Uma plataforma Microfluidic para Imaging Longitudinal em Caenorhabditis elegans

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens longitudinais de processos dinâmicos em nematóides adultos sob condições ambientais controladas para o rastreamento das respostas comportamentais do verme e da cinética da expressão gênica do verme. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como os animais se adaptam às mudanças em seu ambiente, incluindo diferenças nos comportamentos centrais, expressão gênica, memória e aprendizado. Esta técnica permite a observação longitudinal multiplex de animais individuais em ambientes controlados dinamicamente, bem como a amostragem simultânea de múltiplos aspectos da adaptação em alta resolução.

A implicação dessa técnica se estende a uma compreensão quantitativa da adaptação animal, pois a aquisição de dados cinéticos de alta precisão pode facilitar a modelagem matemática e a formulação e teste de hipóteses complexas. Para configurar o dispositivo para o procedimento, primeiro conecte a ponta da seringa de saída a um pedaço de tubo de seringa de 50 centímetros. Para fazer uma agulha adaptadora, use um alicate para puxar a haste da agulha do cubo da agulha de uma agulha de calibre 20 por meia polegada e use um bico de Bunsen para remover o resíduo de plástico restante.

Segurando ambas as extremidades da agulha com um alicate, dobre a agulha do adaptador de acordo com a geometria da configuração experimental e conecte a agulha até a metade na outra extremidade do tubo da seringa de saída. Em seguida, conecte uma ponta de seringa de entrada de tampão diretamente a uma válvula de três vias e conecte uma seringa de entrada de tampão a um pedaço de tubo de seringa de um metro. Inserindo a agulha do adaptador até a metade na extremidade aberta do tubo, conecte a seringa de troca de tampão a um pedaço de 50 centímetros do tubo da seringa através da ponta da seringa.

Conecte o tubo da seringa à porta restante da válvula de três vias e feche a válvula. Usando uma agulha adaptadora, conecte a seringa de entrada de verme a um pedaço de tubo de seringa de um metro, conforme demonstrado. Em seguida, enxágue todos os materiais duas vezes com meio S e encha as seringas e tubos enxaguados com meio S novo, tomando cuidado para remover quaisquer bolhas de ar.

Agora, conecte o tubo da seringa de saída à saída do dispositivo e conecte a agulha do adaptador na extremidade do tubo da seringa de saída à porta de saída. Injete um pequeno volume de meio S através da saída para encher o dispositivo até que o meio S saia das entradas de buffer e worm. Conecte o tubo da seringa de entrada do buffer à porta de entrada do buffer do dispositivo e conecte a entrada do sem-fim com um pino-guia de aço inoxidável com um diâmetro de trinta segundos de polegada.

Monte o dispositivo microfluídico em um microscópio de fluorescência invertida com um estágio motorizado e prenda uma bomba de seringa em um agitador próximo ao microscópio para que a bomba não balance durante a agitação. Em seguida, carregue a seringa de entrada do tampão na bomba da seringa e configure a bomba para fornecer um fluxo contínuo de meio S no dispositivo a uma taxa de fluxo de três microlitros por minuto. Para carregar as bactérias no dispositivo microfluídico, primeiro carregue uma nova seringa com uma suspensão de alta densidade de E.coli OP50.

Gire a seringa verticalmente e bata no cilindro várias vezes para coletar todas as bolhas de ar na parte superior da seringa. Desligue o agitador orbital e feche a válvula de três vias das seringas de entrada do tampão. Substitua a seringa de entrada do tampão pela seringa carregada com bactérias e empurre todo o ar coletado na parte superior da seringa até que um pouco da suspensão bacteriana entre no sistema de troca de tampão e não haja bolhas na seringa carregada com OP50 ou na válvula.

Com a válvula fechada, conecte a seringa carregada de bactérias à bomba da seringa e ligue o agitador orbital. Defina a velocidade de agitação para aproximadamente 200 RPM e a vazão para 100 microlitros por minuto. Depois que o buffer OP50 se espalhar por todo o dispositivo, defina a taxa de fluxo de volta para três microlitros por minuto.

Para carregar o dispositivo com nematóides, primeiro encha um tubo de microcentrífuga de baixa ligação de 650 microlitros com 100 microlitros de suspensão OP50 fresca e use um picareta de minhoca para transferir individualmente 20 a 30 vermes adultos jovens sincronizados com a idade de uma placa de ágar de meio de crescimento de nematóide para o tubo. Encha a seringa de entrada de minhoca e o tubo da seringa com suspensão OP50 nova e injete aproximadamente 500 microlitros de suspensão no tubo da microcentrífuga. Em seguida, puxe a suspensão sem-fim para o tubo da seringa de entrada do sem-fim e conecte a seringa de entrada do sem-fim à entrada do sem-fim.

Injete todos os vermes através do tubo da seringa de entrada do verme no dispositivo microfluídico e desconecte a seringa de entrada do verme e o tubo da seringa. Conecte a entrada sem-fim com um pino e desengate a seringa de entrada do tampão da bomba mecânica. Use a seringa de entrada do tampão para mover manualmente os vermes para os canais e a seringa de saída para reverter o movimento do sem-fim conforme necessário.

Carregar os animais requer alguma coordenação. Use empurrões suaves nos êmbolos da seringa para alinhar junto com o canal e um empurrão um pouco mais forte para conduzir o verme até o fim. Em seguida, deixe os vermes se ajustarem ao novo ambiente por duas a três horas antes de iniciar um experimento.

Os vermes estão confinados aos seus canais, mas não são imobilizados. A maioria dos vermes permanecerá em seus canais durante o experimento, mas alguns podem escapar ou ficar presos nas microfissuras. Aqui, imagens de campo brilhante de um único verme representativo ao longo de dez horas no dispositivo podem ser observadas.

Usando vermes transgênicos que expressam GFP sob o promotor do gene da resposta imune um, após a infecção por P.Aeruginosa, PA14, a expressão de GFP é observada no meio do corpo e na cauda do verme nas primeiras cinco horas de exposição ao patógeno, aumentando para uma expressão robusta de corpo inteiro nas próximas cinco horas. Traçar a fluorescência total de cada verme em função do tempo pós-infecção ilustra a dinâmica da indução do gene da resposta imune, bem como a variabilidade de verme para verme no tempo e na extensão da indução. A imagem de lapso de tempo dos ovos postos pelos vermes em cada canal permite traçar o número cumulativo de ovos postos por cada verme em função do tempo pós-infecção e captura a variabilidade de animal para animal, bem como o declínio induzido pelo patógeno na postura de ovos à medida que a infecção progride.

Uma vez dominado, o dispositivo microfluídico pode ser preparado e carregado em uma hora. Uma vez que o dispositivo é carregado e os vermes são aclimatados, outros reagentes, como drogas específicas ou pistas químicas de interesse, podem ser entregues aos vermes para responder a perguntas adicionais sobre o controle dos sistemas neuronais e genéticos dos nematóides. Após seu desenvolvimento, nós e nossos colaboradores usamos essa técnica para dissecar os comportamentos alimentares dos nematóides, bem como as respostas genéticas dos vermes à infecção por choque térmico e à fome em uma variedade de ambientes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar um dispositivo microfluídico para realizar ensaios longitudinais.