Name: Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprenda a criar linhagens transgênicas de zebrafish para visualizar mudanças elétricas celulares durante embriogênese e formação tumoral em tempo real. Este método permite rastrear sinalização bioelétrica in vivo.

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O trabalho de pesquisa reportado nesta publicação foi apoiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, do institutos nacionais da saúde sob o prêmio número R35GM124913, programa de incentivo de PI4D Universidade de Purdue e PVM interno competitivo Programa de fundos de pesquisa básica. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial dos agentes de financiamento. Agradecemos a construção Tol2, Michael Lin para a construção de ASAP1, Koichi Kawakami e Leonard Zon para a promotora ubi construir através de Addgene.

O zebrafish estão alojados em instalações animais AAALAC-aprovado, e todos os experimentos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo cuidado do Animal de Purdue e Comissão de utilização (PACUC).
1. Tol2 Transposon plasmídeo construção preparação
Nota: Tol2, um transposon que foi descoberto no peixe medaka, tem sido amplamente utilizado na Comunidade de investigação o zebrafish8,9. Foi com sucesso adoptado para o Gateway site-specific recombinação sistema baseado em clonagem e conhecido como o Tol2 do kit10. O kit Tol2 permite uma maneira mais conveniente de criar construções personalizadas de expressão, enquanto também aumenta a eficiência da transgênese. Assim, foi uma decisão fácil para tirar vantagem deste sistema e criar uma linha onipresente de zebrafish expressão ASAP1 usando um promotor validado ubiquitin para conduzir ASAP111.
<ol><li>Criando uma construção de entrada meio ASAP1: pDONR221-ASAP1<ol>
<li>Adquira a construção de sensor ASAP1 tensão geneticamente codificado, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmídeo #52519), de Addgene. Para amplificar a região codificante ASAP1, configure uma PCR utilizando primers personalizados (attB1-ASAP1F e attB2-ASAP1R) ladeados com sequências attB na extremidade 5' dos primers (Figura 1). Phusion DNA polimerase foi escolhido por sua alta eficiência, e condições PCR foram otimizadas com base no protocolo previamente publicado12.</li>
		<li>Carregar os produtos PCR 50 µ l em um 1% TAE gel usando uma pipeta regular com dicas de 200 µ l e executar eletroforese em 160 V em um tanque de gel de horizontal por cerca de 30 min.</li>
		<li>Verifique o gel sob um transiluminador UV (353 nm), excisar a banda desejada usando um lâmina/bisturi sob um transiluminador UV como anteriormente publicado13,14e coloque a amostra do DNA contendo gel em microcentrifuga limpa 1,5 mL tubo.</li>
		<li>Execute o gel de purificação para os produtos de PCR ASAP1. Recuperar o DNA no gel extirpado usando um kit comercial de purificação gel ADN seguindo as instruções do fabricante e eluir o DNA em 20 µ l de água. Tomar 1 µ l de como uma amostra e medir a concentração de DNA utilizando um espectrofotômetro. Fluxo as instruções de software utilizando a água como um controle em branco15.</li>
		<li>Pegue 100 ng de purificado o produto do PCR e misturá-lo com 150 ng do plasmídeo pDONR221 em 10 µ l de TE buffer (10 mM Tris, pH de 1 mM EDTA 8.0)16. Adicionar 2 µ l de BP Clonase II para a reação e incubar a reação à temperatura ambiente durante a noite.</li>
		<li>No segundo dia, adicionar 1 µ l de proteinase K para a reação e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Execute a transformação. A reação de transferência e misturá-lo com 50 µ l de Top10 competentes de Escherichia coli células e incubar as células no gelo por 30 min. Em seguida, transferência imediatamente, o tubo de reação em um banho de água de 42 ° C por 1 min. Retire o tubo e incubar no gelo por 2 min. Em seguida, colocar o tubo em um shaker de 37 ° C e incube por 1h.</li>
		<li>Retire o tubo e as células em um prato de canamicina LB da placa. Em seguida, incubar a placa durante a noite (16-18 h) a 37 ° C.</li>
		<li>Escolha única e bem separadas colônias e inoculá-los em tubos de cultura de células de 14 mL com 3 mL de meio LB. Cultura-los durante a noite a 37 ° C em uma coqueteleira com uma velocidade de rotação de 250 rpm (rotação por minuto).</li>
		<li>Execute miniprep usando um kit miniprep comercial seguindo seu manual de instrução17.</li>
		<li>Sequência 3-4 plasmídeos com Sanger sequenciamento identificar positivo pDONR221-ASAP1 clones usando M13F e M13R iniciadores de sequenciamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Criando a construção Tol2 para microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1<ol>
<li>Escolha que o sequenciamento e verificados pela medida pDONR221-ASAP1 clone sua concentração de DNA usando uma sequência de espectrofotômetro a instruções de software utilizando a água como um espaço em branco controlar15.</li>
		<li>Pegue 100 µ g de pDONR221-ASAP1 e misture com 100 µ g de plasmídeo de 5-final do Tol2 kit (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µ g de p3E-polyA (kit de Tol2 #302) e 150 µ g de pDestTol2pA2 (kit de Tol2 #394). Ajustar o volume total de 8 µ l usando TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) numa microcentrifuga 1,5 mL do tubo e misture bem por um vórtice de breve s 2-5. Em seguida, adicionar 2 µ l de LR Clonase II plus e incubar a reação à temperatura ambiente durante a noite.</li>
		<li>No segundo dia, adicionar 1 µ l de proteinase K para a reação usando uma pipeta de 10 µ l e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.</li>
		<li>Realizar a transformação e identificar clones positivos, como descrito acima (passos 1.1.7-11).</li>
		<li>Medida a concentração de DNA de sequenciamento verificado clone pDestTol2-ubi-ASAP1 (figura 1B) usando um espectrofotômetro15. Normalmente, a concentração é em torno de 200ng / µ l.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. prepare Tol2 Transposase mRNA e injeção de solução
<ol><li>Raia Escherichia coli glicerol estoque de pCS2FA-transposase plasmídeo (kit de Tol2 #396) em uma placa LB (com 100 ampicilina µ g/mL) com uma ansa de inoculação esterilizado. Incube a placa a 37 ° C numa incubadora durante a noite. No dia seguinte, escolher uma única colônia e inoculá-lo em 3 mL de LB (Ampicilina 100 µ g/mL) com uma ponta de pipeta de 10 µ l esterilizado. Cultura-lo durante a noite a 37 ° C em uma coqueteleira com uma velocidade de rotação de 250 rpm.</li>
	<li>Execute miniprep na cultura de Escherichia coli usando um kit miniprep comercial seguindo seu manual de instruções. Eluir Plasmídeo em 30-50 µ l de tampão TE por 1 minuto centrifugação a 14.000 rpm e medir sua concentração de DNA com um espectrofotômetro.</li>
	<li>Linearizar 1-2 µ g do plasmídeo com eu não endonuclease e purificar o DNA com um DNA kit eu não seguindo o seu manual de instruções de limpeza digestão. Eluir o DNA em 5 µ l de água por centrifugação a 14.000 rpm por 1 minuto. A concentração esperada é de 200-300 ng / µ l.</li>
	<li>Executar em vitro transcrição com não eu linearizada transposase-pCS2FA como um modelo de DNA usando um kit de transcrição comercial SP6.</li>
	<li>Quando a reação estiver terminada, purifica Tol2 transposase mRNA usando um RNA de limpeza comercial kit seguindo as instruções do fabricante. Finalmente, eluir mRNA na água de RNAase livre 20 µ l e medir a concentração de RNA em um espectrofotômetro. A concentração esperada é sobre 1-3 µ g / µ l. as amostras podem ser armazenadas em um freezer-80 ° C, se necessário.</li>
	<li>Preparar a solução de microinjeção misturando 20 ng / µ l pDestTol2 -ubi-ASAP1 e Tol2 transposase mRNA (100 ng / µ l) em um tubo de microcentrifugadora por pipetagem. Para prevenir a degradação do ácido nucleico causada por repetidos descongelar e recongelar, alíquota 6 µ l pelo tubo e armazená-lo em um freezer-80 ° C para uso futuro.</li>
</ol>3. microinjection
<ol><li>Conjunto 4-6 tanques de criação pelo menos 2 machos e 2 fêmeas a tarde antes da injeção. Estes peixes não devem ser alimentados à tarde. Esta etapa irá reduzir a quantidade de resíduos de peixe e economizar tempo para limpá-los na manhã seguinte, enquanto também ajuda a induzir uma resposta de reprodução.</li>
	<li>Na manhã seguinte, retire a solução preparada de injeção (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construção e Tol2 mRNA) do congelador a-80 ° C e coloque-o no gelo.</li>
	<li>Puxe os divisores nas tanques de piscicultura e permitir que os peixes acasalar. Em geral, peixes depositam ovos dentro de 20-30 minutos depois de puxar para fora o divisor. Se não, espere 1-2 horas a mais. Alguns peixes não podem colocar ovos em tudo. Neste caso, repita este experimento para colheita de embriões de peixe.</li>
	<li>Enquanto espera, certifique-se que existem agulhas preparadas com a ponta quebrada em um ângulo, criando uma borda chanfrada com fórceps, ou quebrando em um limpador de tarefa delicada.<ol>
<li>Puxe as agulhas de vidro capilar um puxador de micropipeta usando os seguintes parâmetros: aqueça 545; Puxe a 60; velocidade 80; tempo 250; pressão de 500. Quebre a agulha com pinça debaixo de um escopo de dissecação (com a parte do olho régua para estimativa de diâmetro), mantendo-se a pinça a um ângulo de aproximadamente 45 °. Diâmetros de agulha desejada podem ser variável dependendo das configurações de microinjector, mas menor diâmetro é preferível para diminuir a mortalidade do embrião.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez que os peixes têm ovos, recolhê-los em um diâmetro de 10 cm de Petri e trazê-los para o escopo de dissecação. Remover todos os embriões anormais e resíduos de peixe.</li>
	<li>Pipetar os embriões fertilizados para a injeção de agarose preparado a 3% do molde. Remova o excesso de água para ajudar a manter os embriões no lugar.</li>
	<li>Uma vez que todas as linhas estão cheios de embriões viáveis, organizá-los para que as células únicas todas enfrentam o mesmo sentido em direção a agulha, que é aproximadamente um ângulo de 45° na horizontal. Isto facilitará injeção muito mais tarde.</li>
	<li>Usando luvas, usar uma pipeta de carregamento de 20 µ l ponta e retire o tubo no gelo 5 µ l de construção de preparado.</li>
	<li>Introduza cuidadosamente a ponta na extremidade traseira do tubo capilar quebrado até onde começa a seringueiro, para obter o reagente mais perto da ponta. Se ainda existem bolhas de ar, agite a seringa, certificando-se de não quebrar a ponta.</li>
	<li>Introduza a agulha direto para o suporte da agulha de microinjeção e aperte cuidadosamente até que a agulha permanece no lugar. Ajuste o ângulo de aproximadamente 45°.</li>
	<li>Uma vez que a agulha é preparada e ligada, ligue o microscópio e gás tanque de pressão. Comercial CO2 tanques são geralmente bons para essa finalidade. O volume de injeção é ajustado pela pressão de exploração e ejeção: aproximado de 0,5 psi para exploração e 30 psi para ejeção. Certifique-se de verificar que a solução vem quando pressionando o pedal.</li>
	<li>Usando um micrômetro de palco com uma gota de óleo mineral, ajustar o volume e o fluxo da solução a ~ 150 µm de diâmetro (cerca de 2 nL). Certifique-se de que a pressão de retorno vai deixar uma pequena quantidade a escorrer para fora da agulha. Se não houver pressão suficiente, ação capilar causará líquido inserir a agulha e destruir o mRNA.</li>
	<li>Uma vez que a agulha é calibrada, começam a injetar a construção para a única célula dos embriões fertilizados. Nota: Isto leva a uma grande quantidade de prática, paciência e sutileza, devido à membrana celular, sendo difícil de furar. É importante injectar a solução dentro da célula, não a gema, para a geração de zebrafish transgênico. Isso é diferente de Morpholinos injeção. Não importa de que lado a agulha entra na célula, enquanto a construção vai na célula. A transgênese terá uma taxa muito baixa de sucesso se injetado a gema ao invés da célula. Injeção de célula única fase também é importante, ou peixe Quimera somática será criado. Isso reduzirá a possibilidade do transgene entrando para as células germinativas.</li>
	<li>Use a borda do gel de entalhe para fornecer um revestimento protetor que mantém o embrião no lugar e permite que a agulha aplicar pressão sem mover o embrião. Uma vez que a ponta da agulha na única célula, pressione o pedal para liberar a quantidade desejada de solução. Repita este processo para todos os embriões.</li>
	<li>Quando concluído, transferi os embriões injetados num prato rotulado enxaguando-os fora do entalhe de agarose com sistema de água de peixes e uma pipeta de transferência descartável 3,4 mL. Armazene os embriões em uma incubadora de 28,5 ° C para deixá-los a desenvolver. Verifique volta ao longo do dia removendo embriões de peixe morto e substitua a água com azul de metileno 0,1% em água de peixe.</li>
	<li>Cerca de 6-8 horas após a injeção, tome 10 indivíduo injetado embriões de peixe e preparar o DNA genômico de-los usando o método de Hotshot18.</li>
	<li>Na manhã seguinte, use um microscópio de dissecação com uma fonte de luz de fluorescência para classificar para fora os embriões mostrando GFP nos tecidos não-gema. Estes embriões de peixe devem conter a construção injetada.</li>
	<li>Realize o ensaio de impostos especiais de consumo Tol2 para verificar a atividade do transposon conforme descrito anteriormente,19. Se o plasmídeo excisado pode ser detectado, manter o injetado embriões de peixe e criá-los. Se nenhum plasmídeo excisado pode ser detectado, repita o processo de síntese e microinjeção de mRNA Tol2 até alcançar os resultados positivos do ensaio de impostos especiais de consumo do Tol2.</li>
</ol>4. a criação de peixes transgênicos ASAP1, Tg (ubi: ASAP1)
<ol><li>Levante o peixe injetado (geração de0 F) até a idade adulta, conforme descrito anteriormente no zebrafish livro20. Isto geralmente leva cerca de 4 meses.</li>
	<li>Tirar um único adulto F0 peixe e cruzá-lo com um único oposto sexo sua peixe. Colete embriões de peixes após a criação no final do dia. Manter os embriões de peixes coletados na incubadora de 28,5 ° C em peixes de água com azul de metileno 0,1%.</li>
	<li>No terceiro dia, verifique os embriões de peixes debaixo de um microscópio fluorescente dissecação com um filtro GFP. Resolver os embriões de peixe verde, se houver algum e criá-los até a idade adulta como F1 geração transgénica peixe, Tg (ubi: ASAP1). Nota: Proporção mendeliana não é esperada uma vez que a maioria dos peixes0 F parentais é quimeras genética germinal.</li>
	<li>Cruze o único F1 peixes adultos com peixes de sua e coletar embriões de peixes. Resolver os embriões de peixe verde e criá-los para a vida adulta como F2 geração de peixe. Nota: Verde e embriões de peixe não-verde devem ser próximo de 1:1 se há um único transgene.</li>
	<li>Para exibir as alterações de potenciais elétricas no tumor como tumores de bainha de nervo periférico maligno (MPNST), atravessar a geração de2 F Tg (ubi: ASAP1) peixe com peixe rpl35hi258/wt . Sabe-se que tumores visíveis começam a ser encontrados em 6-8 meses de idade adultos21,22.</li>
</ol>5. imaging
<ol><li>Que imagem zebrafish embriões tomar múltiplos fundador de geração F2 peixes e cruzá-los com sua peixe pares individuais. Colete embriões de peixe em diferentes estádios de desenvolvimento desejados, de acordo com o zebrafish encenando guia23.</li>
	<li>Para os estágios iniciais dos embriões de peixes, descascar e retirar chorions dos embriões com cuidado, usando um par de pinças em um escopo de dissecação de um diâmetro de 10 cm Petri com sistema de água de peixes.</li>
	<li>Transferi alguns embriões de peixe numa lâmina de vidro concaved com metilcelulose de 3%, utilizando uma pipeta de transferência descartável de 3,4 mL. Ajuste os embriões para as posições desejadas para visualizar a atividade celular de GFP usando uma agulha por baixo de um escopo de dissecação fluorescente.</li>
	<li>Para as fases móveis de embriões de peixes (mais de 12 palco somite), use o mesilato de metanosulfonato de 0,05% para anestesiar os embriões de peixe antes de transferi-los para slides. Brevemente, embriões de peixes foram surgiu em 0.05% tricaina mesilato em água de peixe até que eles pararam de natação e equilíbrio do corpo de perda. Além disso, adicione uma gota de mesilato de tricaina 0,05% com a metilcelulose no slide.</li>
	<li>Para menos de 12 embriões de peixe de estágio somite, use um microscópio composto de epi-fluorescência com uma câmera compatível e software para a imagem latente. Por mais de 12 embriões de peixe somite estágio, use um microscópio de fluorescência dissecação.</li>
	<li>Tensão de célula de tumor de imagem, primeiro, identificar os peixes com tumores MPNST. Em seguida, anestesia o peixe com mesilato de metanosulfonato de 0,05%. Para toda montagem imagem, coloque o peixe em um prato de Petri de 10-cm de diâmetro. Para visualizar a atividade elétrica de células de tumor, tumores de peixe podem ser dissecados para fora após toda montagem imagem.</li>
</ol>

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<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncogenomic+analysis+of+copy+number+alterations+in+human+and+zebrafish+tumors+enables+cancer+driver+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery.</a> PLoS Genetics. 9 (8), e1003734(2013).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+aneuploid+zebrafish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+have+genetic+alterations+similar+to+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).</li>
<li>Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+in+cell+cycle+and+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+Series+B%22%5BJournal%5D)">Potassium channels in cell cycle and cell proliferation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094(2014).</li>
<li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Imaging+of+Voltage+and+Calcium+Signals+Reveals+Neural+Processing+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li>
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<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Embora as atividades elétricas nível celular e tecidos durante o desenvolvimento embrionário e doença humana foram descobertas há muito tempo atrás, na vivo elétrica mudanças dinâmicas e seus papéis biológicos ainda permanecem em grande parte desconhecidos. Um dos maiores desafios é Visualizar e quantificar as alterações elétricas. Tecnologia de braçadeira do remendo é um quebra-through para acompanhamento de células únicas, mas sua aplicação aos embriões vertebrados é limitada, porque eles são compostos de muit...

Bioeletricidade refere-se a sinalização eléctrica endógeno mediada por canais iônicos e bombas localizadas na membrana celular1. Intercâmbio iônico através da membrana celular e as acoplado mudanças atuais e potenciais elétricas, é essencial para a sinalização de processos das células neuronais e musculares excitáveis. Além disso, bioeletricidade e gradientes de íons têm uma variedade de outras funções biológicas importantes, incluindo o armazenamento de energia, biossíntese e transporte do metabólito. Sinalização bioelétrica também foi descoberto como um regulador de formação embrionária padrão, tais como machados do corpo, o ciclo celular e de diferenciação celular1. Assim, é fundamental para a compreensão de muitas doenças congênitas humanas que resultam do Regulamento mis deste tipo de sinalização. Embora a braçadeira do remendo tem sido amplamente utilizada para gravação de células únicas, é ainda longe do ideal para o monitoramento simultâneo de várias células durante o desenvolvimento embrionário em vivo. Além disso, pequenas moléculas sensíveis de tensão também não são ideais para aplicações em vivo devido às suas especificidades, sensibilidades e toxicidades.
A criação de uma variedade de geneticamente codificado fluorescente tensão indicadores (GEVIs) oferece um novo mecanismo para superar este problema e permite a fácil aplicação estudar o desenvolvimento embrionário, mesmo que eles foram originalmente destinados para monitoramento neural células de2,3. Dentre os GEVIs atualmente disponíveis é o acelerado Sensor de potenciais de ação 1 (ASAP1)4. É composto por um loop extracelular de um domínio sensor de tensão de tensão sensível fosfatase e uma circular permutada proteína verde fluorescente. Portanto, ASAP1 permite a visualização de alterações de potenciais elétricas celulares (polarização: verde brilhante; despolarização: verde-escuro). ASAP1 tem 2 ms sobre-e-off cinética e pode seguir abaixo do limite potencial mudança4. Assim, esta ferramenta genética permite um novo nível de eficácia no monitoramento em tempo real bioelétrica em células vivas. Mais compreensão dos papéis de bioeletricidade no desenvolvimento embrionário e muitas doenças humanas, tais como câncer, derramará nova luz sobre os mecanismos subjacentes, que é fundamental para a prevenção e tratamento da doença.
Zebrafish provaram um poderoso modelo animal para estudar a biologia do desenvolvimento e doenças humanas, incluindo o câncer5,6. Eles compartilham genes ortólogos de 70% com os humanos, e eles têm biologia vertebrada semelhante7. Zebrafish fornecer cuidados relativamente fácil, um tamanho de embreagem grande de ovos, genética tractable, transgênese fácil e desenvolvimento embrionário externo transparente, que faz com que um sistema superior na vivo de imagem5,6. Com uma grande fonte de linhas de peixes mutantes já presentes e um genoma completamente sequenciado, zebrafish fornecerá uma variedade relativamente ilimitada de descoberta científica.
Para investigar na vivo em tempo real atividade elétrica das células, aproveitamos o sistema modelo de zebrafish e ASAP1. Neste artigo, descrevemos como incorporar o biosensor fluorescente tensão ASAP1 no genoma da zebrafish usando Tol2 transposon transgênese e visualizar a atividade elétrica celular durante o desenvolvimento embrionário, movimento larvas de peixe e no tumor ao vivo .

<table><tbody><tr><td>Tubos de cultura de células de 14mL</td><td>VWR</td><td>60818-725 Tanque de</td><td></td></tr><tr><td>eletroforese de agarose</td> de cultura de E.Coli <td>Thermo Scientific</td><td>Owl B2</td><td>DNA eletroforese</td></tr><tr><td>Agarose RA</td><td>Amresco</td><td>N605-500G</td><td>Para fazer os géis de injeção</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F primer</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA</td><td>Amplificação da região codificante ASAP1 para subclonagem</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R primer</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td><td>Amplificação da região codificadora ASAP1 para subclonagem</td></tr><tr><td>Escopo de dissecção de campo claro</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Descorionação, microinjeção, montagem</td></tr><tr><td>Câmera colorida</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc</td><td>Embrião de peixe </td></tr><tr><td>Lâmina côncava</td> para gravação de imagens <td>VWR</td><td>48336-001</td><td>Para segurar embriões de peixe durante o processo de imagem</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência descartável 3,4 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Embriões de peixe e transferência de água</td></tr><tr><td>Enzima endonuclease, não I</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td>Para plasmídeo linearizante DNA</td></tr><tr><td>Escopo composto epifuorescent</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>Fish imagem embrionária</td></tr><tr><td>Escopo de dissecção estéreo epifuorescent</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>Imagem embrionária de peixe</td></tr><tr><td>Fonte de luz fluorescente Dinâmica</td> do <td>lúmen</td><td>X-cite seris 120</td><td>Fonte de luz para microscópios de fluorescência</td></tr><tr><td>Fórceps #5</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Decorionação e quebra de agulha</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Mistura enzimática</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>Clonagem de recombinação Gateway BP</td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Plus enzima</td><td>Thermo Scientific</td><td>12538120</td><td>Clonagem de recombinação Gateway LR</td></tr><tr><td>Kit de recuperação de DNA em gel</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td>Purificação de gel de DNA</td></tr><tr><td>Ponta de carregamento</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Para carregar solução de injeção em agulhas capilares</td></tr><tr><td>Metilcelulose (1600cPs)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>Montagem de embriões de peixe</td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Suprime surtos de fungos em placas de Petri</td></tr><tr><td>Molde de microinjeção</td><td>Ferramentas de ciência adaptativa</td><td>TU-1</td><td>Para preparar a bandeja de molde de agaorse para segurar embriões de peixe durante a injeção</td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>WPI</td><td>Pneumático Picopump PV820</td><td>Injetor de microinjeção</td></tr><tr><td>Micro-manipulador</td><td>WPI</td><td>Microinjetor MM3301R</td><td>Operação de</td></tr><tr><td>microinjeção Extrator de micropipeta</td><td>Instrumento</td><td>Sutter P-1000</td><td>Para preparar agulha capilar</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Amresco</td><td>J217-500ml</td><td>Para calibrar o volume de injeção</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcrição</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1340</td><td>mRNA transcrição in vitro</td></tr><tr><td>Câmera monocolor</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm</td><td>Gravação de imagens de embriões de peixes</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4020</td><td>Preparar pequena quantidade de DNA plasmidial</td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Para segurar peixes ou embriões de peixes durante o processo de imagem</td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrador-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>mRNA limpeza após transcrição in vitro</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Para medir as concentrações de DNA e RNA</td></tr><tr><td>Micrômetro de estágio</td><td>Am Scope</td><td>MR100</td><td>Calibração de volume de microinjeção</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>Amplificação de DNA para clonagem de genes</td></tr><tr><td>Parede fina capilares de vidro</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>Vidro cru para fazer agulha cappilar</td></tr><tr><td>Tol2-exL1 primer</td><td>IDT DNA</td><td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td><td>Tol2 ensaio de consumo Tol2-exR</td></tr><tr><td>primer</td><td>IDT DNA</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td><td>Tol2 ensaio de consumo</td></tr><tr><td>TOP10 E. coli quimicamente competente</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404006</td><td>Usado para transformação durante a clonagem de genes</td></tr><tr><td>Mesilato de tricaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Para anestesiar peixes ou embriões de peixes</td></tr><tr><td>Trans-iluminador UV 302nm</td><td>UVP</td><td>M-20V</td><td>Visualização de DNA</td>Banho-maria</tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>2853</td><td>Para processo de transformação de clonagem de genes</td></tr></tbody></table>

visualização da atividade elétrica celular no zebrafish embriões adiantados e tumores

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioeletricidade, sinalização eléctrica endógeno mediada por canais iônicos e bombas localizadas na membrana celular, desempenha papéis importantes na sinalização de processos das células neuronais e musculares excitáveis e muitos outros processos biológicos, tais como embrionárias padronização do desenvolvimento. No entanto, há uma necessidade na vivo monitoramento da atividade elétrica em vertebrados embriogênese. Os avanços dos indicadores de voltagem fluorescente geneticamente codificado (GEVIs) tornaram possível fornecer uma solução para este desafio. Aqui, descrevemos como criar um indicador de tensão transgénicos zebrafish usando o indicador de tensão estabelecida, ASAP1 (acelerado Sensor de potenciais de ação 1), por exemplo. O kit de Tol2 e um promotor de zebrafish onipresente, ubi, foram escolhidos neste estudo. Nós também explicar os processos de clonagem de site-specific Gateway Tol2 baseados em transposon zebrafish transgênese e o processo de imagem para tumores de embriões e peixes peixes fase inicial usando regular epifluorescente microscópios. Usando esta linha de peixe, achamos que há mudanças de tensão elétrica celular durante a embriogênese de zebrafish e movimento de larvas de peixes. Além disso, observou-se que em alguns zebrafish tumores de bainha de nervo periférico maligno, o tumor de células foram geralmente polarizadas em comparação com os tecidos normais circundantes.

Em uma injeção bem sucedida, mais do que embriões de peixe 50% injetado irão exibir algum grau de fluorescência verde nas células somáticas, e a maioria deles será positiva por meio de ensaio Tol2 transposon impostos especiais de consumo (Figura 2). Após 2-4 gerações de para fora-Cruz com sua peixes (até que o peixe fluorescente chegar a 50%, a proporção mendeliana esperada), os peixes transgênicos foram utilizados para o experimento de imagem para controlar ...

Aqui, mostramos o processo de criação de uma linha de zebrafish do repórter de tensão elétrica celular para visualizar o desenvolvimento embrionário, movimento, e células de tumor de peixe em vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

O objetivo geral deste procedimento é criar uma linhagem transgênica de peixe-zebra que permita a observação de alterações elétricas celulares durante a embriogênese, o movimento larval e na gênese do tumor. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia do desenvolvimento, fisiologia e biologia de células cancerígenas, como quais são os papéis fundamentais da sinalização elétrica celular durante a embriogênese e nas células tumorais? A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite rastrear a sinalização elétrica celular in vivo e em tempo real.Depois de preparar o mRNA da transposase Tol2 e a solução de injeção de acordo com o protocolo de texto, na tarde anterior à injeção, configure de quatro a seis tanques de reprodução com pelo menos dois machos e duas fêmeas. Para reduzir a quantidade de resíduos de peixes e induzir uma resposta reprodutiva, evite alimentar os peixes à tarde. Na manhã seguinte, remova a solução de injeção preparada do freezer negativo de 80 graus Celsius e coloque-a no gelo.Puxe as divisórias nos tanques de criação de peixes e deixe os peixes acasalarem. Em geral, os peixes põem ovos em 20 a 30 minutos. Enquanto espera, usando um extrator de micropipeta com os seguintes parâmetros, puxe as agulhas do vidro capilar.Use um lenço de laboratório para quebrar a ponta da agulha e criar uma borda chanfrada. Um diâmetro menor é preferido para diminuir a mortalidade embrionária. Depois que os peixes botarem ovos, colete-os em uma placa de Petri de 10 centímetros de diâmetro.Imediatamente sob o microscópio de dissecação, remova todos os embriões anormais e resíduos de peixes. Em seguida, pipete os embriões fertilizados em um molde de injeção de 3% de agarose preparado. Remova o excesso de água para ajudar a manter os embriões no lugar.Uma vez que todas as fileiras estejam cheias de embriões viáveis, organize-as de forma que as células individuais sejam orientadas em um ângulo de 45 graus horizontalmente em relação à agulha. Isso tornará a injeção muito mais fácil mais tarde. Em seguida, usando luvas, use uma ponta de pipeta de carregamento de 20 microlitros para remover cinco microlitros da construção preparada do tubo no gelo.Insira cuidadosamente a ponta da pipeta na extremidade traseira do tubo capilar quebrado até onde ele começa a afunilar para que o reagente fique o mais próximo possível da ponta e expulse-o para o capilar. Se ainda houver bolhas de ar, agite a agulha tomando cuidado para não quebrar a ponta. Insira a agulha diretamente no porta-agulha de microinjeção e aperte cuidadosamente até que a agulha permaneça no lugar.Em seguida, ajuste o ângulo para cerca de 45 graus. Depois que a agulha estiver preparada e conectada, ligue o microscópio e o tanque de pressão de gás. Ajuste o volume de injeção usando aproximadamente 0.5 PSI para segurar e 30 PSI para ejeção.Verifique se a solução é ejetada da agulha ao pressionar o pedal. Usando um micrômetro de estágio com uma gota de óleo mineral, ajuste o volume e o fluxo da solução para aproximadamente 10 micrômetros de diâmetro. Certifique-se de que a contrapressão permita que uma pequena quantidade de solução escorra da agulha.Se não houver contrapressão suficiente, a ação capilar fará com que o líquido entre na agulha e destrua o mRNA. Uma vez que a agulha esteja calibrada, insira a agulha na única célula dos embriões fertilizados usando a borda do entalhe de gel para fornecer um suporte que mantenha o embrião no lugar e permita que a agulha aplique pressão sem mover o embrião. Assim que a ponta da agulha estiver na célula única, pressione o pedal para liberar a quantidade desejada de solução.É importante injetar a solução na célula, não na gema, para gerar peixes-zebra transgênicos. Repita esse processo para todos os embriões. Quando terminar, use uma pipeta de transferência de 3,4 mililitros e água do sistema de peixes para transferir os embriões injetados para um prato rotulado, enxaguando-os do entalhe de agarose.Armazene os embriões em uma incubadora de 28,5 graus Celsius para deixá-los se desenvolver. Verifique novamente ao longo do dia para remover embriões de peixes mortos e substituir a água por 0,1% de azul de metileno na água dos peixes. Cerca de seis a oito horas após a injeção, use 10 embriões de peixe injetados e o método hotshot para preparar o DNA genômico.Na manhã seguinte, use um microscópio de dissecção com uma fonte de luz fluorescente para separar os embriões que apresentam GFP nos tecidos sem gema. Esses embriões devem conter a construção injetada. Efectuar um ensaio de excisão Tol2 para verificar a actividade do transposão, tal como descrito anteriormente.Se for detectado plasma excisado, manter os embriões de peixe injetados e criá-los. Caso contrário, repita a síntese de mRNA de Tol2 e o processo de microinjeção até obter resultados positivos do ensaio de excise de Tol2. Para obter imagens de embriões de peixe-zebra, cruze vários peixes fundadores da geração F2 com peixes do tipo selvagem em pares individuais.Colete embriões de peixes em diferentes estágios de desenvolvimento desejados de acordo com o guia de estadiamento do peixe-zebra. Para os embriões de peixes em estágio inicial na água do sistema de peixes, sob um escopo de dissecação, use um par de pinças para descascar e remover cuidadosamente os córions. Use uma pipeta de transferência de descarte para transferir alguns embriões para uma lâmina de vidro côncava com 3% de metilcelulose.Em seguida, usando uma agulha embaixo de um escopo de dissecação, ajuste os embriões para as posições desejadas para visualizar a atividade celular da GFP. Para embriões no estágio inferior a 12 somitos, use um microscópio composto de epifluorescência com uma câmera compatível e software para imagens. Para embriões após o estágio 12 de somitos, use um microscópio de dissecção de fluorescência.Para obter imagens da voltagem das células tumorais, primeiro identifique peixes com tumores malignos da bainha do nervo periférico ou MPNST. Coloque o peixe em uma placa de Petri de 10 centímetros de diâmetro e realize imagens de montagem completa. Finalmente, após a imagem, disseque o tumor antes de visualizar a atividade elétrica da célula tumoral.Em uma injeção bem-sucedida, mais de 50% dos embriões injetados exibirão algum grau de GFP nas células somáticas e a maioria deles mostrará um resultado positivo do ensaio de excisão do transposon Tol2. Aqui, as mudanças no potencial da membrana foram examinadas ao longo do ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário inicial do peixe-zebra. Como visto neste vídeo de lapso de tempo, as células hiperpolarizaram antes da formação do sulco de clivagem.Além disso, diferentes tecidos mostraram uma variedade de potenciais de membrana em embriões de peixes de um a três dias de idade. Por exemplo, o somito, e o notocord eram geralmente hiperpolarizados em comparação com os tecidos e órgãos adjacentes. Neste embrião de peixe de dois dias de idade, as atividades elétricas neuromusculares são mostradas durante o movimento com mudanças na densidade da cor correspondentes à transdução da sinalização elétrica.As propriedades bioelétricas das células cancerígenas foram examinadas em embriões de cruzamentos de peixes repórteres ASAP1 com um mutante RPL35 que é propenso a MPNST espontâneo. Em comparação com os tecidos circundantes, as células tumorais eram mais polarizadas. Uma vez dominada, esta técnica de microinjeção pode ser feita em cerca de três horas se realizada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os embriões de peixe-zebra devem estar no estágio de uma célula para obter resultados ideais. Com seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento e da biologia celular explorarem in vivo as mudanças de sinalização elétrica no peixe-zebra e em outros organismos modelo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como criar uma linha de peixe-zebra transgênica por microinjeção.

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Fonte: Williams, A. L., et al. Imagem de lapso de tempo multifóton para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de células migratórias da crista neural em embriões de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo mostra um protocolo de imagem de lapso de tempo multifóton para visualizar a migração de células da crista neural em um embrião de peixe-zebra em tempo real com alta resolução.

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Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

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zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

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