Name: Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a testar o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos usando E. coli MG1655. Este método utiliza técnicas básicas de biologia molecular para estudar inovações bacterianas.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Salud Carlos III (plano Estatal de eu + D + eu 2013-2016): concede CP15-00012, PI16-00860 e CIBER (0053/CB06/02), co-financiado pelo Fundo Europeu Desenvolvimento Regional ' uma maneira de alcançar a Europa ' (FEDER). JAE é suportado pelo programa de atração de talento do governo da região de Madrid (2016-T1/BIO-1105) e a I + D de Excelencia de espanhol Ministerio de Economía, Industria y competitividade (BIO2017-85056-P). ASM é apoiado por uma bolsa de Servet Miguel do Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012), co-financiado pelo Fundo Social Europeu "Investir no seu futuro" (FSE) e do FEDER.

1. construção do sistema Experimental de codificação de Gene de resistência aos antibióticos
Nota: Aqui MG1655 de Escherichia coli foi usado como a destinatário estirpe do gene de resistência aos antibióticos plasmídeo ou cromossomo-codificado. O gene de resistência aos antibióticos é codificado no cromossomo ou de um plasmídeo multicópia em uma cepa isogénicas caso contrário (Figura 1).
<ol><li>
Inserção do gene da resistência aos antibióticos no λ do fago integração local (attB)20 do cromossomo de MG1655.
	<ol>
<li>Amplifica 500 bp-long regiões em ambos os lados do site cromossômica attB pelo PCR. Utilizam oligonucleotídeos YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') e attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') para a região de homologia esquerdo e attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') e YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') para a pessoa certa. Amplificar o gene de resistência blaTEM-1 usando as primeiras demão Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') e Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). Projetar as primeiras demão com aproximadamente 20 bp (na extremidade 5') de sequência mostra a complementaridade com o fragmento que vai ser fundida a.</li>
		<li>Fusível de regiões de homologia para o produto PCR do gene de resistência a antibióticos (incluindo a sua região promotora) usando isotérmico conjunto21, a 50 ° C por 30 min.</li>
		<li>Electroporate MG1655 células contendo plasmídeo pKOBEG. Nota: pKOBEG é um vetor de termossensível que contém o λ máquinas vermelha, promovendo trocas alélicas baseadas em homologia entre os cromossomos e de produtos PCR22.<ol>
<li>Use 1 µ l do produto da etapa 1.1.223 em 40 µ l de células electrocompetent em cubetas de 2mm a 4 ° C e 2,5 kV. Ressuspender as células em 1 mL de caldo LB + arabinose 0,2% para manter a expressão de λ a maquinaria vermelha.</li>
			<li>Transferir o volume total de um tubo de microcentrífuga e incubar h 2 a 30 ° C (temperatura permissiva para pKOBEG) com intensa agitação (200 rpm em um agitador orbital) para permitir a expressão fenotípica dos marcadores de resistência inserido no cromossomo.</li>
			<li>As células em LB ágar contendo o antibiótico adequado para selecionar para o gene de resistência a antibióticos (ampicilina ou carbenicilina 100 mg/l para blaTEM-1) da placa.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Placa 100 µ l sobre uma placa de Petri e girar para baixo o resto do volume, resuspenda isso em 100 µ l de caldo LB fresco e placa-lo em outra placa de Petri. Incubar durante uma noite a 42 ° C. Nota: Esta temperatura é não-permissivo para a replicação de pKOBEG. As colônias capazes de crescer nestas condições terá perdido pKOBEG e apresentará o gene de resistência integrado no site attB (para simplificar esta tensão será chamada MG1655::resA daqui em diante).</li>
		<li>Teste para a perda de pKOBEG, replicando as colônias de interesse em placas com cloranfenicol (antibiótico contra qual pKOBEG contém um marcador de resistência). Nota: A falta de crescimento nas placas de cloranfenicol na temperatura permissiva de 30 ° c é indicativa da ausência do plasmídeo.</li>
		<li>A fim de verificar a clones, PCR amplificar a construção usando fixadores externos YbhC-externo (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') e YbhB-externo (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), verificar através de eletroforese em gel o tamanho correto do amplicon e sequência a purificado de produto para garantir que a sequência do gene inserido é correta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inserir o gene de resistência aos antibióticos em um plasmídeo multicópia. Nota: Porque plasmídeos com número de cópia muito alta tendem a impor uma grande redução na aptidão de anfitrião bacteriana, recomendamos a utilização de plasmídeos multicópia com uma origem natural de replicação, como p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-tipo de origem de replicação24). Estes plasmídeos geralmente apresentam um número moderado de cópia de cerca 15-20 cópias por célula.<ol>
<li>PCR amplificar o gene de resistência aos antibióticos de escolha (incluindo a região promotora), fosforilar o produto do PCR e ligate-lo ao backbone do plasmídeo PCR amplificados:<ol>
<li>PCR amplificar o gene de resistência aos antibióticos; para blaTEM-1 usar primers Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') e Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').</li>
			<li>Fosforilar o produto purificado usando quinase de polinucleotido T4, seguindo as instruções do fabricante.</li>
			<li>PCR amplificar a espinha dorsal do plasmídeo usando uma alta fidelidade polimerase e oligonucleotides pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') e pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').</li>
			<li>Ligar os dois fragmentos PCR usando T4 ligase seguindo as orientações do fabricante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Electroporate, conforme descrito anteriormente, 40 µ l de células de electrocompetent Escherichia coli DH5-α com um máximo de 1 µ l do produto da ligadura e selecione os antibióticos apropriados para o gene de resistência a antibióticos (ampicilina ou carbenicilina 100 mg/l para blaTEM-1) e a espinha dorsal do plasmídeo. Nota: Completando LB com arabinosa aqui é desnecessário.</li>
		<li>Extraia o plasmídeo utilizando o kit comercial mini-preparação de escolha do leitor:<ol>
<li>Colha 5 mL de uma cultura durante a noite por centrifugação a 12.000 x g, à temperatura ambiente. Ressuspender as células em 250 µ l de solução de ressuspensão e misture bem. Adicionar 250 µ l de solução de Lise e misture bem. Adicione 350 µ l de neutralização e misture bem.</li>
			<li>Transferir o sobrenadante para a coluna de ligação de DNA fornecida com o kit, centrifugar por 1 min e descartar a fluir. Lave duas vezes a coluna com 500 µ l de solução de lavagem, centrifugação durante um minuto e descartando o flowthrough em cada lavagem. Centrifugue a coluna vazia para 1 min adicional remover o tampão de lavagem residual.</li>
			<li>Coloque a coluna em um tubo limpo e adicionar 50 µ l de água ultra-pura para a membrana para Eluir o DNA purificado. Centrífuga para 1-2 min e coletar o fluxo através do que contém o plasmídeo purificado. Sequência de Sanger o gene de interesse no plasmídeo usando primeiras demão de fora a sequência inserida para confirmar que a sequência está correta e que existem sem mutações no gene da resistência antes das experiências de evolução.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uma vez que a sequência é verificada, electroporate o plasmídeo na cepa de Escherichia coli MG1655, conforme descrito acima. Nota: Este produz tensão pRESA/MG1655.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. abordagem de resgate evolutiva para experimentalmente desenvolver resistência aos antibióticos (Figura 1)
<ol><li>Raia para fora as tensões sob estudo em placas LB: MG1655::resA e MG1655/pRESA além da pressão parental suscetível, MG1655. Nota: A pRESA do plasmídeo deve ser estável em MG1655, então não há nenhuma necessidade de adicionar antibióticos para as placas LB. Taxas de mutação em e. coli são suficientemente baixas para que uma vez que a construção é verificada não é necessário verificar a sequência do plasmídeo em cada etapa.</li>
	<li>Preparar as placas de 96 poços com 200 µ l de LB em cada poço e inocular 48 colónias isoladas de cada estirpe em poços independentes (um prato por estirpe). Incube as placas durante a noite a 37 ° C e 200 rpm. Manter um estoque congelado dessas populações do fundador. Nota: Para prevenir e controlar para cultura contaminação cruzada nas placas de 96 poços, use um projeto de placa de xadrez pelo intercalante poços inoculados com bactérias livre médio em toda a placa de 96 poços. Use este design da placa durante a toda evolução experimental.</li>
	<li>Comece o experimento de resgate evolutivo inoculando µ l 2 de cada poço das placas com as populações do fundador em novas placas de 96 poços, com 198 µ l de LB em cada poço com uma sub-inibitória concentração do antibiótico sob estudo. Para a abordagem evolutiva de resgate começam com ¼ ou 1/8 da concentração inibitória mínima (MIC, anteriormente determinado25) do antibiótico em LB para cada uma das três estirpes e dobrar a concentração do antibiótico diariamente. Use esta abordagem para maximizar as chances de populações para adquirir resistência mutações26. Incube as placas a 37 ° C e 200 rpm por 20 h. Nota: Medir o OD da noite das populações fundador. Se existem diferenças significativas no OD entre cepas corrigi o inóculo inicial para iniciar o experimento com o mesmo número de células por poço.</li>
	<li>Todos os dias, medir o OD de cada população após a cultura da noite e realizar uma transferência das culturas, conforme descrito no ponto 2.3, para novas placas de 96 poços, com o dobro da concentração do antibiótico no dia anterior. Incube as placas 20 h a 37 ° C e 200 rpm. Nota: O fator de diluição de 1: 100 produz aproximadamente 6-7 gerações por dia.</li>
	<li>Em paralelo, propaga o controle das populações de cada estirpe nas mesmas condições, conforme descrito em 2.3 e 2.4, mas na ausência de antibióticos. Nota: As populações de controle ajudará a discriminar entre mutações decorrentes devido à presença dos antibióticos e mutações gerais ajudando as bactérias para se adaptar às condições experimentais. Paralelas mutações decorrentes na ausência de antibióticos são susceptíveis de estar ajudando as bactérias para se adaptar às condições experimentais e não relacionada com a resistência aos antibióticos.</li>
	<li>Controlar o número de populações sobreviventes diariamente através da medição da absorvância no comprimento de onda de 600 nm (OD) das culturas usando um leitor de placa. Nota: Valores de densidade óptica inferiores 0.1 indicam a extinção da população. Consulte a Figura 2 para obter um exemplo de curvas de sobrevivência.</li>
	<li>Manter um estoque congelado de todas as populações periodicamente (a cada 3-5 dias).</li>
	<li>Use testes de log-rank [pacote de "sobrevivência" em RStudio (versão 0.99.486)] para determinar diferenças estatísticas na sobrevivência das populações das estirpes diferentes ao longo do tempo sob crescente concentração de antibióticos12. Nota: Esta experiência irá determinar se Plasmideos multicópia potenciam a evolução da resistência aos antibióticos para o antibiótico específico e gene em estudo.</li>
</ol>3. molecular base da evolução da resistência a antibióticos (Figura 1)
<ol><li>Realize extrações de DNA totais de um número representativo de populações e clones em cepas e tratamentos. Incluem as linhagens parentais (MG1655, MG1655::resA e MG1655/pRESA) para ser capaz de detectar as mutações acumulando durante o experimento. Nota: Para obter exemplos de kits de extração de DNA, consulte a tabela de materiais. Cada kit tem diferentes protocolos; Siga as instruções do fabricante.</li>
	<li>Quantificar a concentração e qualidade do DNA. Existem diferentes métodos para determinar a concentração e qualidade do DNA. Determine a qualidade medindo os rácios de absorvância 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm. Use uma tintura fluorescente, de ligação a DNA para medir a concentração de DNA, seguindo as instruções do fabricante, e eletroforese em gel de agarose para confirmar isso, lá não é nenhuma degradação de DNA ou RNA contaminação.</li>
	<li>Sequenciamento de DNA profundo utilização de amostras de populações inteiras e individuais de clones para investigar as bases genéticas da resistência aos antibióticos. Nota: Nós conduzimos todos sequenciamento no centro Wellcome Trust de genética humana, Oxford, UK. Para mais detalhes ver San Millan et al 201612.</li>
	<li>Use o gasoduto de breseq 0.26.127,28 para detectar as mutações, usando o modo de polimorfismo para estimar a frequência das mutações nas populações. Compare os diferentes genomas evoluiu para o genoma dos pais para detectar mutações que se acumularam durante o experimento.</li>
	<li>Comparar as mutações acumuladas em paralelo nas populações com aqueles das populações controle evoluiu sob o aumento da concentração de antibióticos para diferenciar entre mutações ajudando as bactérias para se adaptar a condições experimentais ( aqueles encontrados nas populações de controle) e os envolvidos na resistência aos antibióticos (aqueles encontrados exclusivamente em populações submetidas à pressão antibiótica). Nota: O número de mutações paralelos é geralmente baixo, então diferentes mutações paralelas entre tratamentos podem ser facilmente avaliadas. Aparte as mutações no gene da resistência aos antibióticos sob estudo, é bastante provável que encontre outras mutações associado com resistência aos antibióticos no cromossomo, tais mutações em porinas ou efluxo sistemas12.</li>
	<li>Reconstrua as mutações no gene da resistência aos antibióticos na estirpe parental usando a mesma abordagem, como na seção 1 do presente protocolo. Siga os pontos 1.1 e 1.2 do protocolo para introduzir as novas mutações de fundo parental (usando os genes evoluiu como um modelo PCR). Analise os fenótipos de resistência aos antibióticos destas novas construções para confirmar o papel das mutações.</li>
</ol>

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<li>Jerison, E. R., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+investigations+of+evolutionary+dynamics+and+epistasis+in+microbial+evolution+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).</li>
<li>Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Basis+of+Evolutionary+Innovation+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genet. 12 (5), 1006005(2016).</li>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos um novo protocolo combinando a biologia molecular, evolução experimental e sequenciamento de DNA profundo visa investigar o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos em bactérias. Embora este protocolo combina técnicas de diferentes áreas, todos os métodos necessários para desenvolvê-la são simples e podem ser realizados em um laboratório de microbiologia regular. As etapas mais críticas no protocolo são provavelmente a construção de estirpes de sistema o modelo e a reconstru...

Resistência aos antibióticos em bactérias é um problema de saúde1. Em um nível fundamental, a propagação da resistência aos antibióticos em bactérias patogênicas é um exemplo simples da evolução por seleção natural2,3. Simplificando, o uso de antibióticos gera a seleção de cepas resistentes. Dos principais problemas em biologia evolutiva, portanto, é compreender os fatores que influenciam a capacidade das populações bacterianas de desenvolver resistência aos antibióticos. Experimentos de seleção surgiram como uma ferramenta muito poderosa para investigar a biologia evolutiva das bactérias, e este campo produziu incríveis insights sobre uma vasta gama de problemas evolutivos4,5,6. Na evolução experimental, populações bacterianas, iniciadas a partir de uma única estirpe parental em série são passadas sob condições definidas e rigidamente controladas. Algumas das mutações que ocorrem durante o crescimento destas culturas aumentam a aptidão bacteriana, e estas se propagam através das culturas pela seleção natural. Durante o experimento, as amostras das populações são periodicamente criogenicamente preservadas para criar um registro fóssil congelado não evoluindo. Um grande número de abordagens pode ser usado para caracterizar a evolução de populações bacterianas, mas os dois métodos mais comuns são ensaios de aptidão, que medem a capacidade da bactéria evoluiu para competir contra seus antepassados distantes e o sequenciamento do genoma inteiro, que é usado para identificar as alterações genéticas que a adaptação de carro. Na sequência de um trabalho pioneiro por Richard Lenski e colegas7,8, a abordagem padrão na evolução experimental tem sido a desafiar um número relativamente pequeno de populações replicar (tipicamente < 10) com a adaptação a um novo desafio ambiental, tais como novas fontes de carbono, temperatura ou um fago predatório.
Infecções causadas por bactérias resistentes aos antibióticos tornam-se um grande problema quando a resistência é alta o suficiente para que não é possível aumentar as concentrações de antibiótico para níveis letais nos tecidos do pacientes. Os clínicos são, portanto, interessados no que permite que as bactérias desenvolver resistência a altas doses de antibióticos que estão acima desta concentração de antibiótico limiar, o ponto de interrupção clínica. Como estudar isso experimentalmente? Se um pequeno número de populações bacterianas é desafiado com uma alta dose de antibiótico, como em estilo Lenski experimento e, em seguida, o resultado mais provável é que o antibiótico conduzam todas as populações à extinção. Ao mesmo tempo, se a dose de antibiótico que é usado é baixa, abaixo da concentração inibitória mínima (MIC) da estirpe parental, então é improvável que as populações bacterianas irão evoluir clinicamente relevantes níveis de resistência, especialmente se resistência carrega um grande custo. Um compromisso entre estes dois cenários é a utilização de um "resgate evolutivo" experimento9,10,11. Nesta abordagem, um número muito grande de culturas (normalmente > 40) é desafiado com doses de antibióticos que aumentam ao longo do tempo, normalmente, duplicando a concentração de antibiótica cada dia12. A marca registrada desta experiência é que qualquer população que não evolui maior resistência será conduzida à extinção. A maioria das populações que são desafiadas desta forma serão conduzidas extintas, mas uma pequena minoria persistirá evoluindo a altos níveis de resistência. Neste trabalho, mostramos como esse delineamento pode ser usado para investigar a contribuição do plasmídeo para a evolução da resistência.
As bactérias adquirem resistência a antibióticos através de duas rotas principais, mutações cromossômicas e aquisição de elementos genéticos móveis, principalmente de plasmídeos de13. Plasmídeos desempenham um papel chave na evolução da resistência aos antibióticos, porque eles são capazes de transferir genes de resistência entre as bactérias por conjugação14,15. Plasmídeos podem ser divididos em dois grupos de acordo com seu tamanho e Biologia: "pequeno", com o número elevado de cópia por célula bacteriana e "grandes", com baixa copiar número16,17. O papel de grandes plasmídeos na evolução da resistência aos antibióticos tem sido extensivamente documentado porque eles incluem conjugativo plasmídeos, que são os impulsores-chave de divulgação da resistência e multi resistência entre as bactérias15. Pequenos multicópia plasmídeos também são extremamente comuns em bactérias17,18, e eles muitas vezes codificam para genes de resistência aos antibióticos19. No entanto, o papel de plasmídeos multicópia pequenos na evolução da resistência aos antibióticos tem sido estudado em menor grau.
Em um trabalho recente, propusemos que plasmídeos multicópia poderiam acelerar a evolução dos genes que carregam pelo aumento das taxas de mutação do gene devido ao maior número de cópia gene por célula12. Usando um modelo experimental com uma cepa de Escherichia coli MG1655 e o gene de β-lactamase blaTEM-1 foi demonstrado que os plasmídeos multicópia aceleraram a taxa de aparecimento de mutações de TEM-1 confere resistência para a terceira geração Ceftazidima cefalosporina. Estes resultados indicaram que multicópia plasmídeos podem desempenhar um papel importante na evolução da resistência aos antibióticos.
Aqui, apresentamos uma descrição detalhada do método que desenvolvemos para investigar a evolução multicópia mediada por plasmídeo da resistência aos antibióticos. Este método tem três etapas diferentes: primeira, inserção do gene em estudo em um plasmídeo multicópia ou o cromossomo da bactéria anfitrião. Em segundo lugar, use da evolução experimental (resgate evolutiva) para avaliar o potencial das estirpes diferentes para se adaptar à pressão seletiva. E terceiro, determinando a base molecular subjacente a evolução mediada por plasmídeo usando DNA, sequenciamento e reconstruir as mutações suspeitas individualmente no genótipo parental.
Finalmente, embora o protocolo descrito aqui foi projetado para investigar a evolução da resistência aos antibióticos, pode-se argumentar que este método poderia ser geralmente útil para analisar a evolução das inovações adquirida por mutações em qualquer multicopy gene codificado do plasmídeo.

<table><tbody><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BiorRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de Electroporation</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Determine a qualidade do DNA medindo as proporções de absorbância 260nm/280nm e 260nm/230nm</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Memmert</td><td>UF1060</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora (agitador)</td><td>Cole-Parmer Ltd</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação de eletroforese</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>Eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>Câmara de eletroforese</td><td>BioRad</td><td>1704405</td><td>Eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Biohit</td><td>725020, 725050, 725060, 725070</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td> <td>multicanalBiohit</td><td>728220, 728230, 728240</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas Synergy HTX</td><td>BioTek</td><td>BTS1LF</td><td></td></tr><tr><td>Alças de inoculação</td> Placas de 96 poços <td>Sigma-Aldrich</td><td>I8388</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Falcon</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>BD Difco</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>LB ágar</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F533S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de resctricção</td><td>Fermentas FastDigest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Kit de extração de plasmídeo</td></tr><tr><td>Kit de purificação de DNA genômico Wizard</td><td>Kit de extração de gDNA</td> <td>Promega</td><td>A1120</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kits de Tecidos</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>kit de extração de gDNA</td></tr><tr><td>Cubetas de eletroporação</td> Placas <td>de Petri Z706078</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr> D9054 Placas de 96 poços <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9054</td><td></td></tr><tr><td>ClearLine</td><td></td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>(-80&ordm; </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>249945</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Quantificação do DNA concentartion</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad</td><td>1613100</td><td>Eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>50x tampão TAE</td><td>BioRad</td><td>1610743</td><td>Eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo quinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0031</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0014</td><td></td></tr></tbody></table>

testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicópia plasmídeos são extremamente abundantes em procariontes, mas seu papel na evolução bacteriana continua a ser mal compreendido. Recentemente mostramos que o aumento no número de cópia do gene por célula fornecido por plasmídeos multicópia poderia acelerar a evolução dos genes codificados do plasmídeo. Neste trabalho, apresentamos um sistema experimental para testar a capacidade de plasmídeos multicópia para promover a evolução do gene. Utilizando métodos simples de biologia molecular, construímos um sistema de modelo onde um gene de resistência a antibióticos pode ser inserido em MG1655 de Escherichia coli , o cromossomo ou em um plasmídeo multicópia. Nós usamos uma abordagem de evolução experimental para propagar as diferentes estirpes sob concentrações crescentes de antibióticos e medimos a sobrevivência das populações bacterianas ao longo do tempo. A escolha da molécula do antibiótica e o gene de resistência é para que o gene só pode conferir resistência através da aquisição de mutações. Esta abordagem de "resgate evolutivo" fornece um método simples para testar o potencial de plasmídeos multicópia para promover a aquisição de resistência aos antibióticos. Na próxima etapa do sistema experimental, caracterizam-se as bases moleculares da resistência aos antibióticos. Para identificar as mutações responsável pela aquisição da resistência aos antibióticos, nós usamos a profundo sequenciamento de DNA das amostras obtidas a partir de clones e populações inteiras. Finalmente, para confirmar o papel das mutações no gene em estudo, podemos reconstruí-los em segundo plano parental e teste o fenótipo de resistência das cepas resultantes.

Em nosso trabalho anterior, a evolução do β-lactamase gene blaTEM-1 para conferir resistência para a terceira geração cefalosporina Ceftazidima12 foi investigada. Este gene foi selecionado porque, apesar de TEM-1 não confere resistência à Ceftazidima, mutações no blaTEM-1 podem ampliar o leque de atividade de TEM-1 para hidrolisar cefalosporinas como Ceftazidima29. As mutações em enzimas de resistência...

Aqui nós apresentamos um método experimental para testar o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos.

Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

O objetivo geral deste método experimental é testar o papel dos plasmídeos multicópias na evolução da resistência aos antibióticos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia, como o papel dos plasmídeos multicópias na evolução das inovações bacterianas. A principal vantagem dessa técnica é que ela requer apenas métodos básicos de biologia molecular e um projeto experimental simples.É muito legal. Primeiro, construa a cepa e coli MG1655 que carregará o gene de resistência do anticorpo no cromossomo no fago lambda no lado da equação ATTB. Para fazer isso, o PCR amplifica as 500 regiões paralongas de base em ambos os lados do local ATTB.Em seguida, a PCR amplifica o gene de resistência a antibióticos. Em seguida, use o conjunto isotérmico a 50 graus Celsius por 30 minutos para fundir as regiões de homologia ao produto de PCR. Após a montagem isotérmica, transfira um microlitro do produto para 40 microlitros de células MG1655 eletrocompetentes para uma cubeta de dois milímetros.Em seguida, eletropore as células a 4 graus Celsius e 2,5 quilovolts. Após a eletroporação, transfira as células em um mililitro de caldo LB com 0,2% de arabinose. Em seguida, pipete o caldo LB contendo células para um tubo de microcentrífuga.Agite o tubo intensamente por duas horas a 30 graus Celsius. Após duas horas, coloque 100 microlitros da cultura na placa de ágar LB, suplementada com antibióticos. Em seguida, gire para baixo as células restantes.E ressuspenda o pellet em 100 microlitros de caldo LB fresco. Coloque novamente essas células em outra placa de ágar LB. Em seguida, incube as placas a 42 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, a PCR amplifica os clones para verificar a construção usando os primers externos ybhC extern e ybhB extern. Em seguida, confirme o tamanho do amplicon através da eletroforese da casca de agarose. Paralelamente, realize o sequenciamento de DNA para verificar a sequência do gene inserido.Para construir a cepa para transportar o gene de resistência do anticorpo no plasmídeo multicópia, primeiro a PCR amplifica o gene de resistência a antibióticos blaTEM-1. Após a conclusão da PCR, fosforilar o produto amplificado usando polinucleotídeo quinase T4. Em seguida, use polimerase e oligonucleotídeos de alta fidelidade PBAD FINV e PBAD RINV, para amplificar a estrutura do plasmídeo PBAD por PCR.Em seguida, ligue os dois fragmentos de PCR usando ligase T4. Em seguida, eletropore células alfa DH5 de 40 microlitros com 1 microlitro do produto de ligação. Em seguida, selecione o antibiótico apropriado para o gene de resistência a antibióticos e a estrutura do plasmídeo em placas de ágar.Em seguida, execute a extração de plasmídeo usando um kit de extração de DNA, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, realize o sequenciamento sanger do gene de resistência de interesse para confirmar a ausência de possíveis mutações antes dos experimentos de evolução. Após a verificação da sequência, eletroporar o plasmídeo na cepa de e coli MG1655 para finalmente obter o plasmídeo que carrega a cepa MG1655.As etapas mais críticas neste protocolo são a construção das linhagens dos sistemas modelo e a reconstrução das mutações observadas durante a evolução experimental. Primeiro, risque as cepas de interesse MG1655 nas placas de ágar LB. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio LB em cada poço de uma placa de 96 poços.Em seguida, inocular 48 colônias isoladas de cada cepa em poços individuais da placa. Após a inoculação, incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius num agitador a 200 rotações por minuto. Novamente, inocule dois microlitros da cultura de cada poço com a população fundadora em uma nova placa de 96 poços com 198 microlitros de meio LB em poços individuais.Isso iniciará o experimento de resgate evolutivo. Incubar a placa a 37 graus Celsius em um agitador a 200 rotações por minuto por 20 horas. A cada dia, dobre a concentração do antibiótico em relação ao dia anterior.No dia seguinte, transfira 2 microlitros da respectiva cultura para uma placa fresca de 96 poços e continue todos os dias. Registre a leitura da densidade óptica a 600 nanômetros dos poços individuais em um leitor de placas. Uma etapa crítica do protocolo é a evolução experimental e suas concentrações crescentes de antibióticos.A taxa de variação das concentrações de antibióticos é um dos parâmetros que podem ser modificados para promover a evolução da resistência aos antibióticos. Novamente, incube a placa a 37 graus Celsius em um agitador a 200 rotações por minuto por 20 horas. Em seguida, meça a leitura da densidade óptica em 600 nanômetros para cada população sobrevivente todos os dias no leitor de placas.Congele as populações periodicamente, a cada três a cinco dias. Extrair o DNA total das populações evoluídas e os clones de diferentes cepas e tratamentos. Em seguida, meça as taxas de absorbância em 260:280 e 260:230 nanômetros no espectrofotômetro para determinar a qualidade do DNA.Em seguida, use um corante de ligação de DNA fluorescente e confirme a concentração do DNA medindo a fluorescência no leitor de placas. Além disso, submeta o DNA à eletroforese em gel de agarose para confirmar que não há degradação do DNA ou contaminação do RNA. Em seguida, realize o sequenciamento profundo de DNA com amostras obtidas de populações inteiras e clones individuais para estudar a base genética da resistência aos antibióticos.Este estudo é um exemplo dos possíveis resultados do sistema experimental usando três cepas de e coli. Essas cepas são e coli MG1655, MG1655 carregando o gene de resistência no cromossomo MG1655 resA e MG1655 carregando o gene de resistência no plasmídeo multicópia, MG1655 pRESA. Os antibióticos utilizados são ceftazidima e meropenem.Este painel esquerdo mostra as curvas de sobrevivência sob concentrações crescentes de ceftazidima. A partir do gráfico, fica claro que o subconjunto da população da cepa MG1655 pRESA é capaz de crescer além de 14 dias, mesmo após dobrar a concentração de ceftazidima a cada dia. Pelo contrário, as outras cepas não sobrevivem além de 8 dias quando expostas a concentrações semelhantes de ceftazidima.No entanto, as mesmas cepas não apresentam diferenças significativas no período de sobrevivência quando expostas a concentrações semelhantes de outro antibiótico, o meropenem. Todas as três cepas sobrevivem apenas entre 6 a 8 dias quando expostas ao meropenem. Isso indica que a presença do gene resA no plasmídeo multicópia potencializa a evolução da resistência contra a ceftazidima, mas não contra o meropeném.Uma vez dominado, o protocolo experimental completo pode ser realizado em algumas semanas, se feito corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como investigar o papel dos plasmídeos multicópia na evolução das inovações em bactérias.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

Fonte: Erdogan, F., et al., Ensaios de acasalamento conjugativo para análise específica de sequência de proteínas de transferência envolvidas na conjugação bacteriana. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o procedimento para transferir um plasmídeo F do doador para as células de E. coli receptoras usando um plasmídeo de resgate e selecionando transconjugantes por meio de resistência dupla a antibióticos. O processo inclui a mistura de culturas bacterianas, incubação sem agitação, interrupção...

Transferência de plasmídeo F e seleção dupla de antibióticos em E. coli

Fonte: Lea-Smith, D. J., et al. Geração de mutantes marcados e sem marcadores em espécies de cianobactérias modelo. J. Vis. Exp. (2016)O vídeo demonstra um método para gerar mutantes marcados com antibióticos em cianobactérias. O protocolo começa com a cultura de cianobactérias, seguida pelas etapas de centrifugação e lavagem que preservam os pili da superfície. Um plasmídeo carregando um gene de resistência a antibióticos flanqueado por sequências homólogas é então introduzido. Durante a...

Geração de mutantes marcados com antibióticos em cianobactérias por meio de recombinação homóloga

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Assessing the Role of Gene Copy Number in the Evolution of Bacterial Antibiotic Resistance 

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Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes

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Aprenda a testar o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos usando E. coli MG1655. Este método utiliza técnicas básicas de biologia molecular para estudar inovações bacterianas.

Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos

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