Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia tumoral sobre as micrometástases encontradas em pacientes com câncer de cólon. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a detecção altamente sensível com micrometástases induzidas por organoides de câncer de cólon derivados de pacientes marcados com GFP nos camundongos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque pode ser difícil detectar micrometástases derivadas de organoides de tumores de cólon em órgãos distantes em camundongos.

Demonstrando o procedimento com Yu Okazawa estarão Kosuke Mizukoshi e Yu Koyama, ambos estudantes de doutorado e cirurgiões do meu grupo. Para gerar organoides de células de câncer colorretal humano, primeiro adicione 150 microlitros de matriz extracelular artificial por poço a uma placa de 12 poços no gelo. Quando todos os poços tiverem sido revestidos, incube a placa por 30 a 60 minutos em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2 para solidificar os géis.

Em seguida, ressuspenda um pellet de células de xenoenxerto tumoral derivado do paciente em meio de cultura organoide de câncer colorretal fresco suplementado com soro de bezerro fetal a 5%, ou FCS, para atingir uma concentração de três vezes 10 a cinco células por mililitro e semeie um mililitro de células em cada matriz extracelular artificial. Em seguida, retorne as células para a incubadora de cultura de células. Na manhã seguinte, transfira cuidadosamente os sobrenadantes da cultura, incluindo as células flutuantes, para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para sua centrifugação e ressuspenda os pellets em 70 microlitros de matriz extracelular artificial fresca no gelo.

Para aumentar a viabilidade das células cancerígenas colorretais, sobreponha a célula tumoral flutuante contendo matriz extracelular artificial de volta aos poços revestidos com matriz extracelular artificial e incube as culturas de células tumorais por 30 minutos na incubadora de cultura de células. Quando o novo gel de matriz extracelular estiver solidificado, alimente as culturas com um mililitro de meio de cultura de células organoides de câncer colorretal fresco suplementado com 1% FCS e devolva as células à incubadora de cultura de células. Após sete a 10 dias de cultura, desprenda os organoides mecanicamente com um raspador de células estéreis e transfira os organoides para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para sua centrifugação.

Em seguida, ressuspenda os pellets em 500 microlitros de PBS com batidas suaves para outra centrifugação. Para dissociar os organoides do câncer colorretal, adicione 500 microlitros de solução enzimática proteolítica e colagenolítica aos tubos e misture com batidas suaves. Após 10 minutos em temperatura ambiente, adicione 500 microlitros de meio suplementado com 1% de FBS às células e pipete suavemente a suspensão celular várias vezes para quebrar os organoides.

A pipetagem suave de organoides CRC humanos durante o processamento é fundamental para manter uma formação esferóide intacta na cultura. Centrifugue as células novamente e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de estoque de lentivírus 5X GFP e 400 microlitros de meio de cultura organoide de câncer colorretal fresco. É essencial infectar os organoides humanos do CCR com um alto título de lentivírus GFP, particularmente para atingir uma infecção de quase 100% do CCR.

Ajuste o volume em cada tubo para atingir cinco vezes 10 para as cinco células tumorais dissociadas por 500 microlitros de concentração média e coloque 500 microlitros de células em cada poço de uma placa de 12 poços revestida com matriz extracelular artificial, conforme demonstrado. Após 18 horas na incubadora de cultura de células, transfira os sobrenadantes flutuantes contendo células para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro para centrifugação, seguido de ressuspensão dos pellets em 70 microlitros de matriz extracelular artificial por tubo em gelo. Para aumentar a viabilidade das células cancerígenas colorretais, sobreponha a matriz extracelular artificial contendo células tumorais nos organoides tumorais na placa de 12 poços e coloque a placa na incubadora de cultura de células por 30 minutos.

Quando o revestimento da matriz extracelular artificial estiver solidificado, alimente as culturas com um mililitro de meio de cultura organoide CRC fresco suplementado com 1% de FCS e devolva as células à incubadora de cultura de células por três dias. Em seguida, observe as células infectadas por microscopia de fluorescência para confirmar uma positividade de quase 100% de GFP e retorne as células à incubadora por mais quatro a seis dias. Para estabelecer um modelo de camundongo com metástase espontânea de xenoenxertos tumorais derivados de pacientes com CCR, dissocie os organoides marcados com GFP conforme demonstrado e dilua as suspensões de células tumorais únicas em cinco vezes 10 para as cinco células tumorais por 50 microlitros de PBS suplementado com 50% de concentração de matriz extracelular artificial.

Carregue 50 microlitros de células por camundongo em uma seringa equipada com uma agulha de calibre 22 e coloque as células tumorais no gelo. Em seguida, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé e coloque o primeiro camundongo NOG anestesiado em decúbito dorsal na bancada do laboratório. Usando uma pinça estéril, puxe suavemente a mucosa retal para fora do ânus e injete imediatamente as células tumorais na submucosa retal.

Para estabelecer um modelo experimental de metástase de xenoenxertos tumorais derivados de pacientes com CCR, dilua as suspensões de células tumorais únicas em uma concentração de quatro vezes 10 a quatro células por 50 microlitros e carregue 50 microlitros de células por camundongo em uma seringa equipada com uma agulha de calibre 22. Coloque o primeiro camundongo NOG anestesiado em decúbito ventral no banco e faça uma pequena incisão na região inferior do flanco esquerdo. Use tesouras e pinças estéreis para cortar cuidadosamente o peritônio e expor o baço, e use a pinça para agarrar a gordura presa ao baço.

Em seguida, injete lentamente 50 microlitros da suspensão de células tumorais no baço, tomando cuidado para que nenhum vazamento seja observado. Depois que todos os camundongos tiverem sido injetados e suturados conforme necessário, devolva os animais às gaiolas de origem e verifique se há vazamento e viabilidade da sutura um dia após a entrega das células tumorais. Use paquímetros para medir os tumores semanalmente, colhendo os tumores primários e tecidos relevantes até os pontos finais experimentais apropriados.

Transfira os tumores e órgãos dissecados para cinco mililitros de PBS gelado em uma placa de Petri de 10 centímetros no gelo e observe os tecidos dissecados sob um microscópio de estereofluorescência para avaliar sua expressão de GFP. A infecção por organoides CRC com lentivírus GFP, conforme demonstrado, resulta em quase todos os organoides expressando GFP muito brilhante. A injeção ortotópica e intraesplênica dos organoides marcados com GFP em camundongos NOG receptores secundários revela a formação de tumores primários positivos para GFP no local ortotópico, bem como nos pulmões da maioria dos camundongos examinados 2,5 meses após a injeção.

Além disso, metástases hepáticas são observadas em animais receptores NOG um mês após a injeção intraesplênica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar micrometástases de organoides de células de câncer colorretal humano marcadas com GFP após sua introdução em camundongos receptores. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a eficiência de homing de tumor e metástase de organoides de células de câncer de cólon humano em camundongos depende em grande parte da variabilidade interpaciente das células tumorais originais.