Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos

O objetivo geral deste método experimental é testar o papel dos plasmídeos multicópias na evolução da resistência aos antibióticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia, como o papel dos plasmídeos multicópias na evolução das inovações bacterianas. A principal vantagem dessa técnica é que ela requer apenas métodos básicos de biologia molecular e um projeto experimental simples.

É muito legal. Primeiro, construa a cepa e coli MG1655 que carregará o gene de resistência do anticorpo no cromossomo no fago lambda no lado da equação ATTB. Para fazer isso, o PCR amplifica as 500 regiões paralongas de base em ambos os lados do local ATTB.

Em seguida, a PCR amplifica o gene de resistência a antibióticos. Em seguida, use o conjunto isotérmico a 50 graus Celsius por 30 minutos para fundir as regiões de homologia ao produto de PCR. Após a montagem isotérmica, transfira um microlitro do produto para 40 microlitros de células MG1655 eletrocompetentes para uma cubeta de dois milímetros.

Em seguida, eletropore as células a 4 graus Celsius e 2,5 quilovolts. Após a eletroporação, transfira as células em um mililitro de caldo LB com 0,2% de arabinose. Em seguida, pipete o caldo LB contendo células para um tubo de microcentrífuga.

Agite o tubo intensamente por duas horas a 30 graus Celsius. Após duas horas, coloque 100 microlitros da cultura na placa de ágar LB, suplementada com antibióticos. Em seguida, gire para baixo as células restantes.

E ressuspenda o pellet em 100 microlitros de caldo LB fresco. Coloque novamente essas células em outra placa de ágar LB. Em seguida, incube as placas a 42 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, a PCR amplifica os clones para verificar a construção usando os primers externos ybhC extern e ybhB extern. Em seguida, confirme o tamanho do amplicon através da eletroforese da casca de agarose. Paralelamente, realize o sequenciamento de DNA para verificar a sequência do gene inserido.

Para construir a cepa para transportar o gene de resistência do anticorpo no plasmídeo multicópia, primeiro a PCR amplifica o gene de resistência a antibióticos blaTEM-1. Após a conclusão da PCR, fosforilar o produto amplificado usando polinucleotídeo quinase T4. Em seguida, use polimerase e oligonucleotídeos de alta fidelidade PBAD FINV e PBAD RINV, para amplificar a estrutura do plasmídeo PBAD por PCR.

Em seguida, ligue os dois fragmentos de PCR usando ligase T4. Em seguida, eletropore células alfa DH5 de 40 microlitros com 1 microlitro do produto de ligação. Em seguida, selecione o antibiótico apropriado para o gene de resistência a antibióticos e a estrutura do plasmídeo em placas de ágar.

Em seguida, execute a extração de plasmídeo usando um kit de extração de DNA, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, realize o sequenciamento sanger do gene de resistência de interesse para confirmar a ausência de possíveis mutações antes dos experimentos de evolução. Após a verificação da sequência, eletroporar o plasmídeo na cepa de e coli MG1655 para finalmente obter o plasmídeo que carrega a cepa MG1655.

As etapas mais críticas neste protocolo são a construção das linhagens dos sistemas modelo e a reconstrução das mutações observadas durante a evolução experimental. Primeiro, risque as cepas de interesse MG1655 nas placas de ágar LB. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio LB em cada poço de uma placa de 96 poços.

Em seguida, inocular 48 colônias isoladas de cada cepa em poços individuais da placa. Após a inoculação, incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius num agitador a 200 rotações por minuto. Novamente, inocule dois microlitros da cultura de cada poço com a população fundadora em uma nova placa de 96 poços com 198 microlitros de meio LB em poços individuais.

Isso iniciará o experimento de resgate evolutivo. Incubar a placa a 37 graus Celsius em um agitador a 200 rotações por minuto por 20 horas. A cada dia, dobre a concentração do antibiótico em relação ao dia anterior.

No dia seguinte, transfira 2 microlitros da respectiva cultura para uma placa fresca de 96 poços e continue todos os dias. Registre a leitura da densidade óptica a 600 nanômetros dos poços individuais em um leitor de placas. Uma etapa crítica do protocolo é a evolução experimental e suas concentrações crescentes de antibióticos.

A taxa de variação das concentrações de antibióticos é um dos parâmetros que podem ser modificados para promover a evolução da resistência aos antibióticos. Novamente, incube a placa a 37 graus Celsius em um agitador a 200 rotações por minuto por 20 horas. Em seguida, meça a leitura da densidade óptica em 600 nanômetros para cada população sobrevivente todos os dias no leitor de placas.

Congele as populações periodicamente, a cada três a cinco dias. Extrair o DNA total das populações evoluídas e os clones de diferentes cepas e tratamentos. Em seguida, meça as taxas de absorbância em 260:280 e 260:230 nanômetros no espectrofotômetro para determinar a qualidade do DNA.

Em seguida, use um corante de ligação de DNA fluorescente e confirme a concentração do DNA medindo a fluorescência no leitor de placas. Além disso, submeta o DNA à eletroforese em gel de agarose para confirmar que não há degradação do DNA ou contaminação do RNA. Em seguida, realize o sequenciamento profundo de DNA com amostras obtidas de populações inteiras e clones individuais para estudar a base genética da resistência aos antibióticos.

Este estudo é um exemplo dos possíveis resultados do sistema experimental usando três cepas de e coli. Essas cepas são e coli MG1655, MG1655 carregando o gene de resistência no cromossomo MG1655 resA e MG1655 carregando o gene de resistência no plasmídeo multicópia, MG1655 pRESA. Os antibióticos utilizados são ceftazidima e meropenem.

Este painel esquerdo mostra as curvas de sobrevivência sob concentrações crescentes de ceftazidima. A partir do gráfico, fica claro que o subconjunto da população da cepa MG1655 pRESA é capaz de crescer além de 14 dias, mesmo após dobrar a concentração de ceftazidima a cada dia. Pelo contrário, as outras cepas não sobrevivem além de 8 dias quando expostas a concentrações semelhantes de ceftazidima.

No entanto, as mesmas cepas não apresentam diferenças significativas no período de sobrevivência quando expostas a concentrações semelhantes de outro antibiótico, o meropenem. Todas as três cepas sobrevivem apenas entre 6 a 8 dias quando expostas ao meropenem. Isso indica que a presença do gene resA no plasmídeo multicópia potencializa a evolução da resistência contra a ceftazidima, mas não contra o meropeném.

Uma vez dominado, o protocolo experimental completo pode ser realizado em algumas semanas, se feito corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como investigar o papel dos plasmídeos multicópia na evolução das inovações em bactérias.