Construindo Tioéter/sulfeto de vinil-amarrados induzida por peptídeos helicoidais Via foto Thiol-ene/ino Hydrothiolation

Esses métodos simplificam a geração de peptídeos cíclicos ligados a tioéter devido ao uso da química de clique de tio-eno ou tio-eno, que possui tolerância de grupo funcional superior e bom rendimento. A principal vantagem dessa técnica é que uma corda de tioéter fornece um local de modificação sem vestígios, que expande significativamente o espaço químico de peptídeos estáveis após a modificação da síntese de peptídeos. Para iniciar o procedimento, conecte uma coluna cheia de 50 miligramas de resina Rink Amide MBHA a um coletor de vácuo de bancada e a uma linha de gás nitrogênio ou argônio por meio de uma torneira de três vias.

Adicione um a dois mililitros de diclorometano ao leito de resina e inche a resina agitando suavemente a mistura com um jato de bolhas de gás inerte por 10 minutos. Drene a resina com um bulbo de pipeta de borracha quando terminar. Em seguida, adicione um a dois mililitros de solução de desproteção Fmoc N-terminal à resina.

Agite suavemente a mistura borbulhando com gás inerte por 10 minutos e, em seguida, escorra a resina com um bulbo de pipeta de borracha. Lave a coluna com um a dois mililitros de DMF da mesma maneira, seguido de um a dois mililitros de DCM. Repita a sequência de desproteção uma vez.

Em seguida, combine 0,125 milimoles de um aminoácido protegido por Fmoc e 50,5 miligramas de HCTU com 0,5 mililitros de DMF em um recipiente de polipropileno. Agite a mistura por um minuto para dissolver os sólidos. Em seguida, adicione 43,5 microlitros de DIPEA e agite o recipiente por mais um minuto para obter uma solução de aminoácido ativado 0,25 molar.

Adicione esta solução à resina lavada e borbulhe gás inerte através da mistura por uma a duas horas. Depois disso, desproteja e lave o resíduo de aminoácido ligado. Continue acoplando aminoácidos à cadeia peptídica dessa maneira para formar o peptídeo linear.

Use a síntese de peptídeos em fase sólida para preparar a resina que suporta um peptídeo linear que inclui um resíduo de cisteína protegido por tritil separado por três unidades de um resíduo mono-S-cinco. Adicione um a dois mililitros de solução de desproteção de tritila a 50 miligramas da resina contendo peptídeos. Borbulhe o gás nitrogênio na mistura por 10 minutos.

Drene a solução de desproteção e lave a resina com porções de um a dois mililitros de DCM três vezes. Repita o procedimento de desproteção seis vezes ou até que a solução não pareça mais amarela para desproteger totalmente a cisteína. A desproteção total do grupo Trt da cisteína é muito importante para a próxima etapa de fotorreação.

Lave a resina com porções de um a dois mililitros de DMF e DCM em sequência. Em seguida, mergulhe a resina em um a dois mililitros de metanol por dois minutos para encolher a resina. Escorra o metanol e seque a resina com gás nitrogênio por cinco minutos.

Transferir a resina seca para um balão de fundo redondo de 10 mililitros através de papel de pesagem. Suspenda a resina em dois mililitros de DMF aspergido com nitrogênio. Em seguida, adicione 5,6 miligramas de MMP e 38 miligramas de MAP como fotoiniciadores.

Coloque uma barra de agitação no balão e cubra o frasco com um septo de borracha. Purgar a atmosfera do frasco com gás nitrogênio três vezes, para um tempo total de purga de cerca de cinco minutos. Fixar o balão de reacção num fotoreactor equipado com lâmpadas UVA, uma entrada de gás nitrogénio inerte e uma placa de agitação.

Comece a mexer a mistura e feche o fotorreator. Purgue o fotorreator com argônio por 10 minutos. Em seguida, defina a taxa de fluxo de argônio para um litro por minuto e irradie a mistura com luz UVA por uma hora em temperatura ambiente.

Monitore a reação com HPLC. Lave, clive e purifique o peptídeo cíclico quando terminar. Preparar 50 miligramas de resina contendo um peptídeo linear que inclua um resíduo mono-S-cinco substituído por gama.

Lave a resina com DMF e DCM em sequência. Encolha a resina com metanol e seque-a com gás nitrogênio. Em seguida, em um balão de fundo redondo de 10 mililitros, suspenda a resina em dois mililitros de DMF aspergido com nitrogênio.

Adicione à mistura 5,6 miligramas de MMP, 3,8 miligramas de MAP e 25,7 miligramas de cisteína protegida por Fmoc. Adicione uma barra de agitação ao frasco, sele-o com um septo de borracha e purgue a atmosfera do frasco com gás nitrogênio. Em seguida, irradie a mistura com luz UVA em um fotorreator inerte cheio de gás nitrogênio, mexendo em temperatura ambiente por uma a duas horas.

Monitore a reação com LC-MS. Quando a fotorreação estiver completa, lave o peptídeo ligado e execute a reação de macrolactamização. Em seguida, retome o acoplamento de aminoácidos ao peptídeo cíclico para formar a estrutura desejada.

Clive e purifique o peptídeo quando terminar. Preparar 50 miligramas de resina contendo um peptídeo linear que inclui resíduo com um alcino terminal separado por três unidades de um resíduo com um tiol terminal. Retire o peptídeo da resina e precipite-o com um mililitro de éter dietílico frio.

Centrifugar a mistura de peptídeos a 12 000 vezes g durante dois minutos. Decantar suavemente o sobrenadante e adicionar mais um mililitro de éter dietílico frio. Repita a lavagem mais duas vezes e, em seguida, seque o resíduo de peptídeo sob vácuo.

Dissolver o resíduo em 50 mililitros de DMF aspergido com azoto num balão de fundo redondo. Adicione 3,2 miligramas de DMPA à solução peptídica e borbulhe nitrogênio através da mistura de reação por 10 minutos. Uma atmosfera inerte é estritamente necessária para uma fotorreação eficaz de tio-ino em uma fase de solução.

Caso contrário, observamos oxidação do enxofre durante a irradiação UV. Em seguida, irradie a mistura com luz UVA sem mexer em um fotorreator inerte cheio de gás nitrogênio à temperatura ambiente por 30 minutos a uma hora. Isole e purifique o peptídeo cíclico quando terminar.

A ciclização em resina deste peptídeo produziu um peptídeo cíclico de cinco tethered com um teter, com um peso molecular idêntico ao peptídeo linear. O tempo de retenção por HPLC do produto cíclico foi dois minutos menor que o do peptídeo linear. Boa conversão também foi observada para a ciclização na resina de vários outros peptídeos curtos.

Os peptídeos lineares foram selecionados quanto à capacidade de sofrer grampeamento de peptídeos por meio de hidrotiol-ino fotoinduzido. O baixo rendimento de dois c foi atribuído a uma preferência conformacional por aprisionar o radical tiil no terminal N durante a contração para um macrociclo de 20 membros. Os peptídeos um a e um b geraram dois isômeros com uma reticulação de sulfeto de vinila de oito membros.

Os peptídeos dois a-A e dois a-B do produto tiveram tempos de retenção distintos e foram produzidos em diferentes proporções em diferentes tempos de irradiação. A espectroscopia de RMN de prótons indicou que dois a-A era o isômero E do sulfeto de vinila e dois a-B era o isômero Z. O isômero Z foi o principal produto na formação dos peptídeos dois d, dois e e dois f, o que foi atribuído à preferência conformacional durante a formação da reticulação de sulfeto de vinila de sete membros.

A espectroscopia de dicroísmo circular mostrou uma bobina aleatória para todas as formas de peptídeos dois a e dois b e conformação helicoidal para o peptídeo dois d. Desenvolvemos uma série de protocolos químicos para a construção de peptídeos ligados a tioéter e sulfeto de vinila usando química de clique de tio-eno e tio-ino fotoinduzida. Acreditamos que será útil para a comunidade de pesquisa.