Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

O objetivo geral deste procedimento é identificar em células cultivadas ou em tecidos, os parceiros moleculares de RNA de um RNA longo não codificante de interesse. Este método pode ajudar a decifrar as funções biológicas de um RNA longo não codificante, fornecendo novos conhecimentos significativos sobre a regulação do RNA por RNAs longos não codificantes. A principal vantagem deste método é que ele é utilizável para a maioria das aplicações, uma vez que o otimizamos, primeiro para vários RNAs longos não codificantes e segundo para células cultivadas e extratos de tecidos.

Nosso método é baseado na mistura de dois métodos anteriores, o ChIRP, que significa Isolamento da Cromatina por Purificações de RNA, e o CHART, que é a Análise de Hibridização de Captura de Alvos de RNA. A especificidade do nosso método é que as sondas de oligonucleotídeos foram projetadas usando modelagem bioinformática de uma estrutura secundária de um RNA longo não codificante e seu objetivo era identificar os alvos de RNA. Demonstrando o procedimento estarão dois técnicos da minha equipe, Benedicte Boyer e Severine Guillen.

Depois de cultivar células GH4C1 de acordo com o protocolo de texto, remova o meio de uma placa de cultura de células e use um volume de PBS para enxaguar as células. Adicione 10 mililitros de 1% de PFA em PBS para fixar as células. Em seguida, reticule as células sob agitação à temperatura ambiente por 10 minutos.

Extinguir a ação do PFA adicionando 1 mililitro de glicina molar 1,25 e agitar a amostra à temperatura ambiente durante cinco minutos. Em seguida, descarte a solução por aspiração e use 10 mililitros de PBS para enxaguar a placa duas vezes por cinco minutos cada. Em seguida, adicione um mililitro de PBS, use um raspador de células para coletar células e transfira-as para um tubo de centrífuga.

Girar a amostra a 510 g e quatro graus Celsius durante cinco minutos. Em seguida, remova o máximo de sobrenadante possível e armazene os pellets indefinidamente a 80 graus Celsius negativos. Para realizar a reticulação do tecido, mergulhe cinco miligramas de tecido da glândula pituitária de camundongo recém-obtido em um volume de 10X de 1% de PFA em PBS e agite a amostra em temperatura ambiente por 10 minutos.

Resfrie o PFA adicionando 0,05 mililitros de solução de glicina molar 1,25 e agite o tecido em temperatura ambiente por cinco minutos. Aspire o meio e use 0,5 mililitros de PBS para enxaguar o tecido duas vezes. Depois de remover o máximo de sobrenadante possível, armazene o tecido reticulado indefinidamente a 80 graus Celsius negativos.

Prepare o tampão de lise e lise as amostras sem descongelamento prévio. Use o tampão para ressuspender amostras em aproximadamente um mililitro por 100 miligramas de pellet ou tecido celular. Coloque as amostras lisadas em banho-maria de quatro graus Celsius e inicie a série de sonicação otimizada de acordo com o protocolo de texto.

Imediatamente após a sonicação, centrifugar as amostras a 12 000 g e a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Em seguida, transfira os sobrenadantes para novos tubos. A série de sonicação deve ser otimizada para ser eficiente o suficiente para reduzir a viscosidade do DNA sem obter outros RNAs fragmentados.

Para realizar a hibridização nas amostras sonicadas, adicione dois volumes de tampão de hibridização aos tubos e ao vórtice. Transfira 20 microlitros de cada amostra para tubos de centrífuga e armazene a 20 graus Celsius negativos. Adicionar 100 picomoles de sondas de oligonucleótidos biotinilados a cada amostra.

Em seguida, incubar as amostras sob agitação moderada em um rotador de tubo à temperatura ambiente por quatro a seis horas. Após a incubação, adicione 50 microlitros de esferas magnéticas de estreptavidina suplementadas com 200 unidades por mililitro de uma solução inibidora de RNase e um coquetel de inibidor de protease de 5 microlitros por mililitro às amostras. Incube os tubos à temperatura ambiente sob agitação moderada no rotador do tubo durante a noite.

No dia seguinte, faça o isolamento do RNA colocando os tubos em um suporte magnético e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 900 microlitros de tampão de lavagem aos grânulos e coloque os tubos em um rotador em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, coloque as amostras no ímã, descarte o tampão e repita a lavagem cinco vezes.

Após remover a lavagem final, adicione 95 microlitros de tampão Proteinase K e cinco microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase-K à amostra. Em seguida, no gelo, descongele as amostras de entrada e adicione 75 microlitros de tampão Proteinase K e cinco microlitros de proteinase-K. Incube as amostras a 50 graus Celsius por 45 minutos e depois a 95 graus Celsius por 10 minutos.

Refrigere as amostras no gelo por três minutos, depois coloque-as no ímã e colete o sobrenadante contendo os RNAs e descarte as contas. Use um kit de purificação de RNA para purificar os RNAs. Finalmente, armazene os RNAs a 80 graus Celsius negativos e realize RT e qPCR e construa bibliotecas de DNA de acordo com o protocolo de texto.

Com base na modelagem bioinformática da estrutura secundária do lncRNA ilustrada aqui, as sondas foram projetadas contra dois lncRNAs, ratos Neat1 ou Malat1 para células cultivadas em GH4C1 e Neat1 de camundongo para extratos de tecido hipofisário. O enriquecimento relativo de Neat1 ou Malat1 foi calculado para sondas não específicas e específicas em relação às amostras de entrada. Esta figura mostra a eficiência das sondas específicas para puxar Neat1 para baixo na linha celular hipofisária GH4C1 de rato e em extratos de tecido hipofisário de camundongo.

Quando o protocolo para oligonucleotídeos específicos ou sondas SO foi direcionado para Malat1, uma sonda eficiente foi gerada junto com uma sonda ineficiente que foi descartada. Após pull-downs de RNA e RT qPCR, os RNAs associados a Neat1 em extratos de células GH4C1 também foram associados a Neat1 em extratos de tecido hipofisário. De fato, após a retirada do RNA Neat1, descobriu-se que o Malat1 é direcionado pelo Neat1 tanto na linha celular GH4C1 quanto em extratos de tecido de camundongo hipofisário.

Além disso, Neat1 foi significativamente enriquecido após um pull-down de RNA Malat1 ser realizado com a sonda em células GH4C1. A estreita relação identificada entre os dois lncRNAs é consistente com o potencial papel co-regulador de Neat1 e Malat1, sugerido por camundongos knock-out para Malat1 que exibem variações na expressão de RNA Neat1. Uma vez dominada, essa técnica permite em dois ou três dias a captura dos alvos de RNA de um RNA longo não codificante desejado.

Com a abordagem de bioinformática, é importante projetar várias sondas anti-sentido e, em seguida, comparar experimentalmente sua eficiência, porque a eficiência da sonda pode ser alterada por preparações de lisado celular. Seguindo este procedimento, o sequenciamento de RNA de alto rendimento pode ser realizado para fornecer todo o interactoma de RNA de um RNA longo não codificante de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como capturar os parceiros de RNA de um RNA longo não codificante usando sondas eficientes e específicas que hibridizam com regiões disponíveis do RNA longo não codificante, conforme determinado pela modelagem de bioinformática de sua estrutura secundária.