A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

O objetivo geral deste procedimento é usar imagens de células vivas para avaliar as decisões de destino celular após o tratamento com o medicamento antimitótico paclitaxel. Este método nos permite visualizar como as células individuais respondem a diferentes doses do medicamento antimitótico paclitaxel. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma riqueza de informações sobre células únicas ou populações inteiras que não podem ser obtidas a partir de imagens de células fixas ou ensaios de base populacional.

Demonstrando este método está Marc Vittoria, um candidato a MD / PhD no Laboratório Ganem. Para começar, limpe o fundo de vidro do prato de imagem com limpador óptico para remover quaisquer impressões digitais ou poeira que possam interferir na imagem. Use limpador óptico suficiente para molhar toda a superfície do vidro.

Coloque a placa com fundo de vidro com células na platina do microscópio no adaptador da placa de imagem. Remova a tampa plástica do prato e cubra o prato com uma câmara com tampo de vidro. Certifique-se de que a câmara tenha uma válvula para permitir um fluxo constante de ar composto por 5% de dióxido de carbono.

Para umidificar o dióxido de carbono de 5%, o gás é fluído através de tubos inseridos em um invólucro estéril em banho-maria. Isso permite que o gás fique equilibrado a 95% de umidade. Inicie e calibre o estágio codificado usando o programa de software que controla o microscópio.

Isso garantirá coordenadas XY precisas e evitará desvios focais. Em seguida, execute a iluminação Kohler levantando o condensador e fechando a abertura para que o campo fique escuro. Abaixe o condensador até que uma forma hexagonal nítida de luz seja visível.

Em seguida, use os parafusos de centralização para centralizar o hexágono de luz no campo de view. Quando a forma hexagonal estiver visível, abra a abertura até que todo o campo de visão esteja iluminado. Ative o foco automático do microscópio para garantir que todos os pontos sejam mantidos em foco durante o experimento.

Use o software de aquisição para selecionar vários campos de visão não sobrepostos de cada poço para geração de imagens. Selecione regiões de imagem onde as células aderiram bem ao fundo do vidro e estão entre 50 e 70% confluentes. Evite áreas de células aglomeradas, pois isso dificultará a análise subsequente.

Para avaliar o destino da célula mitótica, configure o software de imagem para coletar imagens de cada campo de visão selecionado a cada 10 minutos por até 96 horas. A mitose não perturbada dura de 20 a 40 minutos e, portanto, intervalos de 10 minutos fornecerão amostragem suficiente para identificar quando as células se dividem. Para identificar a ruptura nuclear, que é um evento transitório, adquira imagens a cada cinco minutos.

Identifique as células que entram na mitose por observação do arredondamento celular, usando óptica de contraste de fase e / ou condensação cromossômica, usando histona humana H2B fundida à GFP. Tanto o arredondamento celular quanto a condensação cromossômica são facilmente visualizados a olho nu. Anote o momento em que a célula entra em mitose.

Continue rastreando a célula até que ela atinja seu destino. As células de controle devem alinhar eficientemente seus cromossomos e entrar na anáfase dentro de uma hora. Visualize a anáfase por óptica de contraste de fase à medida que a célula começa a se dividir em duas ou através da visualização de cromossomos que se movem em direção aos pólos marcados com H2B-GFP.

Anote o momento em que a célula sofre anáfase. Por outro lado, as células tratadas com paclitaxel permanecerão arredondadas com cromossomos condensados por várias horas. Identifique as células mitoticamente paradas que sofrem morte celular.

As células que morrem durante a mitose são visualizadas por microscopia de contraste de fase, pois as células borbulham, encolhem e/ou se rompem. Se a imagem de H2B-GFP, os cromossomos também se fragmentarão durante a morte celular. Identifique as células mitoticamente presas que sofrem deslizamento celular.

As células que sofrem deslizamento mitótico são observadas por microscopia de contraste de fase, à medida que se achatam de volta à interfase e descondensam os cromossomos sem sofrer anáfase. Essas células dão origem a grandes células tetraplóides que geralmente são multinucleadas. Continue rastreando células a partir do campo de visão original.

Depois que todo um campo de visão for rastreado, vá para um campo de visão separado adquirido do mesmo poço e continue rastreando as células. Avalie o destino celular após o deslizamento mitótico usando a linha de células epiteliais pigmentadas da retina não transformadas e cromossomicamente estáveis que expressam o sistema FUCCI. Para confirmar se o sistema FUCCI está funcionando corretamente, valide se as células de controle alternam a expressão das proteínas fluorescentes vermelhas e verdes adequadamente a partir da análise dos dados de imagem de células vivas.

As células de controle devem fazer a transição da exibição de fluorescência vermelha inteiramente nuclear para a exibição de fluorescência verde totalmente nuclear durante a interfase, à medida que as células progridem da fase G1 para a fase S. As células devem continuar exibindo fluorescência verde durante a conclusão da mitose. Imediatamente após a mitose, as células devem mais uma vez exibir fluorescência totalmente vermelha durante a interfase.

Identifique as células presas na mitose usando microscopia de contraste de fase e rastreie-as até que sofram deslizamento mitótico. As células que saem da mitose e voltam para a interfase mudarão de exibir fluorescência verde durante a mitose para fluorescência vermelha durante a fase G1. Rastreie essas células escorregadias usando contraste de fase e imagens epifluorescentes a olho nu para avaliar seu destino celular.

Identifique as células que reentram no ciclo celular. Essas células são identificadas pela mudança de vermelho para verde na expressão de fluorescência usando o sistema FUCCI que indica a transição G1 / S. Identifique as células que sofrem parada do ciclo celular G1.

Essas células são identificadas pela expressão de fluorescência vermelha que persiste por mais de 24 horas. Além disso, identifique as células que morrem na interfase. Essas células são identificadas por ruptura celular, bolhas e encolhimento usando imagens de contraste de fase.

Visualize as células como antes. O sinal de fluorescência da repetição de dímero em tandem de RFP fundido a um sinal de localização nuclear, ou TDRFP-NLS, e H2B-GFP devem co-localizar durante a interfase. A mitose é visualizada por arredondamento celular usando óptica de fase e / ou condensação cromossômica por H2B-GFP.

Após a mitose, o envelope nuclear se decompõe e o sinal TDRFP-NLS se torna citoplasmático. Após a mitose, o envelope nuclear se reformará nas células-filhas e o sinal TDRFP-NLS se tornará nuclear. Rastreie as células-filhas ao longo da interfase subsequente por meio de imagens de células vivas.

Identifique eventos de ruptura nuclear observando uma explosão transitória de TDRFP-NLS localizada no núcleo Em poucos minutos, o envelope nuclear será reparado e o TDRFP-NLS será realocado para o núcleo. Aqui são mostradas imagens representativas de uma célula escorregadia ficando verde e entrando na fase S após escorregar do tratamento com paclitaxel.

A maioria das células que escaparam do tratamento com paclitaxel sofreu uma parada G1 / G0 e permaneceu vermelha por mais de 48 horas sem sofrer apoptose. As células vermelhas pós-deslizamento também sofrerão apoptose, conforme representado por esta imagem. A ruptura do envelope nuclear aumenta nas células tratadas com paclitaxel.

As células TDRFP-NLS e H2B-GFP tratadas com paclitaxel 10-nanomolar têm uma ruptura nuclear aumentada na qual a RFP será deslocalizada do núcleo para o citoplasma em células interfásicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão sólida de como realizar imagens de células vivas de longo prazo para avaliar o destino celular em resposta a vários tratamentos medicamentosos.