Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Nós descrevemos o uso de optogenetics e eletrofisiológicas gravações para manipulações seletivas das oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A eficácia do arrastamento ritmo é monitorada utilizando o potencial do campo local. Uma combinação de opto - e inibição farmacogenética aborda a leitura eferente de sincronização hippocampal.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurofisiologia, como o papel causal da oscilação na navegação especial e comportamentos associados. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite um controle em tempo real sobre a frequência e regularidade das oscilações do hipocampo em camundongos que se comportam. Demonstrando o procedimento estará a Dra. Franziska Bender, uma ex-aluna de pós-graduação em meu laboratório.

Comece com o mouse totalmente anestesiado preso na estrutura estereotáxica. Faça um furo acima do septo medial. Mergulhe a ponta da agulha de injeção em uma gota de vírus em um pedaço de filme de parafina e retire cuidadosamente o vírus a cerca de 500 nanolitros por minuto, observando o nível do fluido.

Para evitar que o ar entre na agulha de injeção, interrompa a retirada antes que o vírus seja totalmente absorvido. Limpe a agulha com um lenço de papel. Verifique se o vírus e o óleo estão separados por uma bolha de ar e marque o nível do vírus no tubo.

Posicione a agulha acima da craniotomia e insira-a lentamente no cérebro no primeiro ponto de injeção. Injete 450 nanolitros do vírus a uma taxa de 100 a 150 nanolitros por minuto. Após a injeção, aguarde 10 minutos.

Após 10 minutos, mova cuidadosamente a agulha 0,1 milímetros para cima e aguarde mais cinco minutos. Use um micro stripper para retirar 125 micrômetros de revestimento de uma fibra óptica multimodo enquanto a fibra ainda está presa ao carretel de fibra. Em seguida, use uma faca de diamante para cortar a fibra em um comprimento de aproximadamente dois a três centímetros.

Insira a fibra óptica em uma ponteira de cerâmica de zircônia com um diâmetro interno de 126 mícrons. Aproximadamente 0,5 a um milímetro da fibra deve se projetar do lado convexo da ponteira. Usando uma agulha, aplique uma gota de cola epóxi em ambas as extremidades da ponteira, mas não nas laterais da ponteira.

Após a secagem, use filme de polimento de fibra de diamante com grãos de três mícrons para polir o lado convexo da ponteira. Para preparar a matriz de fios de tungstênio, primeiro cole várias guias de tubo de sílica de 100 mícrons no lado adesivo de um pedaço de fita. Em seguida, use uma pinça para enfiar fios de tungstênio de 45 mícrons isolados com formvar através dos tubos guia.

Em seguida, use um bisturi para remover o isolamento de ambas as extremidades de seis fios de ligação de cobre fino isolados com esmalte de aproximadamente cinco milímetros de comprimento. Em seguida, retire o isolamento de ambas as extremidades de um fio de aterramento de aproximadamente dois a três centímetros de comprimento. Solde cada fio descascado aos pinos do nanoconector.

Conecte cada fio de ligação a um fio de tungstênio usando uma gota de tinta condutora de prata. Após a secagem, aplique uma pequena quantidade de cimento para cobrir os fios de cobre. Evite aplicar cimento na parte superior do nanoconector.

Depois de deixar o cimento secar por pelo menos 30 minutos, use uma tesoura de aço inoxidável romba para cortar os fios de tungstênio em um ângulo de cinco a 20 graus. Comece fazendo quatro furos de 0,8 mm de diâmetro no crânio limpo do animal anestesiado. Faça dois furos rostral à sutura coronal e dois acima do cerebelo.

Em seguida, coloque parafusos ósseos de aço inoxidável para aterramento e estabilização do implante. Posicione o parafuso de aterramento conectado a um fio de cobre acima do cerebelo. Cubra o parafuso de aterramento completamente com cimento para evitar artefatos musculares durante os registros eletrofisiológicos.

Construa um anel de cimento conectando todos os parafusos. Realize uma craniotomia acima do local de implantação e, em seguida, aplique aproximadamente um microlitro de solução salina estéril na superfície do tecido cerebral. Use o stereotax para abaixar lentamente o feixe de fios na craniotomia.

Em seguida, aplique aproximadamente cinco microlitros de cera líquida quente acima do local de implantação para proteger o tecido cerebral. Aplique cimento ao redor da matriz de arame e cubra o crânio com cimento. Aplique uma gota de fluxo no fio terra pré-soldado ou no fio pré-soldado conectado ao parafuso de aterramento e funda os fios usando uma máquina de solda.

Por fim, cubra todo o fio terra com cimento. Verifique a saída de luz do cabo de conexão. Se a taxa de transmissão da fibra implantada for de 50%, certifique-se de que a saída de luz na ponta do patch cord seja de 20 miliwatts.

Conecte o pré-amplificador do estágio principal ao conector implantado e conecte o patch cord de fibra óptica à fibra do hipocampo implantada para estimulação optogenética. Registre o comportamento da linha de base por uma duração apropriada para os parâmetros que estão sendo medidos. Abra o software para controlar o gerador de estímulos.

Clique em arquivo, abra e selecione o arquivo de protocolo de sua escolha. Clique em download e comece a iniciar a estimulação da luz. Observe o controle do ritmo pelos pulsos de luz.

O potencial de campo local do hipocampo durante oscilações espontâneas é visto aqui. Observe os envelopes gama, um indicador do ritmo fisiológico. O potencial de campo local do hipocampo a sete hertz durante o arrastamento optogenético é visto aqui.

As listras azuis indicam as janelas de tempo da aplicação da luz. Observe a reinicialização de fase pelo pulso de luz indicado aqui por uma seta. O potencial de campo local do hipocampo a 10 hertz reflete o arrastamento optogenético.

Observe que os envelopes gama bloqueados por fase e a reversão de fase entre stratham orians e stratum radiatum também são mantidos durante o arrastamento. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas de tempo de experimento, mais seis semanas para expressão viral. Ao tentar este procedimento, é essencial lembrar de garantir uma transdução viral eficiente.

Conecte corretamente o implante de fibra óptica ao patch cord e obtenha boa qualidade de oscilações de potencial de campo local espontâneo.