Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

O objetivo geral deste procedimento é criar uma linhagem transgênica de peixe-zebra que permita a observação de alterações elétricas celulares durante a embriogênese, o movimento larval e na gênese do tumor. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia do desenvolvimento, fisiologia e biologia de células cancerígenas, como quais são os papéis fundamentais da sinalização elétrica celular durante a embriogênese e nas células tumorais? A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite rastrear a sinalização elétrica celular in vivo e em tempo real.

Depois de preparar o mRNA da transposase Tol2 e a solução de injeção de acordo com o protocolo de texto, na tarde anterior à injeção, configure de quatro a seis tanques de reprodução com pelo menos dois machos e duas fêmeas. Para reduzir a quantidade de resíduos de peixes e induzir uma resposta reprodutiva, evite alimentar os peixes à tarde. Na manhã seguinte, remova a solução de injeção preparada do freezer negativo de 80 graus Celsius e coloque-a no gelo.

Puxe as divisórias nos tanques de criação de peixes e deixe os peixes acasalarem. Em geral, os peixes põem ovos em 20 a 30 minutos. Enquanto espera, usando um extrator de micropipeta com os seguintes parâmetros, puxe as agulhas do vidro capilar.

Use um lenço de laboratório para quebrar a ponta da agulha e criar uma borda chanfrada. Um diâmetro menor é preferido para diminuir a mortalidade embrionária. Depois que os peixes botarem ovos, colete-os em uma placa de Petri de 10 centímetros de diâmetro.

Imediatamente sob o microscópio de dissecação, remova todos os embriões anormais e resíduos de peixes. Em seguida, pipete os embriões fertilizados em um molde de injeção de 3% de agarose preparado. Remova o excesso de água para ajudar a manter os embriões no lugar.

Uma vez que todas as fileiras estejam cheias de embriões viáveis, organize-as de forma que as células individuais sejam orientadas em um ângulo de 45 graus horizontalmente em relação à agulha. Isso tornará a injeção muito mais fácil mais tarde. Em seguida, usando luvas, use uma ponta de pipeta de carregamento de 20 microlitros para remover cinco microlitros da construção preparada do tubo no gelo.

Insira cuidadosamente a ponta da pipeta na extremidade traseira do tubo capilar quebrado até onde ele começa a afunilar para que o reagente fique o mais próximo possível da ponta e expulse-o para o capilar. Se ainda houver bolhas de ar, agite a agulha tomando cuidado para não quebrar a ponta. Insira a agulha diretamente no porta-agulha de microinjeção e aperte cuidadosamente até que a agulha permaneça no lugar.

Em seguida, ajuste o ângulo para cerca de 45 graus. Depois que a agulha estiver preparada e conectada, ligue o microscópio e o tanque de pressão de gás. Ajuste o volume de injeção usando aproximadamente 0.5 PSI para segurar e 30 PSI para ejeção.

Verifique se a solução é ejetada da agulha ao pressionar o pedal. Usando um micrômetro de estágio com uma gota de óleo mineral, ajuste o volume e o fluxo da solução para aproximadamente 10 micrômetros de diâmetro. Certifique-se de que a contrapressão permita que uma pequena quantidade de solução escorra da agulha.

Se não houver contrapressão suficiente, a ação capilar fará com que o líquido entre na agulha e destrua o mRNA. Uma vez que a agulha esteja calibrada, insira a agulha na única célula dos embriões fertilizados usando a borda do entalhe de gel para fornecer um suporte que mantenha o embrião no lugar e permita que a agulha aplique pressão sem mover o embrião. Assim que a ponta da agulha estiver na célula única, pressione o pedal para liberar a quantidade desejada de solução.

É importante injetar a solução na célula, não na gema, para gerar peixes-zebra transgênicos. Repita esse processo para todos os embriões. Quando terminar, use uma pipeta de transferência de 3,4 mililitros e água do sistema de peixes para transferir os embriões injetados para um prato rotulado, enxaguando-os do entalhe de agarose.

Armazene os embriões em uma incubadora de 28,5 graus Celsius para deixá-los se desenvolver. Verifique novamente ao longo do dia para remover embriões de peixes mortos e substituir a água por 0,1% de azul de metileno na água dos peixes. Cerca de seis a oito horas após a injeção, use 10 embriões de peixe injetados e o método hotshot para preparar o DNA genômico.

Na manhã seguinte, use um microscópio de dissecção com uma fonte de luz fluorescente para separar os embriões que apresentam GFP nos tecidos sem gema. Esses embriões devem conter a construção injetada. Efectuar um ensaio de excisão Tol2 para verificar a actividade do transposão, tal como descrito anteriormente.

Se for detectado plasma excisado, manter os embriões de peixe injetados e criá-los. Caso contrário, repita a síntese de mRNA de Tol2 e o processo de microinjeção até obter resultados positivos do ensaio de excise de Tol2. Para obter imagens de embriões de peixe-zebra, cruze vários peixes fundadores da geração F2 com peixes do tipo selvagem em pares individuais.

Colete embriões de peixes em diferentes estágios de desenvolvimento desejados de acordo com o guia de estadiamento do peixe-zebra. Para os embriões de peixes em estágio inicial na água do sistema de peixes, sob um escopo de dissecação, use um par de pinças para descascar e remover cuidadosamente os córions. Use uma pipeta de transferência de descarte para transferir alguns embriões para uma lâmina de vidro côncava com 3% de metilcelulose.

Em seguida, usando uma agulha embaixo de um escopo de dissecação, ajuste os embriões para as posições desejadas para visualizar a atividade celular da GFP. Para embriões no estágio inferior a 12 somitos, use um microscópio composto de epifluorescência com uma câmera compatível e software para imagens. Para embriões após o estágio 12 de somitos, use um microscópio de dissecção de fluorescência.

Para obter imagens da voltagem das células tumorais, primeiro identifique peixes com tumores malignos da bainha do nervo periférico ou MPNST. Coloque o peixe em uma placa de Petri de 10 centímetros de diâmetro e realize imagens de montagem completa. Finalmente, após a imagem, disseque o tumor antes de visualizar a atividade elétrica da célula tumoral.

Em uma injeção bem-sucedida, mais de 50% dos embriões injetados exibirão algum grau de GFP nas células somáticas e a maioria deles mostrará um resultado positivo do ensaio de excisão do transposon Tol2. Aqui, as mudanças no potencial da membrana foram examinadas ao longo do ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário inicial do peixe-zebra. Como visto neste vídeo de lapso de tempo, as células hiperpolarizaram antes da formação do sulco de clivagem.

Além disso, diferentes tecidos mostraram uma variedade de potenciais de membrana em embriões de peixes de um a três dias de idade. Por exemplo, o somito, e o notocord eram geralmente hiperpolarizados em comparação com os tecidos e órgãos adjacentes. Neste embrião de peixe de dois dias de idade, as atividades elétricas neuromusculares são mostradas durante o movimento com mudanças na densidade da cor correspondentes à transdução da sinalização elétrica.

As propriedades bioelétricas das células cancerígenas foram examinadas em embriões de cruzamentos de peixes repórteres ASAP1 com um mutante RPL35 que é propenso a MPNST espontâneo. Em comparação com os tecidos circundantes, as células tumorais eram mais polarizadas. Uma vez dominada, esta técnica de microinjeção pode ser feita em cerca de três horas se realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os embriões de peixe-zebra devem estar no estágio de uma célula para obter resultados ideais. Com seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento e da biologia celular explorarem in vivo as mudanças de sinalização elétrica no peixe-zebra e em outros organismos modelo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como criar uma linha de peixe-zebra transgênica por microinjeção.