Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

O objetivo geral da entrega intraespinhal de vírus adeno-associados recombinantes é permitir a marcação histológica e a manipulação funcional de neurônios geneticamente definidos na medula espinhal dorsal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da dor, como quais circuitos neuronais são necessários para a percepção de diferentes modalidades de dor. A principal vantagem dessa técnica é que os neurônios geneticamente marcados podem ser manipulados de maneira especialmente restrita e controlada temporalmente.

Localize o par de costelas mais caudal palpando ao longo da coluna vertebral do camundongo anestesiado. Em seguida, faça um corte longitudinal de 1,5 a 2,5 centímetros na pele, começando apenas do rostral até o par de costelas mais caudal. Levante a pele com uma pinça e separe-a do músculo subjacente com uma tesoura.

Durante toda a cirurgia, mantenha os tecidos expostos úmidos com cloreto de sódio estéril a 0,9%. Usando uma pinça fina e uma tesoura pequena, faça uma incisão na próxima camada membranosa fina, bem ao lado da linha média, e corte-a dos processos espinhosos. Vários pontos de referência anatômicos podem ajudar a identificar as vértebras corretas a serem alvo.

Aqui, descrevemos três alternativas. Palpe ao longo da coluna vertebral. O par de costelas mais caudal está localizado apenas rostral às vértebras T13 e o osso pélvico ao nível do quadril está no nível das vértebras L6.

Como alternativa, puxe a pele para trás em direção à cauda para expor a crista ilíaca. No mesmo nível, o par mais caudal de ligamentos intertransversos visíveis se junta ao processo espinhal L6. Conte para trás na direção caudal a rostral para identificar as vértebras de interesse.

Caso contrário, localize o local onde o tendão ao longo do lado da coluna vertebral é mais branco e medial. As vértebras T13 estão localizadas apenas rostral. O segmento L4 da medula espinhal lombar está localizado dentro dessas vértebras.

Em seguida, coloque o animal em uma almofada de lenços enrolados para elevá-lo aos grampos espinhais da estrutura estereotáxica. Alinhe os grampos adjacentes às vértebras alvo. Fixe uma pinça na posição e, em seguida, segure a coluna vertebral com uma pinça Adson enquanto fixa a segunda pinça.

Confirme o clamping adequado pressionando cuidadosamente as vértebras alvo. Em seguida, remova o músculo paraespinhoso acima das vértebras de interesse. Primeiro, faça uma incisão medial aos tendões paralelos à coluna vertebral.

Em seguida, faça incisões perpendiculares rostral e caudal às vértebras alvo. Em seguida, use rongeurs para rasgar ou cortar o músculo paraespinhoso acima das vértebras de interesse. Use uma pinça conforme necessário para remover o tecido remanescente nas vértebras ou acima da dura-máter no espaço intravertebral.

O vaso sanguíneo dorsal agora deve estar visível, marcando a linha média da medula espinhal. Para injeções unilaterais, execute uma laminectomia parcial usando uma broca de dentista fina equipada com um cortador esférico de 0,5 milímetro para fazer um furo com muito cuidado no meio do lado alvo das vértebras. Remova quaisquer fragmentos ósseos restantes com uma agulha chanfrada de calibre 26 para expor a medula espinhal.

Use a agulha para perfurar a dura-máter nos espaços intravertebrais rostral e caudal às vértebras alvo, aproximadamente 300 mícrons laterais ao vaso sanguíneo dorsal. Em seguida, perfure a dura-máter embaixo do orifício perfurado. Neste ponto, o líquido cefalorraquidiano deve escapar dos orifícios e a medula espinhal deve estar ligeiramente saliente.

Prepare a seringa para injeção montando primeiro o capilar de vidro numa seringa de microlitros. Aperte bem a porca para garantir um ajuste firme e seguro. Encha a seringa de microlitro com água destilada estéril e, em seguida, pressione o êmbolo.

Se a água não for facilmente expelida da ponta, é provável que a micropipeta esteja bloqueada e deve ser trocada. Monte a seringa em um micromanipulador conectado a um microinjetor controlado eletronicamente. Em seguida, use o microinjetor para extrair cerca de um microlitro de ar para separar a água e o vírus.

Em seguida, pipete uma gota de 2,5 microlitros de solução viral diluída em um pedaço de filme de parafina. Mova cuidadosamente a ponta da micropipeta para dentro da gota usando a estrutura estereotáxica e puxe-a para dentro da micropipeta. Em seguida, pressione dispensar até que uma gota de solução de vírus surja na ponta.

Retraia a seringa e use uma caneta para marcar a micropipeta com uma escala para monitorar o volume dispensado. Use o braço estereotáxico para mover a ponta da micropipeta sobre um dos orifícios da dura-máter e depois para baixo até que uma leve depressão apareça na superfície da medula espinhal exposta. Para direcionar a injeção para o corno dorsal espinhal, mova a ponta para baixo a uma profundidade de 500 mícrons em incrementos de 100 mícrons e depois para cima 200 mícrons para permitir a estabilização mecânica do tecido.

A profundidade final da ponta é de 300 mícrons. Depois de programar a bomba para injetar 300 nanolitros a uma velocidade de injeção de 50 nanolitros por minuto, pressione o botão Iniciar para iniciar a infusão. Após a conclusão da injeção, verifique a escala na micropipeta para ver se o nível de vírus diminuiu.

Deixe a micropipeta no lugar por mais três minutos para permitir que a pressão se equilibre. Após três minutos, retraia lentamente a micropipeta e repita o procedimento para os outros dois locais de injeção. Após a injeção final, remova os grampos espinhais e a almofada abaixo do mouse.

Feche as camadas de incisão com pontos interrompidos, suturando as camadas de tecido superficial com suturas absorvíveis e a pele com suturas não absorvíveis. Aplique desinfetante de iodo na ferida suturada. Interrompa a anestesia e deixe o animal no tapete térmico até que ele se recupere antes de devolvê-lo à sua gaiola de origem.

O tecido espinhal no local da injeção deve ser examinado no final do experimento. Isso é necessário para verificar o sucesso da injeção e transdução e para excluir danos teciduais excessivos como resultado da cirurgia. Para ilustrar os níveis de expressão que podem ser obtidos por injeção intraespinhal de AAV recombinante, um vírus que codifica a proteína fluorescente eGFP foi injetado na medula espinhal lombar de camundongos do tipo selvagem.

Três injeções espaçadas aproximadamente um milímetro produziram uma infecção quase contínua dos segmentos da coluna lombar L3 a L5. A injeção de vírus a uma profundidade de 300 mícrons da superfície espinhal leva à infecção predominante de células no corno dorsal da medula espinhal. No entanto, células infectadas também podem ser encontradas no corno ventral. Um vetor flex dependente de cre expressando eGFP foi injetado na medula espinhal de camundongos transgênicos GlyT2:Cre.

Isso resultou em uma expressão mais restrita de eGFP, refletindo a distribuição de neurônios positivos para GLYT2. Seguir este protocolo permitirá o direcionamento de três segmentos consecutivos da coluna. Descobrimos que isso é suficiente para obter resultados de comportamento robustos.

Esta técnica permitirá estudar a função de populações específicas de neurônios e células e vias sensoriais.