Titulação ELISA como um método para determinar a constante de dissociação de interação do ligante do Receptor

O objetivo geral deste ELISA de titulação é determinar a constante de afinidade de dois parceiros de ligação de forma reprodutível e eficiente usando um algoritmo inovador. Este método pode ajudar a responder a questões-chave não apenas no campo da interação proteína-ligante e pesquisa de receptores, mas também em ciências da vida aplicadas, como pesquisa farmacêutica e farmacologia. A principal vantagem desta técnica é que a constante de afinidade de uma interação receptor-ligante pode ser determinada facilmente, titulando um receptor com um ligante em uma placa ELISA e usando um algoritmo de avaliação inovador.

Inicie este procedimento diluindo a solução estoque de Integrina Alfa 2 A Domínio para uma concentração final de cinco microgramas por mililitro em tampão TBS cloreto de magnésio. Tanto uma Integrina Alfa 2 A Domínio de tipo selvagem quanto uma mutante serão usadas nesta demonstração. Encha cada poço de uma linha em uma placa de microtitrage de área metade com 50 microliters da solução de revestimento Integrina Alfa 2 A Domínio.

Realize cada linha de titulação pelo menos em duplicatas. Neste exemplo, cada linha de titulação é realizada em quádruplas. Sele a placa com papel alumínio e deixe a placa a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, remova a solução de revestimento e encha cada poço com 15 microliters de tampão TBS cloreto de magnésio. Remova a solução de lavagem e encha os poços com nova solução de lavagem. As lavagens removerão moléculas de receptor solúveis que não foram imobilizadas na superfície de plástico por absorção física.

O próximo passo é bloquear os locais de ligação não específicos adicionando 50 microliters de solução de BSA 1% em tampão TBS cloreto de magnésio em cada poço. Resele a placa e incube à temperatura ambiente por uma hora. Enquanto os poços da placa de microtitrage estão sendo bloqueados com BSA, prepare uma diluição serial do ligante Rodocetina.

Uma concentração inicial de 243 Rodocetina desgastada e um fator de diluição de 2,3 são usados neste caso. Para as oito curvas de titulação neste experimento, prepare 920 microliters de solução de Rodocetina na concentração mais alta em BSA 1% em TBS cloreto de magnésio no tubo de ensaio número um. Pipete 520 microliters de solução de BSA 1% em TBS cloreto de magnésio em cada um dos outros dez tubos de ensaio rotulados de dois a onze.

Transfira 400 microliters da solução de Rodocetina do tubo de ensaio para o tubo de ensaio dois. Misture ambas as soluções por agitação e então transfira 400 microliters desta mistura para o tubo de ensaio três. Continue esta diluição serial até o tubo de ensaio onze.

Para o sucesso deste procedimento, é importante sempre encher rapidamente cada poço com solução para garantir que os poços não sequem. Na conclusão da incubação de uma hora, remova a solução de bloqueio dos poços da placa de microtitrage. Imediatamente adicione 50 microliters da solução de Rodocetina do tubo de ensaio um nos poços da coluna um, a solução do tubo de ensaio dois nos poços da coluna dois e continue até a coluna onze.

Adicione 50 microliters de BSA 1% e TBS cloreto de magnésio como um controle livre de ligante nos poços da coluna doze. Resele a placa e incube à temperatura ambiente por uma hora e meia. Para remover moléculas de ligante não ligadas, remova a solução de ligação e encha cada poço com 50 microliters de tampão HBS cloreto de magnésio.

Em seguida, remova o tampão HBS e adicione novo tampão HBS. Para fixar quimicamente o receptor e o ligante ligado, encha cada poço da placa de microtitrage com 50 microliters de uma solução de glutaraldeído 2,5% em tampão HBS cloreto de magnésio. Incubar a placa de microtitrage à temperatura ambiente por dez minutos.

Remova e inative o excesso de glutaraldeído removendo a solução de fixação e enchendo cada poço com 50 microliters de tampão TBS cloreto de magnésio. Remova o tampão de lavagem e adicione novo tampão de lavagem em cada poço. Para iniciar este ensaio, remova o tampão de lavagem de todos os poços da placa de microtitrage e adicione em cada poço 50 microliters da solução de anticorpo primário, diluída de um para dois mil em BSA 1% TBS cloreto de magnésio.

Resele a placa e incube-a à temperatura ambiente. Remova a solução de anticorpo primário de todos os poços e adicione em cada poço 50 microliters de tampão TBS cloreto de magnésio. Lave três vezes com tampão TBS cloreto de magnésio.

Em seguida, adicione em cada poço 50 microliters da solução de anticorpo secundário, diluída de um para dois mil em BSA 1% em TBS cloreto de magnésio. Resele a placa e deixe-a em repouso à temperatura ambiente. Remova a solução de anticorpo secundário dos poços e adicione em cada poço 50 microliters de tampão TBS cloreto de magnésio.

Lave três vezes. Após a terceira lavagem, dê leves batidas na placa de microtitrage sobre um pano de tecido para remover todos os vestígios de líquido. Usando uma pipeta multicanal, adicione prontamente 50 microliters da solução de detecção de fosfatase alcalina em cada poço da placa de microtitrage para iniciar a conversão enzimática o mais simultaneamente possível.

Inclua a placa à temperatura ambiente até que a solução nos poços com a maior concentração de ligante fique amarela. Dependendo da intensidade do sinal, o tempo de incubação pode variar entre cinco minutos e uma hora. Pare a conversão do substrato da fosfatase usando uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters de uma solução de hidróxido de sódio 1,5 molar em cada poço na mesma ordem em que a solução de detecção de fosfatase alcalina foi adicionada.

Deixe a placa por vários minutos para garantir a mistura sem estrias de ambas as soluções. Meça a densidade óptica em 405 nanômetros de cada poço usando um leitor ELISA. Inicie a análise de dados abrindo a tabela de dados brutos.

Copie as colunas do arquivo Excel, abra o Graph Pad Prism Five, abra um novo arquivo de projeto no Menu Principal e, sob novos dados e gráfico, escolha o formato X Y. Escolha a opção Inserir e Plotar um Ponto Único para cada valor para o eixo Y e cole-os na folha de dados do Graph Pad Prism como valores X e y, respectivamente. Transponha os valores de densidade óptica em 405 nanômetros em um formato de coluna.

Na folha de dados, a primeira coluna representa as concentrações como ligante adicionado como valores X, enquanto as colunas à direita contêm os valores de sinal das oito curvas de titulação como valores Y. Como um gráfico semilogarítmico será traçado, a última linha, que conta os sinais dos controles livres de ligante, concentração zero, é excluída. O Graph Pad Prism desenha o gráfico que é visto na seção do gráfico.

Para o eixo X, uma escala semilogarítmica é selecionada. O eixo X mostra os valores de sinal medidos como valores OD em 405 nanômetros. Ao clicar duas vezes em qualquer um dos símbolos, eles podem ser selecionados e marcados por forma e cor simples.

Os valores de titulação para a forma de tipo selvagem são destacados com círculos em diferentes tonalidades de vermelho, enquanto os sinais de titulação para a forma mutante são marcados com quadrados azuis. Abra o subprogram