A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika

O objetivo geral deste procedimento é determinar a capacidade dos soros coletados de macacos rhesus infectados pelo vírus Zika de mediar o aumento dependente de anticorpos da infecção pelo vírus da dengue in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas ao aumento dependente de anticorpos da infecção por dengue causada por anticorpos de reação cruzada induzidos pelo vírus Zika. A principal vantagem dessa técnica é que ela é alta, simples e fácil de executar.

Demonstrando este procedimento estará William Valiant, um estudante de pós-graduação em doenças infecciosas emergentes, em meu laboratório. Comece descongelando as amostras de soro à temperatura ambiente. Quando descongelado, transfira 100 microlitros de cada amostra de soro para um tubo estéril e aqueça e ative por 30 minutos a 56 graus Celsius.

Em seguida, faça diluições seriadas de 10 vezes da amostra de soro variando de um para um a um a mil em RPMI 10 frio. Em seguida, transfira 10 microlitros de cada amostra de soro diluído para os poços de uma placa estéril de fundo em V de 96 poços. Em seguida, descongelar as partículas virais da dengue uma, duas, três e quatro proporter em banho-maria a 37 graus Celsius, garantindo um volume de aproximadamente 170 microlitros de cada PVD por amostra de soro.

Depois de descongelados, transfira imediatamente os tubos de RVPs para o gelo. Em seguida, pipete 10 microlitros de RVPs nos poços contendo diluições de amostras de soro nos poços de controle sem soro. Misture bem pipetando para cima e para baixo cinco a dez vezes.

Transfira a placa de fundo em V de 96 poços para uma incubadora e incube por uma hora a 37 graus Celsius, na presença de 5% de dióxido de carbono. Enquanto a placa de fundo em V de 96 poços está incubando, limpe a superfície do gabinete de biossegurança com etanol a 70% e deixe a luz UV funcionar por 15 minutos. Em seguida, remova um frasco T-75 totalmente confluente de células K562 da incubadora.

Misture bem as células usando uma pipeta estéril de cinco milímetros e transfira cinco mililitros para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Em seguida, remova 10 microlitros de células do tubo, misture com 10 microlitros de azul de tripano e carregue em um hemocitômetro. Conte as células e calcule o número total de células.

Depois de centrifugar as células a 12 centenas de vezes G por 10 minutos, decantar o sobrenadante e ressuspender as células em RPMI 10 quente a uma concentração de 80 mil células por 30 microlitros de meio. Depois de remover a placa de fundo em V de 96 poços da incubadora, transfira 30 microlitros de células K562 para cada parede da placa de fundo em V de 96 poços. E misture bem pipetando para cima e para baixo de cinco a dez vezes.

Em seguida, retorne a placa à incubadora por uma hora. Após a incubação, centrifugue a placa a 12 centenas de vezes G por cinco minutos. Após a centrifugação, decantar o meio dos poços, virando a placa de cabeça para baixo num recipiente contendo 10% de lixívia.

Em seguida, lave as células em cada parede, ressuspendendo-as em 125 microlitros de RPMI 10 quente e centrifugando como antes. Após a decantação da última lavagem, adicione 100 microlitros de RPMI 10 quente a cada poço. Misture para cima e para baixo com a pipeta e incube a placa por 48 horas a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono.

Dois dias depois, retire a placa da incubadora e transfira para um gabinete de biossegurança. Usando uma pipeta multicanal, misture o conteúdo de cada poço e transfira para uma placa de fundo em U de 96 poços. Enxágue cada poço da placa de fundo em V de 96 poços com 100 microlitros de 1% de paraformaldeído e PBS e transfira as células restantes e PBS para os respectivos poços na placa de fundo em U de 96 poços.

Misture bem usando uma pipeta multicanal. Cubra a placa com papel alumínio e deixe descansar na incubadora por 30 minutos para fixar as células. Prepare o citômetro de fluxo executando células K562 não coradas para calibrar as configurações de dispersão lateral e direta usando o canal de etil-um para florescência GFP.

Em seguida, adquira de 30 mil a 50 mil células de cada amostra. Usando o software de análise de citometria de fluxo, defina a primeira porta com base na área de dispersão direta versus a altura de dispersão direta para incluir células únicas e excluir dublets autofluorescentes da análise. Calcule a porcentagem média de células positivas para GFP para cada condição e, em seguida, calcule o aumento da infecção para cada diluição sérica.

Aprimoramento da dobra do gráfico no eixo y versus diluição no eixo x e realizar análise estatística usando ANOVA seguida do teste post-hoc de Tukey para comparações múltiplas. Dados de um animal representativo usando partículas de vírus repórter do vírus da dengue são mostrados aqui. A porcentagem de células positivas para GFP para a amostra de controle sem soro foi de 0,253% A amostra de soro não diluído foi de 2,58% GFP positiva.

A proporção de células positivas para GFP atingiu um máximo de 12,8% na diluição de um a dez soro, seguindo para 0,735% na diluição de um a cem e 0,022% na diluição de um a mil. O realce dependente de anticorpos da infecção por dengue foi examinado para os quatro tipos de soros do vírus da dengue. Os dados mostram que o soro coletado 16 semanas após a infecção aumentou significativamente a infecção de células K562 por todos os tipos de soros do vírus da dengue em uma diluição de um a dez.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 48 horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adquirir os dados dentro de uma a duas horas após a conclusão da etapa final de fixação de 30 minutos. Não se esqueça de que trabalhar com soro infectado pode ser extremamente perigoso e precauções como EPI e práticas de nível BSL2 devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.