Name: A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda a determinar o realce dependente de anticorpos da infecção por vírus da Dengue usando soro convalescente de Zika e citometria de fluxo. Este protocolo simples e de alto rendimento avalia a capacidade do soro de macacos rhesus infectados.

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O projeto descrito foi apoiado por fundos da Universidade de Ciências da saúde serviços fardado a JJM. As opiniões ou declarações contidas neste documento são os privados dos autores e não são ser interpretado como oficiais ou refletindo as opiniões do departamento de defesa, a Universidade de serviços fardado de Ciências da saúde ou qualquer outra agência dos Estados Unidos Governo.
WGV executadas todas as experiências e analisa os dados; JJM projetou e supervisionou o estudo; WGW e JJM escreveram o jornal.

As amostras de soro usadas para demonstrar o protocolo descrito aqui foram obtidas de macacos rhesus que estavam alojadas e cuidadas de acordo com o local, estado e federais condições em uma associação para avaliação e acreditação do cuidado de Animal de laboratório Internacional (AAALAC)-credenciado com facilidade. Todos os experimentos com animais foram revistos e aprovados pela Comissão de uso e cuidado institucional do Animal e as amostras foram adquiridas através de um protocolo de compartilhamento de tecido.
1. dia-1
Nota: Execute todos os passos descritos abaixo em uma fluxo de laminar estéril biossegurança armário usada para cultura de tecidos em um laboratório BSL-2.
<ol><li>Descongelar as amostras de soro à temperatura ambiente e transferir 100 µ l de cada amostra de soro a um tubo estéril. Calor inativar por 30 min a 56° C em banho-maria ou um thermomixer temperatura ajustável. Fazer 10 vezes seriais diluições da amostra soro variando de 1:1 a 1:1,000 usando frio RPMI-10 (RPMI com 10% de soro fetal bovino).</li>
	<li>Transferência de 10 µ l de amostra de soro diluído em série a cada poço um estéril 96 poços V-da placa de base. Incluem dois conjuntos de controle poços, RPMI-10 com RVPs só e sem amostra de soro e RPMI-10 só que sem RVPs e sem amostra de soro. Configure cada amostra de soro e RPMI-10 controles em triplica.</li>
	<li>Retire a Dengue-1, 2, 3 e 4 RVPs do congelador-80 ° C e descongele-os em banho maria a 37 ° C. Transferi os RVPs descongelados imediatamente em gelo. Obter RVPs aproximadamente 170 µ l de cada amostra de soro (10 µ l de poços RVPs x 3 para cada diluição (1:1, 01:10, 1: 100, 1:1, 000) e 10 µ l de poços RVPs x 3 para cada um dos 10-RPMI com RVP só controlam poços).</li>
	<li>Pipete 10 µ l de RVPs em cada bem a 96 poços V-da placa de base que contém a amostra de soro e o RPMI-10 com poços de controle RVPs (sem soro). Não adicione RVPs ao RPMI-10 só (nenhuma amostra de soro e sem RVP) poços. Misturar cuidadosamente pipetando para cima e para baixo 5-10 vezes. Adicionar 10 µ l frio RPMI-10 em vez de RVPs cada frio RPMI-10 somente (nenhuma amostra de soro e sem RVP) de controle de poços.</li>
	<li>Transferir a placa de V-fundo de 96 poços para uma incubadora e incubar a placa por 1 hora a 37 ° C, na presença de 5% de CO2. Enquanto a placa de 96 poços de V-fundo está incubando, limpe a superfície do armário com etanol a 70% da biossegurança e executar o UV luz por 15 min.</li>
	<li>Remover um balão T75 totalmente confluente de células K562 da incubadora, misturar as células bem usando uma pipeta estéril 5 mL e transferir 5ml de células para um tubo cônico estéril 15 mL. Nota: As células K562 são mantidas em RPMI-10 e repicagem em 1 x 106/mL.</li>
	<li>Contar o número de células por remover 10 µ l células do tubo cônico estéril 15 mL e misturar com o azul de tryphan 10 µ l. Conte as células usando um hemocytometer para determinar o número total de células no tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugue a 15ml cónico com células a ~ 1.200 x g durante 10 minutos, decante o sobrenadante e ressuspender as células em RPMI quente-10 em uma concentração de 80.000 µ l de células/30 de mídia (2.66 x 106 células /mL).</li>
	<li>Remova a placa de 96 poços de V-fundo da incubadora (passo 1.6), transferir 30 µ l de células K562 a cada poço da placa de 96 poços V-fundo e homogeneiza pipetando para cima e para baixo 5-10 vezes. Transferir a placa de V-fundo de 96 poços para uma incubadora e incubar a placa por 1 hora a 37 ° C, na presença de 5% de CO2.</li>
	<li>Após incubação por 1h, remova a placa de 96 poços de V-fundo da incubadora e centrifugar ~ 1.200 x g por 5 minutos. Após a centrifugação, decante a mídia dos poços, girando o prato de cabeça para baixo em um recipiente contendo água sanitária 10%.</li>
	<li>Lavar as células em cada poço por resuspending-los em 125 µ l de RPMI-10 quente, misture bem com uma pipeta e centrifugar a placa a ~ 1.200 x g durante 5 min. decantar a mídia girando o prato de cabeça para baixo em um recipiente contendo água sanitária 10%. Repita este passo de lavar duas vezes.</li>
	<li>Após a lavagem, adicionar 100 µ l de morno RPMI-10 a cada misture bem, subindo e descendo com a pipeta e incubar a placa por 48 h a 37 ° C, na presença de 5% de CO2.</li>
</ol>2. dia 3
<ol><li>Remover a placa de V-fundo de 96 poços contendo 100 µ l de células e de mídia/poço da incubadora e movê-lo para uma armário de biossegurança. Usando uma pipeta multicanal, misturar o conteúdo de cada bem e transferir as células e mídia para um fundo bem U 96 placa ou para pre-rotulado tubos polipropileno de 5 mL.</li>
	<li>Enxágue a cada poço em placa de 96 poços V-fundo com 100 µ l de 1% paraformaldeído (PFA) em 1 x fosfato tamponado salino (PBS) e transferência aos respectivos poços no 96 bem U-parte inferior da placa ou polipropileno tubos etiquetados 5ml da etapa 2.1 para produzir uma final concentração de 0,5% PFA/poço ou tubo. Misturar cuidadosamente com uma pipeta multicanal, cubra o prato com papel alumínio e deixe descansar na incubadora durante 30 minutos para consertar as células.</li>
	<li>Preparar o citômetro de fluxo (ver Tabela de materiais , por exemplo) executando imaculadas células K562 para calibrar o lado e espalhe para a frente, juntamente com as configurações de fluorescência. O canal de fluorescência apenas exigido é FL1, como GFP é a única fluorescência emitida a partir das células. Adquirir ~ 30, 000 – 50.000 células de cada amostra. Nota: Qualquer citômetro de fluxo capaz de ler uma única fluorescência pode ser usado para a aquisição de dados, como as células infectadas com RVPs só emitirão fluorescência verde devido à presença de GFP, e nenhum outro canal de fluorescência são necessários.</li>
</ol>3. análise de dados
<ol><li>
Analisar dados adquiridos sobre o citômetro de fluxo usando qualquer software de análise de citometria de fluxo (ver tabela de materiais).
	<ol>
<li>Conjunto o primeiro Portal baseado no FSC-A (dispersão frente – área) vs FSC-H (frente dispersão – altura) para incluir células únicas e excluir autofluorescente parelhas de análise12. Então, portão células dependentes de singlete baseadas no SSC-A (dispersão lateral – área) vs FSC-A para excluir todos os restos de autofluorescent.</li>
		<li>Analisar o SSC-A vs células gated FSC-A para a expressão de GFP baseado no SSC-A vs GFP-A. Determine a porcentagem de células GFP + para cada diluição das amostras de soro e controle definindo um portão ao redor de células GFP +.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine a percentagem média de células GFP + para cada diluição da amostra de soro e controle de poços, dividindo a percentagem de células GFP + em poços de três vias por 3.</li>
	<li>Calcule dobra-realce de infecção dividindo a percentagem média de células GFP + nas amostras de soro para cada diluição dividido pela percentagem média de células GFP + na RPMI-10 com poços de controle RVPs (nenhuma amostra de soro).</li>
	<li>Gráfico dobra-realce (eixo y) contra diluição (eixo x) e realizar análise estatística utilizando ANOVA seguida pelo teste post-hoc de Tukey para comparações múltiplas.</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Flavivírus como DENV e ZIKV compartilham significativa evidência de homologia em ambas as suas proteínas estruturais e não estruturais que geram anticorpos que reagem de forma cruzada com os outros13,14. Estas respostas de anticorpos cross-reactive têm sido mostradas para melhorar da infecção in vivo e em vitro com um sorotipo heterólogo ou outros relacionados flavivírus1,2. O potencial ...

Reforço de dependente de anticorpos (ADE) da infecção é um processo pelo qual respostas parcialmente cross-reactive anticorpos induzidas por um sorotipo de vírus aumenta a absorção de outro sorotipo do vírus, levando a virémia e aumento de replicação viral. ADE tem sido extensivamente documentada em infecções por vírus (DENV) Dengue onde quatro sorotipos principais são predominantes. Em um subconjunto de pacientes, ADE está associada com febre hemorrágica da Dengue (FHD). Recentemente mostramos que infecção por vírus (ZIKV) Zika induzido níveis significativamente elevados de respostas de anticorpos cross-reactive DENV que causou ADE de DENV em vitro e provavelmente contribuíram para o reforço da virémia no vivoDENV1 , 2. ensaios de realce dependente de anticorpo são uma ferramenta valiosa para avaliar a capacidade dos anticorpos para melhorar a infecção secundária com vírus relacionados e fornecer insights valiosos sobre a patogênese das infecções flavivirus e informar o desenvolvimento de vacinas.
O ensaio descrito aqui usa DENV RVPs juntamente com células K562 que são normalmente inadmissíveis à infecção. RVPs são estruturalmente intacta replicação incompetente DENV partículas virais que codificar um Replicão subgenômica de proteína verde fluorescente (GFP) que manifesta-se após uma única rodada de replicação3. Como tal, as células que são infectadas com RVPs fluorescem verde e podem ser facilmente detectadas usando citometria de fluxo ou microscopia. Os RVPs usadas neste ensaio foram obtidas de fontes comerciais. Eles podem, no entanto, ser gerado contra outros vírus e utilizada no ensaio descrito neste manuscrito. Enquanto isso, as células K562 são uma linhagem de células de leucemia FcγIII-receptor-expressando que se ligam à região Fc dos anticorpos e tornar-se infectado na presença de sub, neutralizando as concentrações de anticorpos4,5.
ADE ensaios têm sido amplamente utilizados em estudos investigando os fatores de risco para dengue grave e para delinear os mecanismos em vitro ADE6,7,8. O ensaio de ADE descrito aqui pode ser rapidamente e facilmente usado para determinar a capacidade do soro para aumentar a infecção em vitro usando RVPs e fluxo cytometry, em comparação com outros ensaios utilizados atualmente, que também exigem a determinação da formação de placa bacteriana unidades (pfu) em células Vero ou mancha do anticorpo de infectados células6,7,8,9,10,11, ambos os quais são demorados e trabalhistas intensiva.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integral Molecular</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 células</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>10% FBS em RPMI-10</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>MP biomédicos</td><td>1670049</td><td>100 UI Pen/mL, 100 ug Strep/mL em RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M em solução de aminoácidos não essenciais RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM (100 vezes;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x em RPMI-10</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM em RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas estéreis com fundo em V</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polipropileno 5 ml Tubos FACS</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Placas não estéreis com fundo em U</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>Uma alternativa de alto rendimento aos tubos FACS</td></tr><tr><td>5mL, estéreis, pipeta serológica</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL pontas</td> <td>de pipeta estéreisPonteiras</td> de pipeta estéreis Denville <td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL pipeta multicanal</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL pipeta multicanal</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% formadeído</td><td>Tousimis</td><td>&nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>termomixer</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>Uma alternativa a um banho-maria para inativação de calor</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante</td> líquido <td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Software de análise por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Citômetro de fluxo Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

a citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar in vitro anticorpo dependente do realce do vírus da dengue, usando soro convalescente vírus zika

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Realce dependente de anticorpo da infecção foi mostrado para jogar um papel importante na patogênese viral de Dengue. Os ensaios tradicionais que medem a capacidade dos anticorpos ou soro para aumentar a infecção em linhas celulares impermissible têm invocado usando saída viral na mídia seguida de ensaios de placa para quantificar a infecção. Mais recentemente, estes ensaios examinaram a infecção por vírus (DENV) Dengue em linhas celulares usando anticorpos fluorescente etiquetados. Ambas as abordagens têm limitações que restringem o uso generalizado destas técnicas. Aqui, descrevemos um ensaio simples em vitro usando Dengue vírus repórter partículas virais (RVPs) que expressam a proteína verde fluorescente e células K562 para examinar o anticorpo dependente do realce (ADE) de infecção DENV usando soro que foi obtido a partir do rhesus macacos de 16 semanas após a infecção com vírus Zika (ZIKV). Esta técnica é confiável, envolve manipulação mínima das células, não envolve a utilização de vírus competente de replicação ao vivo e pode ser executada em um formato de alta taxa de transferência para obter uma leitura quantitativa usando citometria de fluxo. Além disso, este ensaio pode ser facilmente adaptado para examinar o anticorpo dependente do realce (ADE) de outros flavivirus infecções tais como o vírus da febre amarela (YFV), vírus da encefalite equina japonesa (LILICA), vírus do Nilo Ocidental (WNV) etc onde RVPs estão disponíveis. A facilidade de criação de ensaio, analisando os dados e interpretação de resultados tornam altamente receptivos a maioria das configurações de laboratório.

Os soros de 4 do rhesus macaques foram coletadas 16 semanas após a infecção com ZIKV e testaram por seu potencial melhorar o DENV-1, 2, 3 e 4 infecção em células K562. Os animais tiveram virémia pico de ~ 1 x 105 cópias de RNA/mL ZIKV de plasma por dia 3 após infecção que recusou-se a níveis que estavam abaixo do limite de detecção por 7 dias após a infecção. Não virémia foi detectada no plasma a pós-infecção 16 semanas. Em seguida, realizou-se o ensaio da RVP e os dados coleta...

Descreveremos um protocolo simples e fácil para medição de reforço dependente de anticorpo da infecção por Zika vírus soro convalescente usando partículas virais da Dengue vírus repórter.

A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a capacidade dos soros coletados de macacos rhesus infectados pelo vírus Zika de mediar o aumento dependente de anticorpos da infecção pelo vírus da dengue in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas ao aumento dependente de anticorpos da infecção por dengue causada por anticorpos de reação cruzada induzidos pelo vírus Zika. A principal vantagem dessa técnica é que ela é alta, simples e fácil de executar.Demonstrando este procedimento estará William Valiant, um estudante de pós-graduação em doenças infecciosas emergentes, em meu laboratório. Comece descongelando as amostras de soro à temperatura ambiente. Quando descongelado, transfira 100 microlitros de cada amostra de soro para um tubo estéril e aqueça e ative por 30 minutos a 56 graus Celsius.Em seguida, faça diluições seriadas de 10 vezes da amostra de soro variando de um para um a um a mil em RPMI 10 frio. Em seguida, transfira 10 microlitros de cada amostra de soro diluído para os poços de uma placa estéril de fundo em V de 96 poços. Em seguida, descongelar as partículas virais da dengue uma, duas, três e quatro proporter em banho-maria a 37 graus Celsius, garantindo um volume de aproximadamente 170 microlitros de cada PVD por amostra de soro.Depois de descongelados, transfira imediatamente os tubos de RVPs para o gelo. Em seguida, pipete 10 microlitros de RVPs nos poços contendo diluições de amostras de soro nos poços de controle sem soro. Misture bem pipetando para cima e para baixo cinco a dez vezes.Transfira a placa de fundo em V de 96 poços para uma incubadora e incube por uma hora a 37 graus Celsius, na presença de 5% de dióxido de carbono. Enquanto a placa de fundo em V de 96 poços está incubando, limpe a superfície do gabinete de biossegurança com etanol a 70% e deixe a luz UV funcionar por 15 minutos. Em seguida, remova um frasco T-75 totalmente confluente de células K562 da incubadora.Misture bem as células usando uma pipeta estéril de cinco milímetros e transfira cinco mililitros para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Em seguida, remova 10 microlitros de células do tubo, misture com 10 microlitros de azul de tripano e carregue em um hemocitômetro. Conte as células e calcule o número total de células.Depois de centrifugar as células a 12 centenas de vezes G por 10 minutos, decantar o sobrenadante e ressuspender as células em RPMI 10 quente a uma concentração de 80 mil células por 30 microlitros de meio. Depois de remover a placa de fundo em V de 96 poços da incubadora, transfira 30 microlitros de células K562 para cada parede da placa de fundo em V de 96 poços. E misture bem pipetando para cima e para baixo de cinco a dez vezes.Em seguida, retorne a placa à incubadora por uma hora. Após a incubação, centrifugue a placa a 12 centenas de vezes G por cinco minutos. Após a centrifugação, decantar o meio dos poços, virando a placa de cabeça para baixo num recipiente contendo 10% de lixívia.Em seguida, lave as células em cada parede, ressuspendendo-as em 125 microlitros de RPMI 10 quente e centrifugando como antes. Após a decantação da última lavagem, adicione 100 microlitros de RPMI 10 quente a cada poço. Misture para cima e para baixo com a pipeta e incube a placa por 48 horas a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono.Dois dias depois, retire a placa da incubadora e transfira para um gabinete de biossegurança. Usando uma pipeta multicanal, misture o conteúdo de cada poço e transfira para uma placa de fundo em U de 96 poços. Enxágue cada poço da placa de fundo em V de 96 poços com 100 microlitros de 1% de paraformaldeído e PBS e transfira as células restantes e PBS para os respectivos poços na placa de fundo em U de 96 poços.Misture bem usando uma pipeta multicanal. Cubra a placa com papel alumínio e deixe descansar na incubadora por 30 minutos para fixar as células. Prepare o citômetro de fluxo executando células K562 não coradas para calibrar as configurações de dispersão lateral e direta usando o canal de etil-um para florescência GFP.Em seguida, adquira de 30 mil a 50 mil células de cada amostra. Usando o software de análise de citometria de fluxo, defina a primeira porta com base na área de dispersão direta versus a altura de dispersão direta para incluir células únicas e excluir dublets autofluorescentes da análise. Calcule a porcentagem média de células positivas para GFP para cada condição e, em seguida, calcule o aumento da infecção para cada diluição sérica.Aprimoramento da dobra do gráfico no eixo y versus diluição no eixo x e realizar análise estatística usando ANOVA seguida do teste post-hoc de Tukey para comparações múltiplas. Dados de um animal representativo usando partículas de vírus repórter do vírus da dengue são mostrados aqui. A porcentagem de células positivas para GFP para a amostra de controle sem soro foi de 0,253% A amostra de soro não diluído foi de 2,58% GFP positiva.A proporção de células positivas para GFP atingiu um máximo de 12,8% na diluição de um a dez soro, seguindo para 0,735% na diluição de um a cem e 0,022% na diluição de um a mil. O realce dependente de anticorpos da infecção por dengue foi examinado para os quatro tipos de soros do vírus da dengue. Os dados mostram que o soro coletado 16 semanas após a infecção aumentou significativamente a infecção de células K562 por todos os tipos de soros do vírus da dengue em uma diluição de um a dez.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 48 horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adquirir os dados dentro de uma a duas horas após a conclusão da etapa final de fixação de 30 minutos. Não se esqueça de que trabalhar com soro infectado pode ser extremamente perigoso e precauções como EPI e práticas de nível BSL2 devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

Este vídeo demonstra um ensaio para medir o realce dependente de anticorpos (ADE) da infecção pelo vírus da dengue usando o soro convalescente do vírus Zika. O ensaio usa partículas virais repórter da dengue (RVPs) que codificam uma proteína fluorescente verde. Os anticorpos séricos contra o vírus Zika reagem de forma cruzada com RVPs para formar um complexo. Os anticorpos ligados aumentam a captação de RVP pelas células que expressam o receptor Fc, que é detectado por citometria de fluxo.

Um ensaio in vitro para examinar o aumento dependente de anticorpos da infecção viral

O vídeo demonstra um ensaio in vitro para triagem de interferons com atividade antiviral contra o vírus Zika, um patógeno humano. Dentro da célula hospedeira, o vírus Zika sofre multiplicação após a internalização, infectando células vizinhas e criando zonas distintas ou placas virais. O interferon tipo I, atuando como agente antiviral, dificulta a multiplicação do vírus, impedindo assim a formação de placas virais na monocamada da célula hospedeira.

Um ensaio in vitro para triagem de interferons como inibidores potentes do crescimento do vírus Zika

O vírus Zika (ZIKV), um patógeno emergente, está ligado a anormalidades no desenvolvimento fetal e microcefalia. O estabelecimento de um sistema eficaz de cultura de células infecciosas é crucial para estudos de replicação do ZIKV, bem como para o desenvolvimento de vacinas e medicamentos. Neste estudo, vários ensaios virológicos relativos ao ZIKV são ilustrados e discutidos.

Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões

Vírus ou vesículas extracelulares foram imunocapturados com nanopartículas magnéticas de 15 nm acopladas a anticorpos que reconhecem antígenos de superfície. Os vírions ou vesículas capturados foram marcados com anticorpos fluorescentes contra outros antígenos de superfície. Os complexos resultantes foram separados em alto campo magnético e analisados com citômetros de fluxo convencionais acionados por fluorescência.

Fluxo Virometry para analisar antigênica Spectra de viriões e Extracelular vesículas

Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

Um protocolo para avaliar as respostas de células T antígeno-específicas nos órgãos immunoprivileged do Ifnar1- / - modelo murino para a infecção de vírus (ZIKV) Zika é descrito. Este método é essencial para investigar os mecanismos celulares da proteção e imunopatogênese das vacinas ZIKV e também é valioso para sua avaliação de eficácia.

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

Nós descrevemos um método para avaliar o efeito da imunidade pré-existente contra vírus da dengue sobre a infecção pelo vírus Zika usando soro humano, células humanas primárias e quantificação de infecção por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa.

Quantificação de realce dependente de anticorpo do vírus nas células humanas primárias Zika

O presente protocolo descreve a propagação do vírus Zika (ZIKV) em células Vero African green monkey kidney e a quantificação do ZIKV usando métodos de imunodetecção colorimétrica baseados em células nos formatos de 24 e 96 poços (alto rendimento).

Propagação de vírus e quantificação colorimétrica baseada em células

Aqui, demonstramos o uso da impedância elétrica baseada em células (CEI) como um método muito fácil e direto para estudar a infecção e replicação do vírus Zika em células humanas em tempo real. Além disso, o ensaio CEI é útil para a avaliação de compostos antivirais.

Plataforma de impedância elétrica baseada em células para avaliar inibidores do vírus Zika em tempo real

Aprenda a determinar o realce dependente de anticorpos da infecção por vírus da Dengue usando soro convalescente de Zika e citometria de fluxo. Este protocolo simples e de alto rendimento avalia a capacidade do soro de macacos rhesus infectados.

A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika (Vídeo) | JoVE Journal

A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika

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