High Throughput Screening de SiRNA para lesão de células epiteliais de cloropicrina e córnea induzida pelo fluoreto do hidrogênio

Este vídeo mostra nossos métodos para triagem de siRNA de alto rendimento em um modelo de célula epitelial da córnea de lesão tóxica. Este trabalho é importante, porque a triagem de siRNA de alto rendimento é um método econômico e eficiente em termos de tempo para elucidar vias e reguladores da resposta celular a tóxicos. Este trabalho pode ajudar a aprofundar nossa compreensão de como a córnea responde a insultos tóxicos.

Prepare uma suspensão de células epiteliais da córnea em meio pré-aquecido contendo 0,5 microgramas por mililitro de hidrocortisona em um frasco médio descartável. Gire a garrafa para suspender uniformemente as células e despeje em um reservatório no ninho do agitador orbital de um manipulador de líquidos automatizado. Mantenha a suspensão celular em uma placa de aquecimento de 37 graus durante o processo de revestimento celular.

Use um manipulador de líquidos automatizado para adicionar células às placas a uma densidade de mil células por poço em 70 microlitros de meio por poço em uma placa de 96 poços. Semeie um mínimo de 14 placas de 96 poços com células para cada placa de biblioteca de siRNA a ser estudada. Execute o agitador orbital a 100 ciclos por minuto constantemente durante o processo de semeadura e use uma velocidade de pipetagem de 50 microlitros por segundo para todas as etapas.

Misture a suspensão celular usando o manipulador de líquido automatizado antes de semear a primeira placa. Aspire 140 microlitros da suspensão celular e dispense 70 microlitros em cada poço de duas placas de cultura de células. Repita a mistura e a distribuição até que todas as placas tenham sido semeadas com células.

Reabasteça o reservatório de suspensão celular conforme necessário. Depois que as placas forem semeadas, remova-as do manipulador de líquidos e incube-as por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira-os para uma incubadora de cultura de células.

Avalie a densidade celular de todas as placas na manhã seguinte usando um sistema de imagem automatizado, que está alojado na incubadora de cultura de células. Exclua do estudo as placas que possuem poços internos que não são entre 15% e 22% confluentes. Transfectar as células 24 horas após a semeadura com quatro picomoles por poço de siRNA e 0,3 microlitros por poço de reagente de transfecção, como segue.

Adquira placas de biblioteca de siRNA do fornecedor, configuradas para conter 80 alvos de siRNA por placa com as colunas um e doze deixadas vazias. Reconstituir a placa da biblioteca de siRNA com tampão de siRNA de acordo com as instruções do fabricante para uma concentração final de dois picomoles por microlitro para cada poço de siRNA. Realize todas as transfecções usando um manipulador de líquidos automatizado e uma velocidade de pipetagem de 25 microlitros por segundo para todas as etapas.

Use caixas de ponta pré-configuradas para abordar apenas os poços que serão transfectados. Use a metade superior da placa de biblioteca para transfectar um conjunto de seis placas replicadas, conhecido como Conjunto de Placas Superiores"Use a metade inferior da placa de biblioteca para transfectar um conjunto diferente de seis placas de réplica, conhecido como Conjunto de Placas Inferiores"Juntas, as doze placas compõem um conjunto completo de placas, e cada placa celular contém o mesmo conjunto de controles. Transfect poços B2 a B6 de todas as placas com siRNA de pool negativo após todos os conjuntos de placas superior e inferior terem sido transfectados com siRNA de biblioteca.

Também transfectam poços B2 a B6 de outras duas placas que não recebem siRNA de biblioteca com siRNA de pool negativo. Estes servirão como controles não expostos. Incube todas as placas celulares em uma incubadora de cultura de células por quatro horas após a adição das misturas de transfecção e misture batendo suavemente a cada hora.

Use um manipulador de líquidos automatizado para lavar as placas duas vezes com meio pré-aquecido, diluído de um a cinco em PBS e realimentado com 100 microlitros por meio pré-aquecido. Use uma velocidade de pipetagem de 50 microlitros por segundo para todas as etapas. Use os poços C2 a C6 como controles não transfectados.

Mantenha os poços B7 a B11 e C7 a C11 não transfectados, para serem usados como controles de drogas e veículos para exposição a tóxicos. 24 horas após a transfecção, use um manipulador de líquidos automatizado para realimentar as placas. Use uma velocidade de pipetagem de 50 microlitros por segundo para todas as etapas.

Aspire 100 microlitros de cada poço e descarte-os em um reservatório de resíduos. Realimente cada poço com 100 microlitros por poço pré-aquecido H-Cort.medium. Esvazie o reservatório de resíduos conforme necessário.

Reabasteça o reservatório com meio conforme necessário. Dois dias após a transfecção e duas horas antes da exposição, preparar uma solução micromolar 62,5 do controlo positivo Cardamonina em H-Cort. e adicionar à linha B do reservatório de diluição de 8 linhas.

Prepare uma solução de 06,25 por cento de DMSO em H-Cort. meduim, e adicione à linha C do mesmo reservatório. O DMSO é usado como controle do veículo.

Use o manipulador de líquidos automatizado para remover 10 microlitros de meio dos poços B7 a B11 e C7 a C11 de cada placa celular e descarte-o nas fileiras G e H do reservatório. Certifique-se de usar caixas de ponta pré-configuradas para abordar apenas os poços que receberão os controles positivos e do veículo e use uma velocidade de pipetagem de 50 microlitros por segundo para todas as etapas. Transfira 10 microlitros dos controles positivo e veicular para esses poços e misture três vezes.

Devolva essas placas de células à incubadora. Repita essas etapas para todas as placas de células adicionais. Realize todas as operações de exposição química em uma capela de exaustão química, usando luvas duplas de nitrilo, jaleco de laboratório, protetores de manga de polietileno descartáveis e óculos de segurança.

Descontamine as pontas da pipeta e os reservatórios que entraram em contato com o ácido fluorídrico e qualquer ácido fluorídrico líquido com 2,5% de gluconato de cálcio antes do descarte no fluxo de resíduos perigosos. Para cada placa de biblioteca sob investigação, prepare uma solução de meio de ácido fluorídrico a 0,0036% adicionando 288 microlitros de ácido fluorídrico a 1% a 80 mililitros de H-Cort pré-aquecido. médio em uma garrafa de 150 mililitros.

Agite a garrafa e incube o ácido fluorídrico diluído em uma incubadora de 37 graus na capela de exaustão química por dez minutos. Adicione a solução de ácido fluorídrico a um reservatório de reagente em um aquecedor de placas. Realize a exposição com dois técnicos trabalhando em conjunto.

Peça ao técnico à direita que remova o meio de cultura de células da placa celular usando um pipetador de doze canais e, em seguida, passe a placa para o técnico à esquerda. Peça ao técnico à esquerda que adicione 100 microlitros por poço da solução de meio de ácido fluorídrico. Repita esse processo para todas as placas celulares que serão expostas a substâncias tóxicas.

Além disso, repita esse processo para placas de controle não expostas, utilizando meio fresco em vez da solução de ácido fluorídrico. Coloque as placas em uma incubadora de hottes químicos por 20 minutos e, em seguida, devolva-as à incubadora de cultura de células. Repita a etapa de adição de controle positivo conforme mostrado anteriormente, uma vez que todas as placas tenham sido expostas e devolvidas à incubadora de cultura de células.

Colete o sobrenadante da cultura de células e avalie a viabilidade celular usando um ensaio MTT 24 horas após a exposição. Prepare uma solução de 0,5 miligramas por mililitro de substrato MTT em PBS contendo 10 gramas por litro de glicose e aqueça a 37 graus. Adicione a solução de substrato MTT a um reservatório em um manipulador de líquidos automatizado.

Use uma velocidade de pipetagem de 50 microlitros por segundo para todas as etapas. Pré-configure caixas de ponta para endereçar apenas os poços a serem analisados. Use o manipulador de líquido automatizado para aspirar 95 microlitros de meio dos 60 poços internos da placa celular e deposite 42,5 microlitros em cada uma das duas placas de armazenamento de 384 poços.

Adicione imediatamente 100 microlitros por poço da solução de substrato MTT às placas celulares e incube-as a 37 graus em uma incubadora de cultura de células por uma hora. Sele as placas de armazenamento de 384 poços e armazene-as a menos 80 para análise subsequente. Repita esse processo para todos os conjuntos de placas superior e inferior e os controles não expostos associados.

Reabasteça o reservatório de substrato MTT conforme necessário. Reutilize as pontas entre as réplicas, se desejar, mas lave-as ao adicionar a solução de substrato MTT e ao alternar entre os conjuntos de placas. Após a incubação de uma hora, use o manipulador de líquido automatizado para remover a solução de substrato MTT dos 60 poços internos de cada placa de cultura de células e substitua por 100 microlitros por poço de DMSO.

Use uma velocidade de pipetagem de 50 microlitros por segundo para todas as etapas e pré-configure as caixas de ponta para abordar apenas os poços a serem analisados. Esvazie o reservatório de resíduos e reabasteça o reservatório DMSO conforme necessário. Agite os pratos em uma coqueteleira por três minutos.

Meça a absorbância em 570 e 690 nanômetros, usando um espectrofotômetro de placas. Subtraia a absorbância de fundo a 690 nanômetros da absorbância a 570 nanômetros e calcule a média dos valores de cada grupo de controle na placa não exposta. Calcular a percentagem de viabilidade dividindo os valores de absorvância de cada alvo pelo valor médio de absorvância dos controlos não expostos.

Use o pool negativo médio não exposto para calcular a porcentagem de viabilidade celular para todos os destinos. Meça a concentração de IL-8 em sobrenadantes de cultura de células usando um ensaio baseado em esferas sem lavagem, de acordo com as instruções do fabricante. Crie um layout de placa de ensaio para acomodar amostras e padrões.

Remova as placas de armazenamento de 384 poços do freezer de menos 80 e descongele em temperatura ambiente. Centrifugue brevemente as placas para coletar a amostra no fundo dos poços. Adicione as esferas aceitadoras anti-IL-8 e o anticorpo biotinilado a uma placa preta de armazenamento de 384 poços.

Adicione a mistura de grânulo-anticorpo aos poços designados para uso em amostras e curva padrão, de acordo com o layout da placa de ensaio. Reconstituir o padrão em meio contendo cloreto de sódio 354 micromolar. Faça diluições seriais duplas da curva padrão e adicione triplicado a uma placa de armazenamento preta de 384 poços diferente.

Use um manipulador de líquidos automatizado para realizar o ensaio. Use caixas de ponta pré-configuradas para endereçar poços de acordo com o layout da placa de ensaio. Use uma velocidade de pipetagem de 50 microlitros por segundo para todas as etapas.

Transfira 8 microlitros da mistura de grânulo e anticorpo aceptor para placas de ensaio brancas de 384 poços rasos. Adicione a mistura de grânulo-anticorpo aos poços designados para uso em amostras e curva padrão de acordo com o layout da placa de ensaio. Em seguida, transfira a curva padrão para os poços apropriados nas placas de ensaio de poços rasos.

Em seguida, prepare uma solução de cloreto de sódio a 3,54 molares em um reservatório raso. Ajuste a concentração de sal das amostras para corresponder à da curva padrão, transferindo 4,5 microlitros da solução de cloreto de sódio para as amostras nas placas pretas de armazenamento de 384 poços. Misture as amostras três vezes usando um volume de mistura de 30 microlitros e, em seguida, transfira dois microlitros das amostras para as placas de ensaio brancas rasas de acordo com o layout da placa de ensaio.

Incube por uma hora no escuro em temperatura ambiente. Adicione contas secundárias a uma placa de armazenamento preta de 384 poços. Adicione os grânulos aos poços designados para uso em amostras e curva padrão de acordo com o layout da placa de ensaio.

Transfira 10 microlitros dos grânulos secundários para poços da placa de ensaio de poço raso branco de 384 poços que receberão curva padrão ou amostras de acordo com o layout da placa de ensaio. Lave as pontas entre cada prato. Incube por mais uma hora no escuro em temperatura ambiente.

Sele as placas de ensaio com selos de placa transparentes e digitalize usando um leitor de placas compatível com o ensaio baseado em esferas. Use uma distância de 0,2 milímetros entre a placa e o detector, tempo de excitação de 180 milissegundos para a varredura e tempo de medição de 550 milissegundos. Importe os dados brutos dos ensaios de IL-8 para uma planilha.

Use o ajuste de curva automatizado para a curva padrão dos ensaios de IL-8 e, em seguida, converta os dados brutos em picogramas por mililitro para cada amostra. Calcule a média das seis réplicas para cada alvo. Em seguida, calcule os valores SSMD e a mudança de dobra em relação aos controles negativos expostos.

Exiba os dados em um gráfico de lanterna dupla, que mostra a mudança de dobra ao longo do eixo x e SSMD ao longo do eixo y, para cada destino. Em conclusão, desenvolvemos métodos e condições de cultura adequados para o estudo de triagem de alto rendimento de lesões oculares por tóxicos. Provamos a utilidade desses métodos completando a triagem primária de uma biblioteca de siRNA em um modelo de lesão por ácido fluorídrico.

Conjuntos de dados genômicos de alto rendimento podem contribuir muito para a compreensão do papel que genes específicos desempenham em lesões ou doenças, o que pode ajudar a focar com mais eficiência os estudos in vitro ou in vivo de acompanhamento.