Implantação de enxertos vasculares Electrospun com estrutura otimizada em um modelo do rato

O objetivo geral desta intervenção cirúrgica é transplantar um enxerto vascular eletrofiado em uma aorta abdominal de rato e avaliar o desempenho a longo prazo do enxerto. Este método foi estabelecido pelo professor Deling Kong e outros colegas do nosso grupo e pode ajudar a responder a questões-chave no estudo de enxertos vasculares eletrofiados, como o efeito da estrutura e das propriedades da superfície do enxerto na regeneração vascular. A principal vantagem dessa técnica é que ela possui boa repetibilidade e alta taxa de sobrevivência animal.

Além disso, o modelo animal é fácil de manejar a baixo custo. Este trabalho será conduzido por nosso colega, Dr. Wang. Para começar, prepare a solução de polímero dissolvendo a policaprolactona em uma mistura de 1 a 5 de metanol e clorofórmio e mexendo em temperatura ambiente por 12 horas.

Carregue a solução de polímero em uma seringa de vidro de 10 mililitros e equipe-a com uma agulha cega de calibre 21. Em seguida, coloque um mandril de aço inoxidável no instrumento de coleta e certifique-se de que esteja devidamente aterrado. Ajuste a distância de trabalho da ponta da agulha ao coletor para 17 centímetros para a solução de 25% de policaprolactona.

Em seguida, defina a vazão na bomba da seringa para oito mililitros por hora. Em seguida, defina a tensão na fonte de alimentação para 11 quilovolts e inicie a rotação do mandril a 40 RPMs para coletar fibras eletrofiadas para distribuição adequada da fibra. Com tudo agora configurado, ligue a fonte de alimentação e a bomba de seringa para começar a coletar as fibras eletrofiadas.

Após 4.5 minutos, desligue a bomba da seringa, a fonte de alimentação e o motor do mandril. Deixe o enxerto secar no capô por uma hora. Em seguida, remova o enxerto do mandril usando álcool absoluto e coloque-o no vácuo durante a noite para remover o solvente residual.

Esterilize o enxerto com óxido de etileno e deixe-o secar em uma coifa de contenção biológica estéril. Usando técnicas padrão, obtenha imagens SEM do lúmen dos enxertos e importe-as para o ImageJ. Use as ferramentas de medição para medir o diâmetro da fibra e o tamanho médio dos poros em cada imagem, para garantir a consistência entre as amostras.

Para obter informações sobre as propriedades mecânicas do material do enxerto, primeiro corte um andaime tubular em seções de três milímetros usando uma lâmina de barbear. Em seguida, use paquímetros para medir a espessura dos andaimes. Em seguida, carregue os andaimes nas garras de uma máquina de teste de tração, de modo que haja um milímetro entre as garras.

Segure os andaimes axialmente, a uma taxa de 10 milímetros por minuto, até que se rompam. Certifique-se de registrar a resistência à tração e o alongamento final na ruptura para as amostras. Antes da cirurgia, ratos Sprague Dawley machos rápidos, pesando 240 a 270 gramas, por 24 horas antes da cirurgia de implantação.

Anestesiar o rato e prepará-lo para a cirurgia, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Confirme a anestesia adequada, certificando-se de que o rato tenha músculos relaxados e respiração constante. Em seguida, coloque o rato sob o microscópio cirúrgico em decúbito dorsal.

Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão de laparotomia de linha média de quatro a cinco centímetros de comprimento e exponha a cavidade abdominal. Retraia cuidadosamente e envolva os intestinos com gaze umedecida com solução salina. Enquanto olha através do microscópio cirúrgico, retire a aorta abdominal dos tecidos adjacentes.

Identifique e ligue todos os pequenos ramos da aorta descendente, usando pontos de náilon monofilamentar 9-0. Em seguida, use grampos vasculares para prender até uma seção isolada de um centímetro da aorta. Em seguida, use uma microtesoura para transeccionar a aorta abdominal entre as pinças.

Lave as duas extremidades da aorta usando solução salina heparinizada para remover o sangue residual. Retire a adventícia da aorta pinçada com uma microtesoura. Em seguida, coloque uma seção de um centímetro de comprimento do enxerto esterilizado na lacuna criada pela seção removida da aorta.

Usando suturas de náilon monofilamentar 9-0, construa quatro anastomoses usando um padrão de sutura em forma de oito nas posições das nove horas, três horas, 12 horas e seis horas do lado proximal. Em seguida, construa as outras quatro anastomoses entre cada uma das suturas no lado proximal. Coloque o enxerto verticalmente para mostrar o intervalo igual entre os oito pontos sob o microscópio cirúrgico.

Após terminar a sutura proximal, repita o processo no lado distal. Uma vez que o enxerto tenha sido colocado, remova a pinça distal para permitir que o sangue flua para dentro do enxerto e, em seguida, remova a pinça proximal. Usando uma bola de algodão estéril, aplique pressão para interromper qualquer sangramento observado nos pontos de sutura.

Pressione por cerca de três minutos, até que ocorra a hemostasia. Em seguida, retorne os intestinos para a cavidade abdominal e lave a cavidade abdominal usando solução salina fisiológica quente contendo gentamicina. Em seguida, costure a parede abdominal usando sutura de náilon 3-0 nas camadas muscular e cutânea.

Use iodo na incisão após a cirurgia apenas uma vez. Devolva o rato à companhia de outras pessoas assim que estiver totalmente recuperado. A concentração de policaprolactona na solução de eletrofiação pode afetar tanto o diâmetro da fibra quanto as propriedades mecânicas dos enxertos.

A maior concentração de solução a 25% produz enxertos vasculares com fibras mais espessas e poros maiores do que a solução a 10%. Após três meses in vivo, a coloração histológica revelou uma camada de tecido novo formada no lúmen do enxerto e uma quantidade significativa de deposição de colágeno dentro do próprio enxerto. Esta nova camada de tecido é revestida por células endoteliais, abaixo das quais pode ser encontrada uma camada de células musculares lisas e elastina circunferencialmente alinhada.

Após 12 meses in vivo, o novo tecido parecia bem integrado e as camadas endotelial e de músculo liso permaneceram intactas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma a duas horas, se for executada adequadamente. Após este procedimento, outras medidas, como ultrassom com Doppler colorido, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como fabricar os enxertos vasculares eletrofiados e avaliar seu desempenho in vivo em um modelo de substituição da artéria abdominal de rato.