Name: Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Aprenda a medir o consumo de oxigênio mitocondrial em tórax permeabilizados de Drosophila usando respirometria de alta resolução. Este método requer quantidades mínimas de tecido e fornece resultados fisiologicamente relevantes para pesquisas metabólicas.

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Este estudo foi financiado por contribuições do nacional de Ciências e engenharia Research Council (NSERC, descoberta grant) e Université de Moncton, a NP. CLB gostaria de reconhecer o apoio de financiamento do Instituto canadense de pesquisa de saúde (CIHR), a Fundação de inovação de New Brunswick (NBIF) e Université de Moncton. O trabalho do EHC é apoiado pela sociedade de Alzheimer do Canadá, Canadá cérebro, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, Fundação de inovação de New Brunswick, New Brunswick saúde Research Foundation e Université de Moncton.

1. preparação de reagentes
<ol><li>Prepare as seguintes soluções para dissecção e permeabilização do tecido.<ol>
<li>Preparar a solução de preservação: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, 20mm taurina, 15mm fosfocreatina de2nd, imidazol 20 mM, 0.5 mM ditiotreitol e 50 mM K-MES, pH 7.1 (podem ser armazenados a-20 ° C).</li>
		<li>Preparar a solução de saponina: 5 mg de saponina em 1 mL de solução de preservação (preparar fresco diariamente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare as seguintes soluções para a medição da respiração.<ol>
<li>Prepare o suporte de respiração: 120 mM KCl, 5mm KH2PO4, 3mm HEPES, EGTA de 1 mM, 1 mM MgCl2e BSA de 0,2% (p/v), pH 7,2.</li>
		<li>Prepare substratos, desacoplador, inibidores. Dissolver todos os substratos em H2O e dissolver o desacoplador Compararia as well os inibidores em etanol absoluto (exceto malonato que é diluído em H2O). Neutralize a maioria dos substratos os malonato (ver Tabela de materiais). Todas as concentrações que constam do protocolo são concentrações finais no interior de câmaras de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação e calibração do Respirometer de alta resolução.
<ol><li>Lave as câmaras, tampas e rolhas do respirometer três vezes com etanol 70% e três vezes com água destilada.</li>
	<li>Calibrar em zero concentração de oxigênio: Pipetar 2,3 mL de meio de respiração nas câmaras e adicionar 10 mg de ditionito de sódio. Embora o volume máximo da câmara é 2 mL, 2,3 mL são adicionados para garantir que nenhuma bolha de ar permaneça sob a rolha quando fechar as câmaras. Fechar as câmaras com as rolhas e medir a concentração de oxigênio de 10-20 min.. calibrar os eléctrodos em zero concentração de oxigênio com a taxa de consumo de oxigênio resultante.</li>
	<li>Lave as câmaras com água destilada, incubar em etanol absoluto por 10 min e depois enxaguar com água destilada.</li>
	<li>Calibrar a saturação do ar: Pipetar 2,3 mL de meio de respiração nas câmaras, inserir as rolhas, Aspire o excesso de meio em cima as rolhas e em seguida, retire as rolhas com o espaçador. Médio de excesso de respiração é pipetado nas câmaras (volume de 2 mL total) para evitar a presença de bolhas de ar após fechar as câmaras.</li>
	<li>Monitorar o consumo de oxigênio por 45 min a uma hora, até que a concentração de oxigênio (traço azul) é estável em torno de 250 nM a 24 ° C.</li>
</ol>3. dissecação de moscas e permeabilização do tecido
<ol><li>Certifique-se de todas as etapas são executadas no gelo.</li>
	<li>Anaesthetize seis moscas masculinas da mesma estirpe, mesma idade e erguido sobre a mesma dieta no gelo para facilitar a dissecação das moscas (selvagem-tipo w1118, 15 dias de idade, alimentados com médias de farinha de milho).</li>
	<li>Usando um bisturi e uma pinça de ponta fina, disse as moscas (retire as cabeças e os abdomes) para manter apenas o avermelhado contendo os músculos de voo. Este passo pode ser feito a olho nu. Lidar com o resultante avermelhado com pinça de ponta fina.</li>
	<li>Transferi três avermelhado dissecado em uma placa de Petri contendo 2 mL de solução de preservação gelada, usando a pinça de 25 mm.</li>
	<li>Com a pinça de ponta fina, permeabilize mecanicamente o avermelhado por inserir a ponta da pinça o avermelhado e repetidamente rasgar o tecido para obter uma rede frouxamente conectada.</li>
	<li>Em uma placa de 24, encha dois poços com 12,5 µ l da solução de saponina e 1 mL de solução de preservação para obter uma concentração final de 62,5 µ g/mL de saponina. Encha os dois poços adjacentes com 1 mL de meio de respiração.</li>
	<li>Com a pinça de ponta fina, transferir três permeabilized avermelhado para a solução de saponina diluídos e incubar com agitação suave em um agitador orbital, no gelo, por 20 min.</li>
	<li>Após a incubação este último, transferi as fibras para os poços adjacentes, preenchidos com o meio de respiração com agitação suave, no gelo, por 5 min enxaguar a saponina.</li>
</ol>4. determinação do peso seco
<ol><li>Secar o avermelhado permeabilized sobre uma superfície absorvente e virar 3 - 4 vezes usando a pinça de ponta fina para certificar-se de que toda a umidade é removida.</li>
	<li>Pese o três avermelhado juntos em uma micro-balança. Observe o peso obtido como ele será usado para normalizar as taxas de consumo de oxigênio mitocondrial.</li>
	<li>Transferi os tecidos imediatamente em uma gota de meio de respiração no gelo.</li>
</ol>5. determinação de taxas de consumo de oxigênio
<ol><li>Abra as câmaras do respirometer (retire as rolhas) e adicionar 10 mM de piruvato e de malato de 2 milímetros em cada câmara.</li>
	<li>Adicione os tecidos permeabilized directamente para as câmaras, preenchidas com o meio de respiração.</li>
	<li>Substitua as rolhas usando o espaçador.</li>
	<li>Com uma seringa de 60 mL, coletar oxigênio diretamente de um tanque de oxigênio e Injete 2-5 mL de oxigênio através do capilar de rolha de cada câmara para certificar-se de difusão de oxigênio através dos tecidos não vai limitar o consumo de oxigênio.</li>
	<li>Introduza uma seringa Hamilton capilar de cada rolha para certificar-se de que o avermelhado permanecem na câmara.</li>
	<li>Fechar as câmaras completamente quando a concentração de oxigênio é de cerca de 400 nM, alcançando níveis de oxigênio acima de saturação do ar (cerca de 160% ar saturação) dentro das câmaras.</li>
	<li>Parar e reiniciar os agitadores para verificar se há bolhas de ar nas câmaras.</li>
	<li>Insira a massa de tecido pesado anteriormente para normalizar as taxas de respiração em massa de tecido (mg), exibindo o consumo de oxigênio de massa específica (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 do tecido).</li>
	<li>Uma vez que o consumo de oxigênio é estabilizado (traço vermelho), adicione 5 mM ADP com uma seringa de Hamilton.</li>
	<li>Após cada injeção, enxágue as seringas com água destilada, etanol a 70% e água destilada novamente.</li>
	<li>Uma vez que o consumo de oxigênio é estável novamente, injete 5 µ l de 4 mM de citocromo c.</li>
	<li>Prossiga para as injeções sequenciais dos seguintes substratos para avaliar o consumo de oxigênio mitocondrial em etapas diferentes do RCLE:<ol>
<li>Adicione 5 µ l de uma prolina 2m.</li>
		<li>Adicione 10 µ l de um succinato de 1m.</li>
		<li>Adicione 30 µ l de um M 1 glicerol-3-fosfato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injetar o Compararia desacoplador de uma forma de titulação por passos de 0,5-1 µM (2 µ l de uma solução de 1 mM) até a concentração ideal é alcançado, ou seja, a concentração para atingir o mais alto possível sem inibição de consumo de oxigênio (atenção: ver tabela de materiais).</li>
	<li>Injetar os seguintes inibidores sequencialmente para inibir totalmente o fluxo de elétrons na ETS para medir o consumo de oxigênio residual (ROX) ou seja, não respiratória reações tais como reações de oxigenase, entre outros:<ol>
<li>Adicione 1 µ l de rotenona um 1mm (atenção: ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Adicionar 5 µ l de um malonato de 2m (atenção: ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Adicione 1 µ l de uma antimycin de 5 mM A (atenção: ver Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione o ascorbato de 0,2 mM e 0,5 mM TMPD sequencialmente para as câmaras, começando com o ascorbato para medir o consumo de oxigênio pelo complexo IV.</li>
	<li>Adicionar 20 mM de azida de sódio para inibir o complexo IV (atenção: ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Uma vez que o sinal está estável, abrir as câmaras com o espaçador, re-oxigenar as câmaras injetando 2 mL de oxigênio puro e fechar as câmaras quando a concentração é em torno de 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>Medir o sinal por 10-15 min e calcular o fundo químico, ou seja, o consumo de oxigênio devido à auto-oxidação de TMPD.</li>
</ol>6. limpeza do Respirometer
<ol><li>Após as medições, enxágue as câmaras com água destilada uma vez e lave as câmaras três vezes em etanol a 70%.</li>
	<li>Incube em etanol absoluto por 10 min inactivar os inibidores.</li>
	<li>Lavar três vezes com água destilada, encher as câmaras com 70% de etanol e substituir as rolhas e as tampas até a próxima utilização.</li>
</ol>

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<li>Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+implications+of+mitochondrial+genetic+variation%3A+mitochondrial+genetic+effects+on+OXPHOS+respiration+and+mitochondrial+quantity+change+with+age+and+sex+in+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste estudo, é descrito um método para a preparação da amostra antes das medições de consumo de oxigênio mitocondrial em Drosophila. Este método foi desenvolvido para superar os diferentes problemas relacionados aos protocolos usando isolamentos mitocondriais, nomeadamente em termos de duração e número de indivíduos necessários. Em vez de trabalhar com os isolamentos mitocondriais exigindo geralmente grande quantidade de tecidos provenientes de vários indivíduos, esta experiência é realizada em permeabilized fibras musc...

Mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido usada como um organismo modelo para pesquisa genética para mais de um século1. O estudo deste organismo não deu origem apenas significativo conhecimento fundamental sobre herança ligada ao sexo2, taxa de mutação3, o desenvolvimento do sistema neural e o celular destino determinação4, mas também recentemente emergiu como um ferramenta valiosa para estudar os mecanismos inerentes à várias doenças como Alzheimer e Parkinson5,6. Além disso, é um modelo popular para estudar o processo de envelhecimento, como eles podem ser levantados em grande número durante um curto período de tempo e têm vida curta. Eles também possuem estruturas homólogas de órgãos humanos, tais como um coração, oenocytes (hepatócitos células), corpos de gordura (funcionando da mesma forma como o tecido adiposo branco e fígado), células (equivalentes a células β-pancreáticas), produtoras de insulina, bem como a hemolinfa transporta metabólitos (análogo ao sangue de vertebrados)7. Além disso, as vias centrais do metabolismo intermediário (incluindo o fator de crescimento insulina/insulin-like, como via de sinalização e vias de alvo de rapamicina-TOR) também são altamente conservadas7. Por estas razões, a drosófila recentemente têm sido explorados para descrever os mecanismos fundamentais que controlam o metabolismo, especialmente em condições patológicas inerentes ao humanas doenças metabólicas tais como diabetes,8. Um componente importante do metabolismo é a mitocôndria que integra múltiplos caminhos e executa uma das mais importantes funções biológicas de vida, produção de ATP, através do processo de fosforilação oxidativa (OXPHOS). Considerando seu papel central no metabolismo do organismo, não é de estranhar que disfunções mitocondriais estão envolvidas em muitas doenças como9 a doença de Parkinson e doenças de Alzheimer10, bem como na esclerose lateral amiotrófica 11 , 12. eles também são determinantes fundamentais do processo de envelhecimento. Na verdade, eles são os principais produtores de espécies reativas de oxigênio (ROS) na célula, que pode ser prejudicial para a célula em alta concentração através de de danos oxidativos11. Envelhecimento também tem sido associado à acumulação de danificado ou mutado DNA mitocondrial13, mitophagy disfunções14,15 , bem como o comprometimento da biogênese mitocondrial16. As mitocôndrias são também determinantes da homeostase da célula como eles podem utilizar diferentes substratos para ajustar várias funções celulares, de acordo com a abundância ou escassez de macronutrientes17,18.
Com efeito, os diferentes nutrientes na dieta (carboidratos, lipídios e proteínas) são digeridos, absorvidos e transportados nas células. Eles são então transformados no citosol, e os substratos derivados são transportados para a matriz mitocondrial, onde produzem equivalentes redutores, tais como NADH e DANIII219. Estes redutores equivalentes são então oxidados por complexos enzimáticos diferentes do sistema de transporte de elétrons (ETS). Estes complexos são incorporados na membrana mitocondrial interna, tais como complexo I e II do complexo. Além disso, outros complexos enzimáticos, tais como o glicerol-3-fosfato desidrogenase mitocondrial e a desidrogenase de prolina representam rotas alternativas para a entrada de elétrons para o ETS20,21. Estes complexos 'alternativos' são particularmente importantes em insetos, como de acordo com a espécie, eles podem participar activamente para aumentar a respiração20,22,23,21. Elétrons destes ETS sistemas de alimentação são transferidos para a ubiquinona e posteriormente ao complexo III e depois para o complexo IV, até o aceitador final, oxigênio molecular. Esta transferência de elétrons gera uma força motriz protónica através da membrana mitocondrial interna, dirigindo a fosforilação do ADP a ATP a complexo V (Figura 1). Considerando o papel central da mitocôndria na homeostase da célula, estudar o metabolismo mitocondrial, usando o modelo relevantes d. melanogaster representa uma ferramenta poderosa para delinear os mecanismos subjacentes de vário fisiopatológicos condições ou sob tensões ambientais e celulares. Surpreendentemente, no entanto, apenas um punhado de estudos efectivamente medidos respiração mitocondrial em Drosophila24,25,26. De fato, experimentos com o objetivo de avaliar o consumo de oxigênio mitocondrial exigem o isolamento da mitocôndria. Apesar de vantajoso para a medição de diferentes funções mitocondriais (tais como a produção de ROS ou P/O rácio como marcador de eficiência mitocondrial27,28), estes isolamentos geralmente requerem quantidades bastante grandes de tecido de vários indivíduos24,29. Este requisito para grandes quantidades de tecido e indivíduos é um importante fator limitante, especialmente considerando que todos os indivíduos devem ter a mesma idade e de preferência do mesmo sexo para os experimentos, tornando a medida da respiração em horário diferente na melhor das hipóteses, aponta laborioso. Além disso, enquanto os isolamentos mitocondriais podem fornecer insights significativos sobre os mecanismos fundamentais que regulam o metabolismo mitocondrial, os métodos usados para isolar as mitocôndrias têm várias desvantagens como a dificuldade de obter resultados replicáveis , interrupção da rede mitocondrial e alteração da mitocondrial estrutura e função de29,30,31.
O objetivo deste estudo é apresentar um protocolo robusto para medir o consumo de oxigênio mitocondrial em drosófila usando apenas uma quantidade mínima de tecido de muito poucos indivíduos. Esse protocolo consiste em medir o oxigênio mitocondrial consumo em situ usando permeabilized fibras musculares29 de avermelhado de Drosophila em combinação com alta resolução respirometria32,33, 34 , 35. este método também tem vantagens adicionais em comparação com o método clássico de isolamento mitocondrial desde as interações com os outros componentes da célula, como bem como mitocondrial estrutura e função são mais preservadas em permeabilizado fibras29,31,36, que faz com que esta abordagem mais fisiologicamente relevantes. Com este protocolo, funções mitocondriais podem ser exatamente avaliadas usando respirometria de alta resolução em apenas três avermelhado de Drosophila, com substratos, permitindo a determinação do consumo de oxigênio em várias etapas diferentes do RCE. Portanto, este protocolo poderia ajudar a responder questões chave sobre os mecanismos fundamentais que controlam o metabolismo no contexto de muitas condições ambientais ou fisiopatológicos, aproveitando o modelo de Drosophila.
Para medir o consumo de oxigênio em várias etapas diferentes do RCE e avaliar como diferentes substratos contribuem para a respiração, diferentes substratos (Figura 1), desacoplador e inibidores são usados30 após a permeabilização do tecido. Especificamente, adições sequenciais de diferentes substratos são realizadas para estimular a entrada de elétrons através dos complexos diferentes do RCE. Um desacoplador, cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi) phenylhydrazone (FCCP), então é adicionado na concentração ideal para medir a respiração não acoplados, ou seja, a respiração não-pressões estimuladas ao consumo máximo de oxigênio. Inibições sequenciais dos complexos que i, II e III são, em seguida, executada para monitorar o consumo de oxigênio residual que é devido a reações de oxidação não-ETS. Finalmente, a capacidade de respiração máxima complexa IV pode ser avaliada através da injeção de N, N, N', N, - tetrametil - p-fenilenodiamina (TMPD), um provedor de elétron artificial e ascorbato. É importante notar que as experiências são conduzidas a 24 °C, desde que é a temperatura em que as moscas são geradas.

<table><tbody><tr><td>Respirômetro de alta resolução Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Áustria</td><td>10022-02</td><td>Kit de respirômetro Startup O2K &nbsp;</td></tr><tr><td>Conjunto de Titulação O2K&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Áustria</td><td>20820-03</td><td>Seringas Hamilton com diferentes volumes &nbsp;</td></tr><tr><td>Software Datlab</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Áustria</td><td>20700</td><td>Software para aquisição e análise de dados &nbsp;</td></tr><tr><td>Pinça antimagnética de ponta fina</td><td>VWR</td><td>82027-400</td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Secura225D-1S-DQE</td><td>Sartorius AG, Goettingen, Alemanha</td><td></td><td>Balança semimicro (distribuída por várias empresas)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster tipo selvagem w1118</td><td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td><td></td><<td>br/> Condição de armazenamento: 24 &deg; C</td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&prime;,N&prime;-ácido tetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA Condição de armazenamento: RT</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>CUIDADO: corrosivo para metais, toxicidade aguda, corrosão da pele, danos oculares graves, toxicidade aquática aguda. Condição de armazenamento: RT</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td> Condição de armazenamento: RT</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td> Condição de armazenamento: -20 & C</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td> Condição de Armazenamento: RT</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td> Condição de Armazenamento: RT</td></tr><tr><td>Na2Fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td> Condição de Armazenamento: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td> Condição de Armazenamento: RT</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td> Condição de Armazenamento: 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>MES hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td> Condição de armazenamento: RT</td></tr><tr><td>Saponina da casca de quillaja</td><td></td><td></td><td>Saponina Condição de armazenamento: RT Preparação da solução: 5 mg em 1 mL de solução de preservação. Prepare fresco diariamente.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td> Condição de Armazenamento: RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td> Condição de Armazenamento: RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td> Condição de Armazenamento: RT</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05470</td><td> Condição de Armazenamento: 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>Na2S2O4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>Ditionito de sódio. CUIDADO: substâncias e misturas de autoaquecimento, toxicidade aguda, toxicidade aquática aguda toxicidade aquática crônica. Condição de armazenamento: RT</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Piruvato Condição de armazenamento: 2-8 &deg; C Preparação da solução: Em água MilliQ. Prepare fresco diariamente.</td></tr><tr><td>L-(-)-Ácido málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>Malato Condição de armazenamento: RT Preparação da solução: Em água MilliQ. Neutralizar com KOH e conservar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Hidrato de sal monopotássico de adenosina 5'-difosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>ADP Condição de armazenamento: -20 &deg; C Preparação da solução: Em água MilliQ. Neutralize com KOH e armazene a -80 °C.</td></tr><tr><td>Citocromo c do coração equino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>Citocromo c Condição de armazenamento: -20 &deg; C Preparação da solução: Em água MilliQ. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Proline Condição de armazenamento: RT Preparação da solução: Em água MilliQ. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Succinato de sódio dibásico hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>Succinato Condição de armazenamento: RT Preparação da solução: Em água MilliQ. Neutralizar com HCl e armazenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>sal de sn-Glicerol 3-fosfato bis(ciclohexilamônio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>Glicerol-3-fosfato Condição de armazenamento: -20 &deg; C Preparação da solução: Em água MilliQ. Neutralizar com HCl e armazenar a -80 °C.</td></tr><tr><td>Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP. CUIDADO: toxicidade aguda, sensibilização cutânea, toxicidade aquática crônica. Condição de armazenamento: RT Preparação da solução: Em etanol absoluto. Conservar em frascos de vidro a -20 °C.</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>CUIDADO: toxicidade aguda, irritação da pele, irritação ocular, toxicidade de órgãos-alvo específicos (sistema respiratório), toxicidade aquática aguda, toxicidade aquática crônica. Preparação da solução: Em etanol absoluto. Conservar em frascos escuros a -20 °C.</td></tr><tr><td>Ácido malônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Malonato. CUIDADO: toxicidade aguda, danos oculares graves. Condição de armazenamento: RT Preparação da solução: Em água MilliQ. Neutralize com KOH. Prepare fresco diariamente.</td></tr><tr><td>Antimicina A de Streptomyces sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimicina A. CUIDADO: toxicidade aguda, toxicidade aquática aguda, toxicidade aquática crônica. Condição de armazenamento: -20 &deg; C Preparação da solução: Em etanol absoluto. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametil-p-fenilenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD Condição de armazenamento: RT Preparação da solução: Em água MilliQ. Armazene em frascos escuros em&nbsp; -20 °C.</td></tr><tr><td>(+)-Ascorbato de L-Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Ascorbato Condição de armazenamento: RT Preparação da solução: Em água MilliQ. Armazene em frascos escuros em&nbsp; -20 °C.</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Azida sódica. CUIDADO: toxicidade aguda (oral e dérmica), toxicidade para órgãos-alvo específicos (cérebro), toxicidade aquática, toxicidade aquática crônica.&nbsp; Preparação da solução: Em água MilliQ. Armazene a -20 ° C.</td></tr></tbody></table>

medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Mosca da fruta, Drosophila melanogaster, representa um modelo emergente para o estudo do metabolismo. Com efeito, drosófila têm estruturas homólogas de órgãos humanos, possuem vias metabólicas altamente conservadas e têm uma duração relativamente curta que permite o estudo de diferentes mecanismos fundamentais em um curto período de tempo. No entanto, é surpreendente que um dos mecanismos essenciais para o metabolismo celular, a respiração mitocondrial, não tenha sido cuidadosamente investigado neste modelo. É provável, porque a medida da respiração mitocondrial em Drosophila geralmente requer um grande número de indivíduos e os resultados obtidos não são altamente reprodutíveis. Aqui, um método que permite a medição precisa do consumo de oxigênio mitocondrial usando quantidades mínimas de tecido da drosófila é descrito. Neste método, o avermelhado é dissecados e permeabilizado mecanicamente com Pinças afiadas e quimicamente com saponina, permitindo que diferentes compostos atravessar a membrana celular e modulam a respiração mitocondrial. Após a permeabilização, um protocolo é realizado para avaliar a capacidade dos diferentes complexos do sistema de transporte de elétrons (ETS) para oxidar substratos diferentes, bem como a sua resposta para um desacoplador e vários inibidores. Esse método apresenta muitas vantagens em comparação com métodos usando isolamentos mitocondriais, como é mais fisiologicamente relevante porque as mitocôndrias são ainda interagir com os outros componentes celulares e a morfologia mitocondrial é conservada. Além disso, os preparativos de amostra são mais rápidos, e os resultados obtidos são altamente reprodutíveis. Combinando as vantagens da drosófila como um modelo para o estudo do metabolismo com a avaliação da respiração mitocondrial, importante novas percepções podem ser reveladas, especialmente quando as moscas estão experimentando diferentes ambientais ou fisiopatológicos condições.

Um traço representativo do consumo de oxigênio mitocondrial usando o protocolo descrito acima é fornecido na Figura 2. O piruvato e malato injetado nas câmaras juntamente com as fibras musculares permeabilized são chamados para a respiração de CI-fuga, ou seja, quando o complexo I de ETS é estimulada pelo NADH produzido através da oxidação do piruvato e malato através do ciclo do ácido cítrico (CI). Durante esta taxa de respiração, o oxigênio mitocon...

Neste trabalho, é descrito um método para medir o consumo de oxigênio usando respirometria de alta resolução em permeabilized avermelhado da drosófila. Esta técnica requer uma quantidade mínima de tecido, em comparação com a técnica de isolamento mitocondrial clássico e os resultados obtidos são fisiologicamente mais relevantes.

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a respiração mitocondrial na mosca da fruta comum, Drosophila Melanogaster, usando respirometria de alta resolução. Isso é conseguido dissecando primeiro a Drosophila, para coletar o tórax. Os tórax contendo os músculos de vôo são então cuidadosamente permeabilizados mecanicamente, com pinças afiadas, e incubados com saponina, para posterior permeabilização. Os tórax são então transferidos para as câmaras de um respirômetro, e o consumo de oxigênio mitocondrial é medido com uma combinação de diferentes substratos, desacopladores e inibidores. Oi, eu sou Chlo

measurement-mitochondrial-oxygen-consumption-permeabilized-fibers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca...

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

A análise da relação estrutura-função mitocondrial é necessária para uma compreensão completa dos mecanismos regulatórios da funcionalidade mitocondrial. Métodos específicos para estudar a estrutura e função mitocondrial em ovários vivos e fixos de Drosophila são descritos e demonstrados neste artigo.

Estudar mitocondrial estrutura e função em Drosophila ovários

Apresentamos um protocolo para medição de consumo de oxigênio e a acidificação extracelular nos cérebros de larvas e adultos de Drosophila melanogaster . Um analisador metabólico é utilizado com um protocolo adaptado e otimizado. Microtecido restrições são uma componente essencial do presente protocolo e foram concebidas e criadas especificamente para a sua utilização nesta análise.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

Respiração mitocondrial é fundamental para a sobrevivência; Portanto, a taxa de consumo de oxigênio é um excelente indicador de saúde mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um respirometer comercialmente disponível para medir basal e taxas de consumo máximo de oxigênio em viver, intacto e livremente motile Caenorhabditis elegans.

Medição das taxas de consumo de oxigênio em intacta Caenorhabditis elegans

A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

A respirometria coulométrica é ideal para medir a taxa metabólica de pequenos organismos. Quando adaptado para Drosophila melanogaster no presente estudo, o consumo medido de O2 estava dentro da faixa relatada para D. melanogaster selvagem por estudos anteriores. O consumo por mosca O2 pelos mutantes CAS , que são menores e menos ativos, foi significativamente menor do que o selvagem.

Mensuração do Consumo de O2 em Drosophila melanogaster Utilizando Microrrespirometria Coulométrica

Apresentamos aqui um protocolo de respirometria de alta resolução para análise bioenergética em mutantes PINK1B9-null. O método utiliza o protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Analisando a função mitocondrial em um mutanteB9-nulo de Drosophila melanogaster PINK1 usando respirometria de alta resolução

Este artigo descreve um método para avaliar as interações e montagens de proteínas integrais de membrana in vitro com vários fatores parceiros em um ambiente lipídico-proximal.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

Aprenda a medir o consumo de oxigênio mitocondrial em tórax permeabilizados de Drosophila usando respirometria de alta resolução. Este método requer quantidades mínimas de tecido e fornece resultados fisiologicamente relevantes para pesquisas metabólicas.

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

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