Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

O objetivo geral deste protocolo é fazer alterações genômicas direcionadas em uma variedade de células e organismos usando complexos de ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9. Este método pode ajudar a resolver questões biológicas fundamentais, dando aos pesquisadores o poder de gerar inserções, deleções e substituições personalizadas em genomas não modificados de organismos modelo e não modelo. A principal vantagem de usar complexos de ribonucleoproteína ou RNP em vez de DNA de plasmídeo é que a eficiência é maior e os eventos fora do alvo são reduzidos.

As implicações dessa técnica se estendem a terapias ex vivo para combater coisas como câncer, HIV ou doenças genéticas. Isso ocorre porque a edição do genoma pode ser usada para corrigir mutações prejudiciais ou até mesmo aumentar a capacidade das células de combater doenças prejudiciais. Portanto, este método pode fornecer informações sobre células humanas primárias, C.elegans e Parhyale hawaiensis.

Pode ser aplicado para fazer alterações genéticas em centenas de outros sistemas, incluindo organismos anteriormente intratáveis. Comece este procedimento com o projeto e a preparação do RNA guia conforme descrito no protocolo de texto. Monte um complexo RNP misturando uma a duas vezes a quantidade molar de RNA guia com 200 picomoles de proteína Cas9 em um volume total de 10 microlitros.

Muito lentamente, adicione Cas9 concentrado ao RNA guia por cerca de 30 segundos, fazendo círculos rápidos com a pipeta. Elevando a concentração final de Cas9 para 20 micromolares. Em seguida, adicione 10 microlitros de RNP a cada poço de cubeta.

Depois de preparar HSPCs conforme descrito no protocolo de texto, conte as células com um hemocitômetro e transfira 150.000 a 200.000 células por cubeta para serem eletroporadas para um tubo de centrífuga. Gire o tubo a 100 vezes a gravidade por 10 minutos para pellet as células. Aspire o sobrenadante com uma pipeta ou vácuo, removendo quaisquer bolhas.

Ressuspenda suavemente as células com 20 microlitros de tampão de eletroporação por poço de cubeta. Em seguida, adicione 20 microlitros das células que contêm 150.000 a 200.000 HSPCs a cada poço de cubeta que já possui 10 microlitros do RNP e misture bem pipetando para cima e para baixo sem criar bolhas. Por fim, eletropore as cubetas após colocá-las em um Nucleofector.

Para os HSPCs, use o código de pulso ER-100. Comece com a preparação de C.elegans em almofadas de agarose, conforme descrito no protocolo de texto. Coloque uma almofada de injeção de agarose e uma lamínula em um escopo de dissecação.

Use uma picareta de minhoca para colocar uma pequena faixa de óleo halocarbono ao longo de uma borda da almofada. Em seguida, use o picador de minhoca revestido com óleo para levantar vários vermes da placa de ágar NG e colocá-los no rastro de óleo. Com um cabelo fino preso a uma pipeta, como um cílio ou bigode de gato, posicione os vermes em paralelo, empurrando-os suavemente para dentro da almofada de agarose.

Até se sentir confortável com o procedimento de microinjeção, monte apenas uma minhoca injetada de cada vez. Uma vez na posição e presa à almofada, cubra as minhocas com mais algumas gotas de óleo de halocarbono da ponta da picareta de minhoca. Coloque a lamínula com os vermes montados no microscópio de injeção.

Sob uma ampliação baixa, posicione os vermes perpendicularmente à agulha de injeção que foi preenchida com a solução RNP, conforme descrito no protocolo de texto. Mude para uma ampliação alta e reposicione a agulha adjacente ao braço da gônada, correspondendo à região próxima aos núcleos no paquiteno médio a tardio. Usando o micromanipulador, mova a agulha contra o verme, pressionando levemente a cutícula.

Em seguida, com uma mão, bata na lateral do estágio do microscópio para sacudir a agulha através da cutícula. Pressione a pá ou botão de injeção, encha lentamente o braço da gônada com a mistura de injeção e remova a agulha. Repita o passo com o outro braço da gônada.

Depois que os vermes forem injetados, remova a lamínula e a almofada de agarose e coloque-a sob um microscópio de dissecação. Usando uma pipeta capilar puxada, desloque o óleo dos vermes pipetando um tampão M9 sobre eles. Realize este tratamento para liberar os vermes do ágar.

Após 10 minutos, quando os vermes estiverem se debatendo no tampão, mova-os para uma placa de ágar NG com bactérias OP50 usando a pipeta capilar puxada. Coloque o prato a 20 graus Celsius por duas a três horas até que os vermes se recuperem e estejam se movendo. Uma vez recuperados, transfira individualmente os vermes para placas de ágar NG com OP50.

Em seguida, transfira as placas para uma incubadora de 25 graus Celsius. Colete os embriões de Parhyale unicelulares de zero a quatro horas após a fertilização, anestesiando primeiro as fêmeas grávidas com 0,02% de óleo de cravo e água do mar. Raspe suavemente os embriões de sua bolsa de ninhada ventral usando uma pipeta de vidro arredondada e puxada por chama e um par de pinças número três.

Usando nitrogênio comprimido, injete os embriões de Parhyale sob um microscópio de dissecação usando um microinjetor e um micromanipulador. Carregue 1,5 microlitros da mistura de injeção na parte de trás de um tubo capilar puxado usando uma ponta de pipeta microcarregadeira. Depois de colocar a agulha no aparelho de injeção, quebre a ponta da agulha usando uma pinça sob o escopo de dissecação.

Calibre o volume fornecido injetando no óleo Halocarbon 700 e medindo o diâmetro da bolha. Corte uma calha do agente de cura usando uma lâmina de barbear. Encha-o até a metade com água do mar esterilizada por filtro e alinhe os embriões de Parhyale no cocho para injeção.

Injete os embriões usando a configuração de microinjeção, estabilizando cada embrião com um par de pinças durante a injeção. Após a injeção, use uma pipeta de transferência de vidro para transferir os embriões para uma placa de cultura fresca de 60 milímetros cheia até a metade com água do mar esterilizada por filtro antes de dissecar e fixar os embriões em vários estágios. Faça agulhas de dissecação enfiando um pedaço dobrado de fio de tungstênio de aproximadamente 0,5 polegadas de comprimento na extremidade de uma agulha de insulina.

Use uma seringa de um mililitro como cabo da agulha de dissecção e afie a agulha em hidróxido de sódio sob uma corrente. Encha um poço de um prato de vidro de três poços até a metade com uma solução recém-feita de nove partes de tampão PEM, uma parte de 10X PBS e uma parte de 32% de PFA. Coloque de três a cinco embriões no prato e faça um pequeno orifício em cada embrião usando uma agulha afiada de tungstênio para cutucar e uma ligeiramente cega para estabilizar, permitindo que a gema escorra e o fixador entre.

Usando um par de agulhas afiadas de tungstênio, retire suavemente as duas membranas externas ao redor do embrião Parhyale. Disseque-os no fixador para tornar os embriões mais robustos, mas trabalhe rapidamente para evitar que a membrana se fixe ao embrião, o que dificulta a remoção da membrana. Deixe os embriões se fixarem por um total de 15 a 20 minutos para coloração de anticorpos ou 40 a 50 minutos para hibridização in situ.

Às vezes, os resultados de um experimento de edição são melhor avaliados por meio de um ensaio experimental. Resultados representativos de células T do tipo selvagem e células nocaute para CD25 são mostrados aqui. A citometria de fluxo mostra que as células que não foram editadas com Cas9 RNP expressam CD25.

No entanto, as células nas quais o CD25 foi nocauteado não expressam a proteína. Para perturbações em grande escala, os resultados da edição podem ter fenótipos visuais claros. Por exemplo, o tipo selvagem Parhyale hawaiensis tem abdômen normal com pernas nadadoras e âncora.

A interrupção do gene Abd-B substitui as pernas abdominais nadadoras e âncora por pernas saltadoras e andantes, que geralmente são associadas apenas ao tórax. Além de verificar os fenótipos, os experimentadores também devem analisar o genótipo para avaliar a eficiência geral da edição e detectar alterações genéticas específicas. Para clones únicos, isso pode ser alcançado por meio de sequenciamento Sanger simples.

Em populações mistas de células, recomenda-se uma análise de sequenciamento mais avançada. Por exemplo, o TIDE pode mapear todos os diferentes indels que ocorreram em células individuais dentro de um pool editado pela RNP. Ao tentar este procedimento pela primeira vez, tente usar um dos controles positivos listados na tabela um.

Usar um RNA guia testado e comprovado pode ajudá-lo a ter uma ideia da edição com a RNP antes de projetar seu próprio experimento.