Eletricamente condutivo Andaime modular e entregar as células-tronco
13 de abril de 2018
Este protocolo descreve a fabricação de um sistema de cultura de células para permitir a propagação de células-tronco em um andaime de polímero condutor para estimulação elétrica em vitro e subsequentes na vivo implantação da célula-tronco-semeado andaime usando um técnica minimamente invasiva.
O objetivo geral deste procedimento é criar uma plataforma para estimulação elétrica in vitro de células-tronco em um andaime de polímero condutor, com subsequente implantação in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa de AVC e biologia de células-tronco, fornecendo um meio de modular as células-tronco. A principal vantagem é que as células-tronco podem ser otimizadas in vitro e, posteriormente, implantadas.
Embora esse método possa fornecer uma visão sobre a recuperação do AVC, ele também pode ser aplicado a outros sistemas como um novo método de entrega celular. Geralmente, os usuários novos nessa técnica terão dificuldades devido à precisão necessária para a montagem da câmara celular e à técnica envolvida na craniectomia. Na preparação, autoclave as placas de metal de 2,5 por 12,5 centímetros e as válvulas de fluxo.
Em seguida, usando uma lâmina de câmara como modelo, corte dois pedaços de PDMS. Uma peça serve para delinear o perímetro da câmara. Na segunda peça, corte duas peças adjacentes de dentro da lâmina da câmara.
Ambas as peças devem ser retangulares e combinar com a corrediça da câmara. Agora, coloque os materiais em camadas. Comece com a placa de metal, depois o PDMS não cortado, depois a placa de polipirrol, orientada perpendicularmente, depois o PDMS com recortes e, finalmente, a câmara celular.
Alinhe as camadas com cuidado e prenda o aparelho. Em seguida, corte dois pedaços de um fio de metal para estender do aparelho até a parte externa da incubadora que o conterá. Comprimentos de 60 centímetros geralmente são longos o suficiente.
Em seguida, use pasta de prata para prender um fio em cada extremidade da placa de polipirrol que se projeta do lado de fora da câmara. Uma vez curada a pasta de prata, reforce e sele as conexões usando um epóxi. Agora, registre a resistência em todo o conjunto usando um multímetro.
O campo aplicado deve ser o mesmo em cada câmara. Em seguida, coloque as células no conjunto e estimule-as eletricamente conforme descrito no protocolo de texto. Antes de implantar as células, remova os fios do conjunto.
Em seguida, solte as câmaras celulares e separe o PDMS do andaime condutor. O andaime agora está pronto para implantação. Um dia antes da cirurgia, forneça ampicilina ao animal em questão em sua água potável.
No dia da cirurgia, anestesiar o rato com isoflurano e confirmar a anestesia com uma pinça no dedo do pé. Agora, aplique lágrimas artificiais nos olhos do rato para mantê-los úmidos. Depois de raspar o crânio, coloque o animal na capa e prepare-se para uma cirurgia estéril.
Use roupas de proteção, desembale as ferramentas esterilizadas e esterilize o couro cabeludo. Para a craniectomia, faça um orifício acima do córtex esquerdo até a dura-máter. Faça a abertura um pouco maior que 1 por 3 milímetros, o tamanho do implante.
Em seguida, abra a dura-máter e remova a dura-máter do cérebro usando uma agulha cirúrgica microfina. Remova o equipamento da incubadora de cultura TC e desative os equipamentos. Em seguida, implante cuidadosamente o andaime condutor do sistema in vitro no córtex do rato.
Em seguida, cubra o implante com Surgicel para prendê-lo, ou ele pode se mover durante o fechamento da pele. Agora, suture a ferida com sutura de seda 4-0. Após completar as suturas, injetar subcutaneamente nos ratos buprenorfina SR. Em seguida, coloque o rato em uma gaiola de recuperação até que ele recupere a consciência.
O procedimento pós-operatório é detalhado no protocolo de texto. As células progenitoras neurais humanas foram expostas à estimulação elétrica e, em seguida, coradas com ensaios de viabilidade celular. A cor verde é indicativa de uma célula viva.
As células foram claramente capazes de sobreviver à estimulação elétrica. Os fatores liberados das células neuroprogenitoras que são importantes na recuperação do AVC foram avaliados a partir de um micrograma de RNA total usando RTPCR quantitativo. Depois de normalizar os resultados usando o método do limiar do ciclo delta delta, eles revelam então a exposição à estimulação elétrica regulada positivamente pela expressão de BDNF e THBS1.
Depois de assistir a este procedimento, você deve ter uma boa compreensão de como criar um sistema de cultura de células para células-tronco eletricamente condutoras e subsequente implantação dessas células-tronco em um modelo de rato. Uma vez dominado, o procedimento pode ser feito em 45 minutos se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre monitorar os animais quanto ao padrão respiratório adequado e à cor da membrana, para garantir a anestesia adequada.
Não se esqueça de que trabalhar com ratos e células-tronco pode ser perigoso, e precauções, como usar EPI adequado, devem sempre ser tomadas.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a fabricação de um sistema de cultura celular para semeadura de células-tronco em uma estrutura de polímero condutor. Ele permite a estimulação elétrica in vitro e posterior implantação in vivo utilizando uma técnica minimamente invasiva.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia de Células-Tronco
- Técnicas de Estimulação Elétrica
Contexto
- O método visa otimizar células-tronco para pesquisas sobre recuperação de acidente vascular cerebral.
- Oferece uma abordagem inovadora para modular o comportamento de células-tronco.
- A precisão é crucial para a montagem bem-sucedida da câmara celular.
- Envolve uma técnica de craniectomia minimamente invasiva para implantação.
Objetivo do Estudo
- Criar uma plataforma para estimulação elétrica in vitro de células-tronco.
- Facilitar a implantação in vivo de células-tronco otimizadas.
- Explorar aplicações na pesquisa de acidente vascular cerebral e em outros sistemas.
Métodos Utilizados
- Fabricação de uma estrutura de polímero condutor.
- Placamento de células-tronco na estrutura.
- Estimulação elétrica in vitro das células-tronco.
- Técnica de implantação minimamente invasiva.
Resultados Principais
- Otimização bem-sucedida de células-tronco para implante.
- Conhecimentos sobre a modulação do comportamento de células-tronco.
- Aplicações potenciais na recuperação de acidente vascular cerebral e métodos de entrega celular.
- Desafios identificados para novos usuários quanto à precisão e técnica.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa com células-tronco.
- Ele aprimora a compreensão dos mecanismos de recuperação após acidente vascular cerebral.
- Uma exploração adicional poderia levar a avanços na terapia celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Andaimes condutores elétricos para entrega de células-tronco oferecem uma plataforma inovadora para modular o fenótipo celular antes do transplante, abordando um desafio fundamental na medicina regenerativa e na modelagem de doenças neurológicas. Esta abordagem permite a otimização in vitro das propriedades das células-tronco, reforçando a confiança preditiva em estudos downstream in vivo e facilitando o avanço com ajuste de risco em pipelines pré-clínicos. A modularidade do método o posiciona como uma capacidade reutilizável para diversas aplicações em terapia celular e engenharia de tecidos.
Aplicações Estratégicas na P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite investigar a resposta de células-tronco a estímulos elétricos, esclarecendo as vias mecanicistas relevantes para a sobrevivência celular e a neuroregeneração.
- Auxilia na desmistificação biológica ao permitir a modulação e avaliação pré-implante da expressão gênica associada a resultados terapêuticos.
- Facilita a validação funcional de alvos ao correlacionar o pré-condicionamento in vitro com o desempenho in vivo em modelos de doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara populações padronizadas de células-tronco pré-condicionadas eletricamente para ensaios posteriores reprodutíveis.
- Permite a avaliação quantitativa da expressão gênica e da viabilidade celular após a estimulação, apoiando o desenvolvimento de ensaios.
- Oferece uma plataforma para avaliação escalonável de parâmetros de matriz e estimulação em diferentes tipos celulares.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a modulação celular in vitro com modelos in vivo relevantes para doenças, apoiando a descoberta translacional de biomarcadores.
- Permite a continuidade da otimização celular em estágio de descoberta até a validação pré-clínica em modelos de lesão neurológica.
- Apoia decisões ajustadas ao risco ao vincular os efeitos do pré-condicionamento aos desfechos funcionais pós-implante.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a modulação de células-tronco in vitro, seguida por testes in vivo em modelos de doenças, como acidente vascular cerebral. Ele permite a otimização iterativa e análises comparativas entre diferentes condições experimentais.
- Biologia da Descoberta: Fornece uma plataforma para testar hipóteses sobre o impacto da estimulação elétrica no fenótipo de células-tronco e na expressão gênica.
- Triagem: Gera populações celulares pré-condicionadas e reprodutíveis para ensaios funcionais subsequentes.
- Análises: Permite a medição quantitativa da expressão gênica e da viabilidade celular, apoiando decisões baseadas em dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta a otimização in vitro a estudos de eficácia in vivo em modelos animais relevantes.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho modular adaptável a diversos tipos celulares e contextos terapêuticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva nos resultados da terapia celular ao permitir modulação e avaliação pré-implante.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de preparação e estimulação celular, melhorando a reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção ao vincular a otimização in vitro ao desempenho in vivo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos a terapias celulares e modalidades de entrega.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura celular, estimulação elétrica e cirurgia em pequenos animais.
- Exige montagem precisa de câmaras celulares multicamadas e scaffolds condutores.
- Necessita de instrumentação validada para estimulação elétrica e análise quantitativa da expressão gênica.
- A padronização entre equipes é essencial para a reprodutibilidade entre experimentos e locais.
- A adaptação a outros tipos celulares ou modelos de doenças pode exigir otimização e validação do protocolo.
