Name: Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda a usar optogenética e eletrofisiologia para controlar oscilações theta hipocampais em camundongos. Este método permite investigar o papel causal desses ritmos na navegação espacial e comportamentos associados.

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Gostaríamos de agradecer a Maria Gorbati para ajuda especializada com análise de dados e Jennifer Kupferman para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; NeuroCure exc 257, TK e AP; Programa prioritário 1665, 1799/1-1(2), programa de Heisenberg, 1799/2-1, AP), a Fundação alemã-israelense de pesquisa científica e desenvolvimento (GIF; Eu-1326-421.13/2015, TK) e o programa de ciência de fronteira humana (HFSP; RGY0076/2012, TK).

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui apresentamos uma metodologia amplamente acessível para arrastar e provocar oscilações theta hippocampal no comportamento animal. Essa abordagem pode ser útil para estudos de funções do ritmo theta no processamento de informações e comportamento. Aspectos críticos deste método incluem: (1) a escolha do opsin e direcionamento de ChR2 de axônios de MS em células do hipocampo, (2) robustas características ópticas e elétricas dos assemblies de matriz fios fibra óptica implantados para garantir estimulação contínua e LFP ...

Atividade neuronal em mamíferos é coordenada por oscilações de rede, que ajudam a transferência de informações dentro e entre regiões cerebrais1,2,3,de4. Ritmos do cérebro incluem oscilações variando de muito lento (< 0,8 Hz) até ultra rápidas frequências (> 200 Hz). Um corpo grande da evidência suporta envolvimento das oscilações de rede em funções cerebrais diversas, incluindo cognição5,6,7,8,9,10 , comportamentos inata11,12 , bem como distúrbios neuropsiquiátricos, tais como a doença de Parkinson e epilepsia de14,13,15. Seletivos e temporalmente precisos métodos para manipulação experimental de oscilações de rede são, portanto, essenciais para o desenvolvimento de modelos fisiologicamente plausíveis de sincronização e para estabelecer nexos de causalidade com o comportamento.
Sincronização de rede é mediada por diversos substratos biológicos e processos, variando de identidade molecular de canais iônicos e sua cinética de neuromodulação da excitabilidade e conectividade de rede. O projeto biológico do ritmo geradores16 foi revelado para muitos ritmos cerebrais, aspectos distintos do qual (por exemplo, frequência, amplitude) são muitas vezes provocada pela dinâmica de redes e tipos de células distintas. Por exemplo, interneurônios inibitórios visando o somata das células principais são os jogadores mais importantes em bandas de frequência e cérebro regiões17,18, incluindo theta19,20, gama20 , 21e ondulação (140-200 Hz)22 oscilações. Por sua vez, sincronização de fase de células distantes é assegurada pelo robusto feed-forward sinalização de células piramidais, que redefine o disparo dos interneurônios. Um parâmetro crucial das oscilações, o tamanho da população neuronal sincronizada, está intimamente relacionado com a amplitude da oscilação LFP medidos e, pelo menos para oscilações rápidas, depende a unidade excitatória sobre interneurônios2. Em contraste, oscilações mais lentas, como delta e theta ritmos, são geradas pelos laços reentrantes de longo alcance, formados por córtico-talâmica23,24 e hippocampal-medial septal projeções25, 26,27, respectivamente. Oscilações em tais circuitos são trazidas pelas interações de atrasos de propagação do sinal, respostas excitáveis e sua preferência de frequência em participantes células28,29,30, 31 , 32. projeções inibitórias gabaérgica parvalbumin (PV)-positivo são células do septo medial (MS) para interneurônios no hipocampo25,33, regiões hipocampal e de córtex entorhinal26 essencial para a geração de oscilações de theta no lóbulo temporal. Assim, os mecanismos fisiológicos de oscilações de rede e sincronização neuronal podem ser manipulados usando optogenetics com uma precisão em tempo real.
Célula tipo específico optogenetic manipulações foram aplicadas para estudos das oscilações hippocampal e cortical em vitro34,35,36,37,38 e vivo em30,39,40,41,42,,43,44,45, incluindo funcional investigações de gama5,12,36,46,47,,48,,49,50, 51,52 e ondulação oscilações40,53,54 e sono fusos55,56. Recentemente nós expressa um vírus ChR2 Cre-dependente no MS, uma região chave para a geração do ritmo theta hippocampal, dos ratos PV-Cre. Usando esta preparação, características das oscilações theta hippocampal (frequência e estabilidade temporal) eram controladas por estimulação optogenetic de projeções inibidoras do MS no hipocampo11. Além disso, a estimulação de optogenetic frequência theta de projeções de displasia septo-hippocampal inibitórias evocado ritmo theta durante imobilidade acordada. O optogenetically arrastado Propriedades do ritmo theta exibido das oscilações de theta espontânea no rato na LFP e níveis de atividade neuronal.
As principais características deste protocolo incluem: (1) utilização de uma via inibitória que é fisiologicamente essencial para oscilações de theta espontânea, evitando efeitos inespecíficos na excitabilidade hippocampal; (2) axonal, ou seja, estimulação de projeção específicas para minimizar uma influência directa na não-hippocampal MS eferentes; (3) local theta-rítmica estimulação de luz, garantindo uma mínima interferência direta com dinâmica de displasia septo-hippocampal theta-rítmica e um arrastamento bilateral global das oscilações de theta; (4) paramétrico controle de frequência de oscilações de theta e regularidade; e (5) quantificação de fidelidade de arrastamento com alta resolução temporal usando LFP para permitir a análise quantitativa de causalidade em comportamento de animais. Uma vez que esta preparação essencialmente capitaliza sobre um papel bem conhecido da displasia septo-hippocampal desinibição em theta geração25,30, permite controle robusto sobre vários parâmetros de oscilações de theta no comportamento de ratos. Estudos onde outros menos caminhos investigados e tipos de células, os circuitos de displasia septo-hippocampal foram manipularam38,39,,47,,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 mais revelar mecanismos do ritmo theta.

<table><tbody><tr><td>Camundongos PV-Cre</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxis</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA</td><td>Modelo 963</td><td>Instrumento Estereotáxico Ultra Preciso para Pequenos Animais</td></tr><tr><td>Brocas, 0,8 mm</td><td>Bijoutil, Allschwil, Suíça</td><td>49080HM</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 0,01-1 ml</td><td>Braun, Melsungen, Alemanha</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Cânulas de esterilização</td><td>Braun</td><td>26 G, 0,45x25 mm BL/LB</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras finas e afiadas</td><td>Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canadá</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11210-10</td><td>Dumont AA - Pinça revestida com epóxi</td></tr><tr><td>Tesoura de aço inoxidável sem corte</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14018-14</td><td></td></tr><tr><td>Estação de solda</td><td>Weller Tools GmbH, Besigheim, Alemanha</td><td>WSD 81</td><td></td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Rotexmedica GmbH, Trittau, Alemanha</td><td>PZN: 10823932</td><td>1g Pó para solução para infusão</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Optogenetics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamilton pump</td><td>PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>modelo 703008</td><td>PHD Ultra Syringe Pump com mecanismo push/pull</td></tr><tr><td>Hamilton 5 &micro; L Seringa, 26 gauge</td><td>PHD Ultra, Modelo de Aparelho Harvard</td><td>75 RN SYR</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 5 &micro; L Êmbolo</td><td>PHD Ultra, Aparelho Harvard</td><td>Modelo 75 RN SYR</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, EUA</td><td>PE 20</td><td>Diâmetro interno 0,38 mm (0,015"), Diâmetro externo 1,09 mm (0,043")</td></tr><tr><td>Cânulas de esterilização</td><td>Braun, Melsungen, Alemanha</td><td>27 G, 25x0,40 mm, rombo</td><td></td></tr><tr><td>Furadeira/esmerilhadeira de precisão</td><td>Proxxon, Wecker, Luxemburgo</td><td>fbs 240/e</td><td></td></tr><tr><td>Corte discos</td><td>Proxxon</td><td>NO 28812</td><td></td></tr><tr><td>Cre dependente channelrhodopsin</td><td>Penn Vector Core, Filadélfia, PA, EUA</td><td>AV-1-18917P</td><td>Nome da construção: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, título: 1.42x1013 vg/ml</td></tr><tr><td>Cam quinase dependente de halorodopsina</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-26971P</td><td>Nome da construção: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, título: 2.08_1012 vg/ml</td></tr><tr><td>Fibra óptica multimodo</td><td>ThorLabs, Dachau, Alemanha</td><td>FG105LCA</td><td>0,22 NA, Low-OH, &Oslash; 105 &micro; Núcleo de m, 400 - 2400 nm</td></tr><tr><td>Virola de vara de</td> cerâmica <td>Produtos de fibra de precisão, Milpitas, CA, EUA</td><td>CFLC126</td><td>Virola de cerâmica LC MM, papel de polimento de ID 126um</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>LF3D</td><td>6 "x 6" Diamond Lapping (polimento)</td></tr><tr><td>Medidor de potência Medidor de energia</td><td>compacto Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Compact Power and Energy Meter, Digital 4 "</td></tr><tr><td>LCD Multimodo acoplador de fibra óptica</td><td>Thorlabs</td><td>FCMM50-50A-FC</td><td>1x2 MM Acoplador, Relação de Divisão 50:50, 50 &micro; m GI Fibers,</td></tr><tr><td>cabo de remendo de fibra óptica</td> FC/PC <td>Thorlabs</td><td>FG105LCA CUSTOM-MUC</td><td>feito sob medida, 3 m de comprimento, com tubulação de proteção, Tubulação: FT030, Conector 1: FC/PC, Conector 2: 1,25 mm (LC) Luva de virola de cerâmica</td></tr> Produtos <tr><td></td><td>de fibra de precisão, Milpitas, CA, EUA</td><td>ADAL1</td><td>Luva de acoplamento de cerâmica dividida para &Oslash; Virolas de 1,25 mm (LC/PC) Laser</td></tr><tr><td>DPSS de 473 nm</td><td>Laserglow Technologies, Toronto, ON, Canadá</td><td>R471005FX</td><td>Série LRS-0473 Laser</td></tr><tr><td>DPSS de 593 nm</td><td>Laserglow Technologies</td><td>R591005FX</td><td>LRS-0594 Series</td></tr><tr><td>MC_Stimulus II</td><td>Multichannel Systems, Reutlingen, Alemanha</td><td>STG 4004</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de condicionamento de impedância</td><td>Neural microTargeting em todo o mundo, Bowdoin, EUA</td><td>ICM</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários<</td></tr><tr><td>u>Electrophysiology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fios de tungstênio</td><td>California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, EUA</td><td>CFW0010954</td><td>40 &micro; m, 99.95%</td></tr><tr><td>Tubulação capilar</td><td>Optronics</td><td>1068150020</td><td>ID: 100.4 &micro; m</td></tr><tr><td>Omnetics nanoconnector</td><td>Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, EUA</td><td>A79038-001</td><td></td></tr><tr><td>Parafusos</td><td>Bilaney, D&uuml; sseldorf, Alemanha</td><td>00-96x1/16</td><td></td></tr><tr><td>sonda de silicone</td> em aço inoxidável <td>NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, EUA</td><td>B32</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Neuralynx, Bozeman, Montana EUA</td><td>HS-8</td><td>miniatura headstage unidade pré-amplificadores de ganho</td></tr><tr><td>Pintura condutora de prata</td><td>Conrad electronics, Alemanha</td><td>530042</td><td></td></tr><tr><td>Fluxo líquido</td><td>Felder GMBH L&ouml; ttechnik, Oberhausen, Alemanha</td><td>L&ouml; t&ouml; l ST</td><td>DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)</td></tr><tr><td>LED</td><td>Neuralynx</td><td>HS-LED-Red-omni-10V</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks, Natick, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC_Stimulus software</td><td>Multichannel, Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurophysiological Data Manager</td><td></td><td></td><td>NDManager, http://neurosuite.sourceforge.net</td></tr><tr><td>Klusters</td><td></td><td></td><td>http://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006</td></tr><tr><td>Software do sistema de gravação</td><td>Neuralynx</td><td>Cheetah</td><td>https://neuralynx.com/software/cheetah</td></tr><tr><td>Software de análise de dados multicanal</td><td>Cambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GB</td><td>Spike2</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetic de arrastamento de theta hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Dados abrangentes sobre relacionamentos de oscilações de rede neural para comportamento e organização de descarga neuronal em todas as regiões do cérebro chamam para novas ferramentas para manipular seletivamente ritmos cerebrais. Aqui nós descrevemos uma abordagem combina optogenetics de projeção específico com eletrofisiologia extracelular para controle de alta-fidelidade de oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A especificidade do arrastamento a optogenetic é conseguida pela segmentação channelrhodopsin-2 (ChR2) à população gabaérgica das células do septo medial, crucialmente envolvidas na geração das oscilações de theta hippocampal, e um local sincronizado ativação de um subconjunto de afferents septal inibitório no hipocampo. A eficácia do controle do ritmo de optogenetic é verificada por um monitoramento simultâneo do campo local potencial (LFP) entre lâmina da área CA1 e/ou de descarga neuronal. Usando esta preparação facilmente implementável mostramos a eficácia de diferentes protocolos de estimulação optogenetic para indução de oscilações de theta e para a manipulação de sua frequência e regularidade. Finalmente, uma combinação do ritmo theta controle com inibição de projeção específico aborda a leitura de aspectos particulares da sincronização hippocampal por regiões eferentes.

Direcionamento de ChR2 para células gabaérgica no MS conforme descrito na seção 1 é ilustrado na Figura 2A. Optogenetic estimulação de axônios das células de MS gabaérgica no hipocampo dorsal através de uma fibra óptica que é implantado acima da área CA1 entrains oscilações theta na frequência do estímulo em ipsilateral (Figura 2B) bem como contralateral Hemisfério (Figura 2). Oscilações de Theta pod...

Nós descrevemos o uso de optogenetics e eletrofisiológicas gravações para manipulações seletivas das oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A eficácia do arrastamento ritmo é monitorada utilizando o potencial do campo local. Uma combinação de opto - e inibição farmacogenética aborda a leitura eferente de sincronização hippocampal.

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurofisiologia, como o papel causal da oscilação na navegação especial e comportamentos associados. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite um controle em tempo real sobre a frequência e regularidade das oscilações do hipocampo em camundongos que se comportam. Demonstrando o procedimento estará a Dra. Franziska Bender, uma ex-aluna de pós-graduação em meu laboratório.Comece com o mouse totalmente anestesiado preso na estrutura estereotáxica. Faça um furo acima do septo medial. Mergulhe a ponta da agulha de injeção em uma gota de vírus em um pedaço de filme de parafina e retire cuidadosamente o vírus a cerca de 500 nanolitros por minuto, observando o nível do fluido.Para evitar que o ar entre na agulha de injeção, interrompa a retirada antes que o vírus seja totalmente absorvido. Limpe a agulha com um lenço de papel. Verifique se o vírus e o óleo estão separados por uma bolha de ar e marque o nível do vírus no tubo.Posicione a agulha acima da craniotomia e insira-a lentamente no cérebro no primeiro ponto de injeção. Injete 450 nanolitros do vírus a uma taxa de 100 a 150 nanolitros por minuto. Após a injeç

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Kodani, S., et.al. Manipulação optogenética de circuitos neurais durante o monitoramento de estados de sono/vigília em camundongos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a manipulação optogenética de circuitos neurais envolvidos na transição do sono para a vigília em camundongos. O procedimento envolve a implantação cirúrgica de uma fibra óptica e eletrodos no cérebro e nos músculos para permitir a estimulação da luz e o registro eletrofisiológico. Ao fornecer luz para ativar canais...

Manipulação optogenética de circuitos neurais para a transição do sono para a vigília em camundongos

Este vídeo demonstra um protocolo para modular as oscilações em um modelo de camundongo geneticamente modificado com canais iônicos sensíveis à luz em seus neurônios do septo medial GABAérgico. Ao fornecer pulsos de luz ao hipocampo, o protocolo visa sincronizar a atividade neuronal e gerar oscilações, que são registradas como potenciais de campo locais.

Manipulação seletiva de oscilações em um modelo de camundongo

Este vídeo demonstra a implantação estereotáxica de um feixe de eletrodos de fio e uma fibra óptica no hipocampo de um modelo de camundongo.

Implantando um feixe de eletrodos e fibra óptica no hipocampo do camundongo

Este vídeo demonstra a gravação da atividade da rede neuronal rítmica, também conhecida como oscilações, em um hipocampo isolado. Os eletrodos são inseridos em várias camadas e posições espaciais para detectar e analisar as oscilações. Isso mostra as composições neuronais únicas e a conectividade da rede neuronal em diferentes camadas do hipocampo.

Registro in vitro de oscilações no hipocampo de camundongos

Este vídeo demonstra o método para usar a optogenética para modular a dinâmica da rede hipocampal, ativando interneurônios sensíveis à luz geneticamente modificados em uma fatia de cérebro de camundongo, aprimorando a sincronização da oscilação e estudando o comportamento do circuito neural.

Controle optogenético da dinâmica da rede hipocampal

Oscilações são propriedades fundamentais da rede e são modulados pela doença e drogas. Estudar oscilações cérebro-slice permite a caracterização das redes isoladas em condições controladas. Protocolos são fornecidos para a preparação de fatias cerebrais agudos para evocar CA1 oscilações γ.

Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação

A atividade no hipocampo está relacionada a estágios cognitivos e comportamentais específicos. Aqui, descrevemos um método analítico para detectar oscilações altamente organizadas dentro do hipocampo usando uma abordagem baseada em frequência de tempo (ou seja, análise wavelet).

Detecção automática de altamente organizada Oscilações Theta no Murino EEG

Aqui, apresentamos um protocolo para a gravação da teta de rede neuronal rítmica e das oscilações gama de uma preparação isolada do hipocampo inteiro. Descrevemos os passos experimentais da extração do hipocampo para detalhes de gravações de grampos de campo, unidade e toda célula, bem como a estimulação optogenética do ritmo de theta.

Tuning na banda Theta do hipocampo<em&gt; In Vitro</em&gt;: Metodologias para gravação a partir do Circuito de Septohippocampal de Roedores Isolado

Este protocolo descreve a gravação dos potenciais de campo local com haste multi sondas de silicone linear. Conversão de sinais usando análise de densidade atual fonte permite a reconstrução do local atividade elétrica no hipocampo do mouse. Com esta técnica, oscilações espacialmente restrita do cérebro podem ser estudadas em ratos movimentando-se livremente.

Gravação espacialmente restrita oscilações no hipocampo de ratos de comportar-se

Aqui, nós descrevemos métodos da manipulação optogenética de tipos particulares de neurônios durante a monitoração de Estados do sono/wakefulness nos ratos, apresentando nosso trabalho recente no núcleo da cama do terminalis do stria como um exemplo.

Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos

Este artigo demonstra a preparação de uma janela de imagem personalizada complementada com cânula de infusão e sua implantação na região ca1 do hipocampo em camundongos.

Procedimento de craniotomia para visualizar atividades neuronais no hipocampo de ratos comportadores

Aprenda a usar optogenética e eletrofisiologia para controlar oscilações theta hipocampais em camundongos. Este método permite investigar o papel causal desses ritmos na navegação espacial e comportamentos associados.

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

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