Síntese de nanotubos de carbono de paredes Multi modificados com nanopartículas de prata e avaliação das suas actividades antibacterianas e propriedades citotóxicas

O objetivo geral deste procedimento é produzir nanocomplexos antibacterianos que consistem em nanotubos de carbono com nanopartículas de prata sintetizadas nas superfícies do nanotubo. Este método pode ser usado no desenvolvimento de novos nanomateriais bacterianos que têm baixa toxicidade para humanos, ao mesmo tempo em que têm fortes propriedades sépticas para diversos tipos de bactérias e biofilmes. O protocolo descreve a avaliação de nanocomplexos na erradicação de bactérias, mantendo sua biocomparabilidade com humanos.

Para iniciar o procedimento, coloque 30 a 50 miligramas de MWCNTs em um frasco de 50 mililitros. Usando uma micropipeta equipada com pontas de pipeta de um mililitro, adicione lentamente oito mililitros de uma solução de três para um em volume de ácido sulfúrico e ácido nítrico aos MWCNTs. Aguarde 30 minutos para que a reação exotérmica termine e, em seguida, sonice a solução a 60 a 80 graus Celsius e 160 watts até que os MWCNTs assentem no fundo do frasco, o que geralmente leva cerca de uma hora.

Transfira a mistura para um tubo de centrífuga. Use uma micropipeta para adicionar cuidadosamente 30 mililitros de água destilada gota a gota aos MWCNTs funcionalizados com ácido carboxílico, fazendo uma pausa para permitir que a mistura esfrie conforme necessário. Em seguida, centrifugue a mistura a 12 000 g durante 15 minutos.

Remova o sobrenadante com uma pipeta equipada com uma ponta de pipeta de um mililitro. Adicione cinco mililitros de etanol ao sólido e enxágue as paredes do frasco com etanol adicional. Centrifugar novamente a mistura com as mesmas regulações e verificar o pH do sobrenadante com papel de pH.

Continuar a lavar os sólidos por centrifugação em etanol até que o pH do sobrenadante seja neutro, depois remover o sobrenadante e adicionar um mililitro de água destilada ao precipitado. Disperse os MWCNTs funcionalizados com ácido carboxílico na água e liofilize a dispersão a menos 60 graus Celsius sob vácuo. Coloque 10 miligramas de MWCNTs funcionalizados com ácido carboxílico liofilizado em um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros.

Adicione 30 mililitros de água destilada ao tubo. Combine seis mililitros de nitrato de prata normal 0,1 e 18 mililitros de água destilada em outro tubo cônico de 50 mililitros. Sonicar ambas as misturas a 60 graus Celsius e 160 watts por uma hora.

Em seguida, enquanto ainda sonica a dispersão MWCNT a 60 graus Celsius e 160 watts, adicione a solução de nitrato de prata gota a gota à dispersão MWCNT usando uma pipeta equipada com uma ponta de pipeta de um mililitro. Uma vez concluída a adição, continuar a sonicar a mistura durante uma hora, centrifugar a mistura durante 15 minutos a 12 000 g à temperatura ambiente e retirar o sobrenadante. Disperse novamente os MWCNTs de prata em 30 mililitros de água destilada por sonicação a 24 graus Celsius por 30 minutos.

Repetir a centrifugação em 30 mililitros de água destilada e retirar o sobrenadante duas vezes. Em seguida, dispersar os MWCNTs de prata lavados em um mililitro de água destilada por sonicação por cinco minutos. Adicione cinco mililitros de etanol à dispersão e mexa a mistura em temperatura ambiente por uma hora.

Em seguida, centrifugar a mistura durante 15 minutos a 12 000 g à temperatura ambiente e verificar o pH do sobrenadante. Remover o sobrenadante e voltar a dispersar a mistura em cinco mililitros de etanol por vórtice. Continuar a lavar o precipitado em etanol por centrifugação até que o pH sobrenadante seja neutro.

Finalmente, disperse os MWCNTs de prata lavados em um mililitro de água destilada. Liofilizar a dispersão a 70 graus Celsius negativos sob vácuo durante 24 horas e armazenar a dispersão num recipiente selado. Para começar a preparar o teste, misture e autoclave 18,12 gramas de ágar R2A e um litro de água destilada.

Deixe o gel esfriar em temperatura ambiente. Quando o gel estiver pronto para derramar, coloque 10 mililitros de gel em placas de Petri de 90 milímetros e deixe o ágar endurecer. Em uma capela de exaustão, use um laço e uma agulha esterilizados em chama de álcool para listrar 100 microlitros de uma mistura de espécies de metilobactéria na superfície do meio de cultura.

Incube os pratos a 30 graus Celsius por 48 horas, depois misture 3,12 gramas de caldo R2A com um litro de água destilada e autoclave o meio a 121 graus Celsius por 15 minutos. Use uma alça esterilizada e uma agulha para transferir as colônias para o meio de crescimento R2A. Incubar a amostra em uma incubadora agitada a 30 graus Celsius e 180 RPM.

Meça a densidade óptica em 600 nanômetros por hora até que a densidade óptica seja maior que 0,7. Em seguida, prepare outra placa de Petri contendo 10 mililitros de ágar R2A. Em seguida, misture 3,12 gramas de caldo R2A e oito gramas de ágar com um litro de água destilada.

Autoclave a mistura a 121 graus Celsius por 15 minutos. Misture 100 microlitros da cultura de metilobactéria na mistura de ágar. Despeje 10 mililitros do gel contendo metilobactéria sobre a camada inferior do ágar R2A na placa de Petri e, em seguida, prepare uma dispersão da concentração desejada de MWCNTs de prata liofilizados em água destilada.

Use uma micropipeta para carregar 50 microlitros dessa dispersão em um disco de papel estéril de seis por um milímetro. Aplique água destilada em outro disco de papel estéril como controle. Seque e esterilize ambos os discos em uma câmara de vácuo sob luz ultravioleta por 30 minutos.

Em seguida, coloque a amostra MWCNT de prata e o controle no ágar e incube a placa de ágar a 30 graus Celsius por 48 horas. Meça a zona de inibição ao redor da amostra MWCNT de prata quando terminar. Antes do teste, autoclave água triplamente destilada a 121 graus Celsius por 15 minutos.

Prepare uma dispersão de 1000 microgramas por mililitro de MWCNTs funcionalizados com ácido carboxílico e dispersões de 50 microgramas por mililitro, 40 microgramas por mililitro e 30 microgramas por mililitro de MWCNTs de prata nesta água estéril. Para iniciar o procedimento de teste antibacteriano, prepare uma cultura de metilobactéria conforme descrito anteriormente e monitore sua densidade óptica em 600 nanômetros. Quando a densidade óptica estiver no máximo, inocular 100 microlitros da cultura de metilobactéria em três mililitros de meio de cultura R2A fresco.

Coloque 500 microlitros desta solução em cada um dos cinco tubos cônicos de 15 mililitros. Adicione 100 microlitros de metanol a um dos tubos para preparar a amostra de referência de metanol. Preparar uma amostra para cada uma das quatro dispersões da mesma maneira.

Incubar as amostras e a cultura de controle de metilobactéria restante a 180 RPM e 30 graus Celsius até que a densidade óptica do controle indique atividade máxima. Use um espalhador esterilizado para espalhar cada amostra em gel de ágar R2A sólido em placas de Petri. Incube os pratos a 30 graus Celsius por 48 horas.

Contar as colónias bacterianas resultantes e determinar a concentração bacteriocida mínima. MWCNTs de prata foram sintetizados com sucesso usando o procedimento descrito. O tamanho médio das partículas de prata depositadas foi de aproximadamente 3,83 nanômetros.

O crescimento de metilobactérias não foi observado quando cultivado com dispersões de 50 microgramas por mililitro ou 40 microgramas por mililitro de MWCNTs de prata. A população bacteriana foi reduzida 100.000 vezes em relação à amostra de controle quando cultivada com uma dispersão de 30 microgramas por mililitro de MWCNTs de prata. Uma zona de inibição foi observada em torno de uma amostra preparada a partir de uma dispersão de 10 microgramas por mililitro de MWCNTs de prata.

Nenhuma zona de inibição foi observada para uma amostra preparada a partir de uma dispersão de um micrograma por mililitro. Alguma citotoxicidade foi observada quando uma dispersão de 40 microgramas por mililitro de MWCNTs de prata foi adicionada. Nenhuma citotoxicidade significativa foi observada quando uma dispersão de 30 microgramas por mililitro foi adicionada.

Um ensaio de azul de tripano confirmou que havia citotoxicidade mínima quando uma dispersão de 30 microgramas por mililitro de MWCNTs de prata foi adicionada. Este protocolo ajudaria os pesquisadores na preparação de nanocomplexos que possuem nanopartículas metálicas que atuam diretamente sobre nanomateriais de carbono. Seguindo este protocolo, os pesquisadores também seriam capazes de avaliar as propriedades antibacterianas dos nanocomplexos preparados.