota: Consulte o procedimento de coloração na etapa 2.3.</li>
		<li>Fotografia os adipócitos tingidos sob um microscópio de luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. análise do Gene Signature específicas dos adipócitos de qPCR
<ol><li>Adicionar 0,5 mL de reagente de isolamento de RNA de ready-to-use por alvéolo em uma placa de 24 na qual adipócito maduro está pronto para detectar.</li>
	<li>Siga um protocolo padrão para a extração de RNA e a síntese de cDNA31.</li>
	<li>Use o primer para 18S e GAPDH como o controle e CEBPα/β, PPARγ, FABP4, leptina, Pref-1 ou Adiponectina para a assinatura do gene específico dos adipócitos (tabela 1).</li>
	<li>Execute a seguinte reação em um termociclador: 95 ° C por 20 s, seguida de 40 ciclos de 95 ° C por 1 s e 60 ° C durante 20 s.</li>
	<li>Use o método deΔΔCt de–2 para calcular que a dobra altera32.</li>
</ol>

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<li>Shafat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+blasts+program+bone+marrow+adipocytes+to+generate+a+protumoral+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment.</a> Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).</li>
<li>Gazi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+lipid+translocation+between+adipocytes+and+prostate+cancer+cells+with+imaging+FTIR+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy.</a> The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).</li>
<li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+omega-6+PUFA+arachidonic+acid+and+bone+marrow+adipocytes+on+metastatic+spread+from+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).</li>
<li>Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+adipocyte-derived+CXCL1+and+CXCL2+contribute+to+osteolysis+in+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).</li>
<li>Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+metastasis+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Spinal metastasis in the elderly.</a> European Spine Journal. 12, Suppl 2 202-213 (2003).</li>
<li>Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+adipocyte+specification+and+necrosis+augment+tumor-associated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation.</a> Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).</li>
<li>Bochet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+promotes+breast+tumor+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 411 (1), 102-106 (2011).</li>
<li>Hirano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+adipogenesis+induction+by+conditioned+media+obtained+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells.</a> Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).</li>
<li>Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+arrangement+of+eukaryotic+cells+in+merged+hydrogels+combines+the+advantages+of+3-D+and+2-D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures.</a> Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Cocultures com inserções foram amplamente utilizados para estudar as interações de célula para célula. O sistema coculture 2D é uma maneira eficaz de observar como as duas partes crosstalk em vitro, pelo qual mostramos aqui dois efeitos diferentes de câncer orientado a célula na medula óssea de adipócitos. Muitos laboratórios têm utilizado este método para investigar o crosstalk entre adipócitos e câncer células6,12,,27...

Metástases ósseas são comuns entre pacientes com câncer avançado, mas um tratamento curativo é ainda não está disponível. Além de especializada em armazenamento de energia como gordura, adipócitos podem suportar o crescimento do tumor e metástases em medula óssea e outros órgãos1,2,3,4,5,6. Além disso, adipócitos desempenham um papel essencial na regulação câncer célula biologia7,8,9,10 e metabolismo4,11,12 ,13,14,15,16, como bem como em osso metástase1,4,12. No nicho de medula óssea, adipócitos também podem afetar o comportamento biológico do câncer células4,6,17. A interacção entre a medula óssea adipócitos e células de câncer com osteotropism é significativa para a compreensão da metástase óssea. No entanto, pouco se sabe.
Baseado nos estudos atuais, vários métodos são aplicados a adipócitos, incluindo duas ou três dimensões (2/3D) e ex vivo culturas17,18,19,20,21. Recentemente, Herroon et al desenhou uma nova abordagem de 3D-cultura para estudar as interações dos adipócitos de medula óssea com células de câncer22. Embora o coculture 3D é ideal para imitar fisiológicas interações entre adipócitos e câncer células na vivo, sofre pobre reprodutibilidade22,23. Em comparação com um sistema de coculture 2D, um sistema 3D coculture pode fornecer diferentes fenótipos celulares, tais como célula morfologia21,22,24,25,26. Além disso, a cultura ex vivo de fragmentos de tecido ósseo esponjoso isolado pode levar a uma consequência robusta de adipócitos de células de medula culta17.
Em contraste com os modelos anteriores, no entanto, o modelo de cultura celular 2D continua a ser uma técnica clássica, confiável e fácil para digitalização rapidamente as moléculas do candidato e os fenótipos mudados em adipócitos ou câncer células in vitro1, 4,6,12,15,27. Para entender melhor o crosstalk entre adipócitos de medula óssea e as células de melanoma, nós fornecemos um protocolo detalhado para um sistema 2D coculture dos adipócitos de medula óssea com células de melanoma.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td></td><td></td>11965092</tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash; 044</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metil-xantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Vermelho o</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Transwell insert</td><td>Millipore</td><td>MCHT24H48</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>hemocitômetro</td><td>Bio-Rad</td><td></td> Incubadora de cultura 1450016 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Bancada</td><td>Limpa Thermo</td> <td>Scientific-Microscopy</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Olympus-200</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&mu; Pontas de pipeta L</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP620</td><td></td></tr><tr><td>pontas de pipeta de 1.000 mL</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP628</td><td></td></tr></tbody></table>

efeitos duplos de fatores derivado de células de melanoma na diferenciação de adipócitos de medula óssea

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

O crosstalk entre adipócitos de medula óssea e células tumorais pode desempenhar um papel crítico no processo de metástase óssea. Uma variedade de métodos estão disponíveis para estudar a interferência significativa; no entanto, um sistema bidimensional transwell para coculture continua a ser um clássico, confiável e fácil caminho para este estudo de interferência. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que mostra o coculture de adipócitos de medula óssea e células de melanoma. No entanto, tal sistema coculture poderia não só contribuir para o estudo da transductions de sinal de celular das células cancerosas induzidas pela medula óssea adipócitos, mas também para o futuro mecanicista estudo de metástase óssea, que pode revelar novos alvos terapêuticos para o osso metástase.

Na medula óssea, adipócitos podem aparecer no tumor microambiente1,13,33,34,35 numa fase precoce para apoiar a progressão do tumor através de fatores solúveis ou Ativando a12,osteoclastogenesis6,36, especialmente no contexto da obesida...

Aqui, apresentamos um sistema confiável e simples bidimensional coculture (2D) para estudar a interação entre as células do tumor e da medula óssea de adipócitos, que revela um duplo efeito de fatores derivado de células de melanoma em adipócitos a medula óssea diferenciação e também coloca um método clássico para o estudo mecanicista da metástase óssea.

Efeitos duplos de fatores derivado de células de Melanoma na diferenciação de adipócitos de medula óssea

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de pesquisa de metástases ósseas, como quais mudanças são induzidas no crescimento dos adipócitos da medula óssea e seu desenvolvimento em um microambiente de câncer. As grandes vantagens desta técnica são que ela é fácil de executar e que as moléculas candidatas podem ser obtidas rapidamente. Este método pode fornecer informações sobre a interferência entre os adipócitos da medula óssea e as células do melanoma.Também pode ser aplicado a outros tipos de células, como osteoblastos. Comece semeando duas vezes 10 até a quinta célula de melanoma B16F10 em uma placa de 100 milímetros com 10 mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS, para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. No dia seguinte, lave a cultura de células com cerca de 80% de confluência duas vezes com cinco mililitros de PBS por lavagem e deixe as células morrerem de fome com 10 mililitros de meio de cultura sem soro na incubadora de cultura de células por 18 a 24 horas.No dia seguinte, use uma pipeta para transferir o sobrenadante condicionado para um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação e carregue o meio em uma seringa equipada com um filtro de poros de 0,45 mícron. Em seguida, coe a solução em um recipiente estéril para remover quaisquer detritos celulares restantes e armazene o meio condicionado a menos 20 graus Celsius por até um mês. Para induzir adipócitos da medula óssea, cultive células estromais da medula óssea F14 1.1 de camundongo em uma placa de 60 milímetros com DMEM completo para uma confluência de 80%.No estágio apropriado da cultura, colha as células com 1,5 mililitros de uma solução de tripsina a 0,25% por um a dois minutos a 37 graus Celsius. Quando as células se separarem, interrompa a reação enzimática com cinco mililitros de meio suplementado com 10% de FBS e ajuste as células para uma a duas vezes 10 elevado à quinta concentração de células por mililitro com meio de cultura suplementado com soro fresco. Semear cinco vezes 10 até a quarta célula em 0,5 mililitros de meio de indução adipogênico por poço em uma placa de 24 poços e retornar as células à incubadora de cultura de células por mais dois dias, até que atinjam cerca de 90% de confluência.Em seguida, substitua o sobrenadante por um mililitro de meio de manutenção adipogênico por poço e continue a cultivar as células até a maturação dos adipócitos. Quando as células parecerem bolhas de sabão pequenas a grandes sob microscopia de luz, lave esses adipócitos maduros duas vezes com PBS, seguido de fixação em 0,2 mililitros de formaldeído a 3,7% por uma hora. Enxágue as células fixas em 60% de isopropanol e deixe os poços secarem completamente.Adicione 0,2 mililitros de solução de trabalho Oil Red O às células para uma incubação de 30 a 120 minutos à temperatura ambiente e lave as células com água para remover qualquer corante não ligado para imagens dos adipócitos por microscopia de luz. Alternativamente, após sua maturação, adicione 0,5 mililitros de reagente de isolamento de RNA pronto para uso a cada poço de cultura de adipócitos e use os primers apropriados para confirmar a assinatura gênica específica dos adipócitos das células. Em seguida, execute a reação em um termociclador usando as configurações indicadas.Para configurar uma co-cultura de células de melanoma de adipócitos derivadas da medula óssea, primeiro adicione 150 microlitros de DMEM sem soro às câmaras internas de inserções de membrana de tamanho de poro de 0,4 mícron e coloque cada inserção em um poço de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de meio livre de soro por poço. Dilua as células de melanoma B16F10 de uma cultura de células a 80% para uma concentração experimentalmente apropriada em meio fresco sem soro e substitua o meio na câmara interna de cada inserto por 150 microlitros de células. Em seguida, substitua o sobrenadante do meio de manutenção adipogênico em cada poço de uma cultura de adipócitos de medula óssea madura 90% confluente por 600 microlitros de DMEM completo e transfira as inserções contendo células de melanoma para cada poço da placa de cultura de adipócitos maduros.Quando todas as inserções tiverem sido transferidas, coloque a placa na incubadora de cultura de células. Após dois dias, remova as inserções e lave o fundo de cada poço duas vezes com 500 microlitros de PBS por lavagem. Em seguida, core os adipócitos com a solução de trabalho Oil Red O ou analise a expressão gênica dos adipócitos por PCR quantitativo, conforme demonstrado.Os adipócitos maduros diferenciados em meio condicionado por tumor contêm gotículas lipídicas, permitindo que os adipócitos diferenciados sejam facilmente identificados pela coloração Oil Red O. A assinatura gênica específica do adipócito dessas células também pode ser confirmada por PCR quantitativo. Observa-se uma redução no armazenamento lipídico em adipócitos co-cultivados na presença de um grande número de células de melanoma, bem como uma desdiferenciação no fenótipo dos adipócitos, como evidenciado por uma diminuição da expressão gênica específica dos adipócitos nessas células anteriormente maduras.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar e configurar um sistema de co-cultura 2D para estudar as interações entre dois tipos diferentes de células.

dual-effects-melanoma-cell-derived-factors-on-bone-marrow-adipocytes

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra a diferenciação das células estromais da medula óssea (BMSCs) em adipócitos. No processo de duas etapas, na presença de fatores de crescimento e hormônios específicos, as BMSCs indiferenciadas primeiro se diferenciam em pré-adipócitos. A segunda etapa envolvendo o tratamento com glicose e insulina leva à formação de adipócitos maduros com múltiplas gotículas lipídicas.

Diferenciação de células estromais da medula óssea de camundongos in vitro em adipócitos

O tecido adiposo (TA) pode influenciar a homeostase de todo o corpo, portanto, entender os mecanismos moleculares de diferenciação e função dos adipócitos é importante. Fornecemos um protocolo para obter novos insights sobre esses processos, analisando a homeostase, diferenciação e exposição à hipóxia dos adipócitos como um modelo para a apoptose induzida de adipócitos.

Mecanismo do Regulamento de Números de adipócitos em adultos Organismos através da diferenciação e apoptose homeostase

Em organismos multicelulares, os fatores solúveis secretados provocam respostas de diferentes tipos de células como resultado da sinalização parácrina. Os sistemas de co-cultura de inserção oferecem uma maneira simples de avaliar as mudanças mediadas por fatores solúveis secretados na ausência de contato célula-célula.

Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

Aqui, relatamos um método para o isolamento das populações de células progênitentes de adipócitos (APC) do tecido de tecido adiposo perivascular (PVAT) usando a classificação celular celular ativada por magnética (MCS). Este método permite um maior isolamento de APC por grama de tecido adiposo quando comparado à Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Expansão e adipogênese Indução de progenitores de adipócitos do tecido adiposo perivascular isolado pela classificação de células ativadas magnéticas

Os métodos tradicionais de avaliação adipogenic diferenciação são baratos e fáceis de usar, mas não são específicos para alterações na expressão gênica. Nós desenvolvemos um ensaio para quantificar a diferenciação de células mesenquimais em adipócitos maduros, usando um marcador específico de linhagem. Este ensaio tem diversas aplicações através de pesquisa básica e clínica médica.

Visualização e quantificação de células mesenquimais Adipogenic diferenciação potencial com um marcador específico da linhagem

A diferenciação dos adipócitos brancos e bege de tecido adiposo vascular progenitores tem potencial para melhoria metabólica em obesidade. Descrevemos os protocolos para um CD34 + CD31 + isolamento de células endoteliais de gordura humana e uma subsequente em vitro expansão e diferenciação em adipócitos brancos e bege. Diversas aplicações a jusante são discutidas.

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

O procedimento a seguir descreve um método para o controle espacial e temporal da iniciação do tumor melanocítico na pele dorsal murina, utilizando um modelo de camundongo geneticamente projetado. Este protocolo descreve macroscópica assim como a iniciação Cutaneous microscópica da melanoma.

Controle espacial e temporal da iniciação de melanoma murino de células-tronco de melanócitos mutantes

O protocolo permite a geração de uma população de adipócitos puros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). O ácido retinóico é usado para diferenciar iPSCs em células-tronco mesenquimais (CTMs) que são usadas para produzir adipócitos. Em seguida, uma abordagem de classificação baseada na coloração vermelha do Nilo é usada para obter adipócitos puros.

Diferenciação Robusta de iPSCs Humanas em uma População Pura de Adipócitos para Estudo de Distúrbios Associados a Adpócitos

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Este artigo descreve um protocolo para a propagação de células tumorais circulantes do líquido cefalorraquidiano (LCR-CTCs) coletadas de pacientes com doença leptomeníngea associada ao melanoma (M-LMD) para desenvolver modelos pré-clínicos para estudar M-LMD.

Ex Vivo Cultura de Células Tumorais Circulantes no Líquido Cefalorraquidiano de Pacientes com Melanoma para Estudo da Doença Leptomeníngea Associada ao Melanoma

Aprenda a configurar um sistema de cocultura bidimensional para estudar a interação entre células de melanoma e adipócitos de medula óssea. Este método revela os efeitos duplos dos fatores derivados de tumores na diferenciação adiposa.

Efeitos duplos de fatores derivado de células de Melanoma na diferenciação de adipócitos de medula óssea

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