Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos
21 de março de 2018
Este protocolo analisa comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de seus neurônios olfativos. Luz de comprimento de onda de 630 nm é usada para ativar individuais neurônios olfativos expressando uma rodopsina canal avermelhado. Larval movimento simultaneamente é controlado digitalmente gravado e analisados utilizando o software personalizados.
O objetivo geral desta metodologia é analisar o comportamento de navegação de larvas de drosófila em resposta à estimulação optogenética simultânea de seus neurônios olfativos. Este método permite a dissecção abrangente da função do circuito olfatório e complementa os estudos sobre como a função do circuito olfatório se traduz em resposta comportamental. A principal vantagem dessa técnica é sua especificidade e controle temporal ao usar uma luz em vez de gradientes de odor tradicionais para ativar neurônios olfativos individuais.
Para começar o experimento, construa uma arena de comportamento privado de luz. Construa uma caixa de 89 por 61 por 66 centímetros, feita de folhas de acrílico plexiglass de cor preta, com três milímetros de espessura. Coloque a caixa em uma mesa na sala de comportamento.
Em seguida, monte uma câmera CCD USB 3.0 monocromática equipada com um filtro IR Longpass de 830 nanômetros e uma lente de montagem F 1.4 C de oito milímetros no centro do teto da caixa preta. Coloque duas tiras de LED infravermelho na mesa para iluminar as larvas na arena escura. Em seguida, obtenha uma placa de alumínio quadrada de 22 centímetros por 22 centímetros para construir a plataforma de LED.
No centro da placa, use um cortador de metal para cortar um orifício grande o suficiente para caber ao redor da câmera CCD. Cubra a placa de metal com fitas de LED vermelhas. Solde os fios da tira de luz LED em série e alimente os fios da tira em um relé optoacoplador controlado por um microprocessador Raspberry Pi 2B.
Em seguida, monte a plataforma de LED ao redor da câmera CCD. Em seguida, instale e configure um sistema operacional baseado no Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux no processador Raspberry Pi antes de conectar o relé optoacoplador às tiras de LED. Conecte uma fonte de alimentação para alimentar as tiras de LED e o optoacoplador.
Certifique-se de que haja irradiância homogênea em vários pontos ao redor da câmera CCD na arena de comportamento. Garanta a irradiância absoluta na superfície da arena com a ajuda de um espectrômetro e determine que seja de aproximadamente 1,3 watts por metro quadrado em toda a superfície da arena. Mantenha as moscas com comida padrão para moscas a 25 graus Celsius, 50 a 60% de umidade relativa em um ciclo claro/escuro de 12 horas e 12 horas.
Para expressar CsChrimson em um único par de ORNs, cruze as fêmeas virgens de uma linha UAS-IVS-CsChrimson com machos de uma linha ORX-GAL4. Depois que as moscas machos e fêmeas em um cruzamento puderem acasalar e botar ovos por 48 horas, transfira os adultos para um frasco novo. Na superfície do frasco de comida contendo ovos, adicione 400 microlitros de uma mistura contendo 400 micromolares all-trans-retinal, ou ATR, dissolvido em sulfóxido de dimetila, ou DMSO, em sacarose 89 milimolar dissolvida em água destilada.
Assim que o ATR for adicionado aos frascos de alimentos contendo ovos, incube os frascos no escuro por mais 72 horas. Após a incubação, extraia as larvas de terceiro ínstar da superfície do alimento para moscas, flutuando-as usando uma solução de sacarose a 15% de alta densidade. Usando uma micropipeta P1000, separar as larvas que flutuam na superfície da solução de sacarose em um copo de vidro de 1.000 mililitros.
Lave as larvas quatro vezes trocando 800 mililitros de água fresca destilada no copo de vidro de cada vez. Após a lavagem final, deixe as larvas descansarem por 10 minutos antes de submetê-las ao ensaio de comportamento. Para o ensaio de comportamento, mantenha uma temperatura e umidade consistentes na sala de comportamento.
Prepare o meio rastejante larval despejando 150 mililitros de 1,5% de agarose derretida em uma placa de Petri quadrada de 22 centímetros por 22 centímetros. Deixe a agarose solidificar e esfriar por uma a duas horas nas placas de Petri antes de usá-las no ensaio de comportamento. Depois que a agarose solidificar, transfira não mais do que 20 das larvas de terceiro ínstar preparadas para o centro da placa de Petri e cubra a placa de Petri com a tampa.
Coloque a placa de Petri na arena de comportamento sob a câmera CCD. Ligue a fonte de luz LED infravermelha de 850 nanômetros para visualizar as larvas no vídeo. Inicie a câmera CCD para registrar o movimento larval
.Por fim, passe para o processamento e análise de dados. Quando ORN 7a expressando CsChrimson foi estimulado pela luz, houve uma diminuição significativa no comprimento da corrida em comparação com os animais controle. Por outro lado, quando ORN 42a expressando CsChrimson foi estimulado pela luz, houve um aumento significativo no comprimento da corrida em comparação com os animais de controle.
Descobrimos que, para o ORN 42a, diferentes padrões temporais de estimulação luminosa provocaram diferentes respostas comportamentais. Embora tenhamos demonstrado esse método para os neurônios receptores olfativos de primeira ordem, nosso método também permite uma variedade de aplicações futuras, como medir o impacto de neurônios a jusante, como neurônios de projeção e neurônios locais no comportamento larval. Esperamos que esta técnica abra caminho para uma dissecção abrangente da função do circuito olfativo larval.
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Visão Geral
Este protocolo analisa o comportamento de navegação da larva de Drosophila em resposta à estimulação optogenética simultânea de seus neurônios olfativos. Ele utiliza uma luz de comprimento de onda de 630 nm para ativar neurônios olfativos específicos que expressam uma rodopsina do canal deslocada para o vermelho, permitindo estudos detalhados da função do circuito olfativo e da resposta comportamental.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência Comportamental
- Optogenética
- Genética de Drosophila
Contexto
- Esta metodologia permite a exploração de como a função do circuito olfativo se correlaciona com respostas comportamentais.
- Oferece controle temporal sobre a ativação usando luz em vez de gradientes tradicionais de odor.
- A abordagem facilita o exame de neurônios específicos no sistema olfativo de Drosophila.
Objetivo do Estudo
- Dissecar com precisão a função dos circuitos olfativos.
- Observar as respostas comportamentais de larvas à estimulação neuronal direcionada.
- Fornecer insights sobre como neurônios olfativos individuais influenciam escolhas de navegação.
Métodos Utilizados
- O estudo utiliza uma arena de comportamento projetada especialmente para a análise de movimento larval.
- Larvas de Drosophila que expressam CsChrimson em neurônios receptores olfativos (ORNs) foram estimuladas com luz.
- O ensaio comportamental envolve a preparação de meio de rastejamento com agarose e a gravação em vídeo dos movimentos larvais.
- Os passos significativos incluem a construção da arena, a montagem do equipamento e o preparo das larvas em condições específicas.
Resultados Principais
- A estimulação luminosa de neurônios receptores olfativos específicos levou a variações significativas no comprimento da trajetória larval, indicando respostas comportamentais distintas.
- Diferentes padrões temporais de estimulação provocaram efeitos distintos no comportamento de navegação.
- Esse método está pronto para facilitar a exploração futura dos impactos neuronais descendentes no comportamento larval.
Conclusões
- O estudo exemplifica uma abordagem inovadora para analisar circuitos olfativos e suas implicações comportamentais.
- Permite aos pesquisadores investigar os papéis específicos de neurônios direcionados em um contexto de organismo vivo.
- Essas descobertas ampliam nossa compreensão dos mecanismos neuronais no processamento sensorial e no comportamento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a dissecção precisa da função do circuito olfativo substituindo estímulos odoríferos pelo controle optogenético, abordando um desafio fundamental na validação de alvos, onde leituras comportamentais devem ser associadas à atividade neuronal específica. Ele contribui para a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, isolando a contribuição de neurônios receptores olfativos individuais para o comportamento de navegação, melhorando a confiança preditiva na seleção de alvos. A abordagem aprimora a continuidade translacional do alvo molecular até o fenótipo em nível de circuito, sendo relevante para a redução de riscos em programas de descoberta com foco em neurociência.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao associar a ativação específica de neurônios olfativos a respostas comportamentais definidas.
- Valor Operacional: Oferece um sistema reprodutível para validação funcional de alvos neuronais utilizando estimulação baseada em luz.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica por meio da manipulação isolada de ORNs individuais para esclarecer seu papel no comportamento de navegação de larvas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de comportamento (por exemplo, alterações no comprimento da corrida) que permitem a avaliação padronizada dos efeitos de modulação neuronal.
- Valor Operacional: Estabelece uma plataforma de ensaio escalonável para triagem de moduladores genéticos ou farmacológicos da função do circuito olfativo.
- Valor Científico: Facilita a padronização de ensaios ao eliminar a volatilidade dos odoríferos e as variações na entrega por meio da estimulação optogenética.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao permitir a análise da tradução de estímulos sensoriais em comportamento em um organismo geneticamente manipulável.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho compatível com estudos pré-clínicos para avaliar os efeitos de alvos neuronais sobre o comportamento antes da validação em mamíferos.
- Valor Científico: Permite a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer como a atividade neuronal ascendente se traduz em fenótipos comportamentais descendentes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a validação do alvo por meio da fenotipagem comportamental e orientando a identificação de compostos líderes ao esclarecer os alvos neuronais responsáveis por respostas mensuráveis.
- Biologia da Descoberta: Permite o teste de hipóteses sobre a função individual de neurônios olfativos no controle do comportamento de navegação de larvas.
- Triagem: Fornece métricas comportamentais quantitativas e reprodutíveis (comprimento da corrida), adequadas para avaliação de compostos ou moduladores genéticos.
- Análise: Oferece saídas comportamentais rastreáveis e comparações estatísticas entre condições estimuladas e controle.
- Pesquisa Translacional: Conecta a atividade do circuito neuronal às respostas comportamentais, apoiando a extrapolação para modelos de ordem superior.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para interrogar sistematicamente alvos neuronais em circuitos olfativos e outros circuitos sensoriais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade na associação entre ativação neuronal e resultados comportamentais.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização por meio do controle optogenético, substituindo estímulos olfativos variáveis.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de ir/não-ir ao fornecer ligações mecanicistas mais claras entre alvos e fenótipos comportamentais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base no impacto comportamental validado em um sistema relevante para descoberta.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em genética de Drosophila, optogenética e design de ensaios comportamentais.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo arena de comportamento, iluminação de infravermelho, câmera CCD e controle de estímulo baseado em Raspberry Pi.
- Necessita padronização entre equipes para preparo de larvas, preparo do meio de agarose e protocolos de rastreamento de vídeo.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a diferentes tipos neuronais (por exemplo, neurônios de projeção, neurônios locais) ou estágios de desenvolvimento.
- Limitado pela necessidade de acessibilidade genética e alimentação com retinal no sistema modelo, o que pode restringir a escalabilidade para sistemas não-Drosophila.
