Name: Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprenda a rotular e visualizar cromossomos vivos em células em mitose usando Histone2B-GFP BacMam 2.0 e microscopia confocal de disco rotativo. Este método permite estudar a segregação cromossômica em fibroblastos embrionários de camundongo.

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Gostaríamos de agradecer a Dr. Guo-Chiuan Hung e Dr. Bharatkumar Joshi comentários valiosos que melhorou o manuscrito.

Todos os experimentos realizados nestes estudos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal no centro de pesquisa do Food and Drug Administration (FDA).
1. isolamento e cultura de fibroblastos embrionários de Mouse (MEFs)
<ol><li>Isole os fibroblastos embrionários do rato (MEFs) de uma estirpe de PP2A-B56γ-rato e tipo selvagem littermates pelo protocolo padrão 7,8,9.</li>
	<li>ExpandMEFs para 3 passagens, congelar e armazenar até necessários para experimentos 8.</li>
</ol>2. cultivo Mefs em vidro de tampa septadas 2-bem para viver de imagem
<ol><li>Preparar 500 mL de meios de crescimento do MEF contendo meio Eagle modificado do Dulbecco (DMEM/F12) com 10% de soro Fetal bovino (FBS), 1 antibióticos penicilina/estreptomicina de X, L-glutamina (200 mM) e 1 X não aminoácidos essenciais (timina) em uma garrafa de 500 mL de mídia.</li>
	<li>Descongele os frascos de MEFs congelados do tipo selvagem e PP2A-B56γ-ratos na passagem 3 em banho de água previamente aquecido a 37 ° C.</li>
	<li>Transferir MEFs descongelados para tubos de 15 mL e adicionar lentamente gota a gota 20 mL de DMEM/F12 mídia para os tubos de 15 mL com uma pipeta de 10 mL.</li>
	<li>Transferência MEFs juntamente com 20 mL de DMEM/F12 mídia de crescimento em balões T75 e expandi-los até que as células são 70% de Confluencia. Confluência é estimada usando um microscópio inverso em 4x ou ampliação de 10x.</li>
	<li>Aspirado, o meio de crescimento usando uma pastagem de vidro Pipetar ligado a um sistema de vácuo do capuz, adicionar 3 mL de 0,25% tripsina/EDTA e incubar a 37 ° C por 5 min. Adicione 3 mL de meio de crescimento DMEM/F12 para parar a reação.</li>
	<li>Centrifugar as células em baixa velocidade (300 x g) durante 5 min à temperatura ambiente. Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 mL de DMEM/F12 crescimento médio pré aquecido a 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Enumere as células usando o método de exclusão azul trypan ou outra célula apropriada contando o método 8.</li>
	<li>Sementes de aproximadamente 20.000 MEFs/bem em um vidro de tampa septado 2-bem. Adicionar 200 µ l/poço DMEM/F12 meio de crescimento e permitir que as células anexar incubando-os durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
</ol>3. a sincronização
<ol><li>Sincronizar o MEFs na fase G0/G1 incubando células em meios de crescimento DMEM/F12 contendo 0,1% FBS durante 24 h, para obter um número máximo de células em fase G0/G1. Nota: Embora fome de soro foi usado como um método de preferência, vários outros métodos podem ser usados dependendo da fase mitótica em que células são necessários para ser preso 10.</li>
</ol>4. rotulagem
<ol><li>Prepare a 1,5 mg/mL solução stock de nocodazole em DMSO. Nocodazole prende as células na fase G2/M, inibindo a formação de microtúbulos 10.</li>
	<li>Três dias post sincronização, adicionar 200 µ l de meio de crescimento (com 10% de FCS), 200 ng/mL nocodazole e regente de CL-HB (histona 2B-GFP BacMam 2.0).</li>
	<li>Calcule o regente de CL-HB partículas por célula (PPC) para ser adicionado a células como segue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> Onde o número de células é o número total de células no momento da rotulagem, PPC é o número de partículas por célula, e 1 × 108 é o número de partículas por mL do reagente. Por exemplo, às células de rótulo 20.000 com um PPC de 30 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> Nota: O regente de CL-HB funciona bem com a maioria dos tipos de células entre 10 e 50 PPC. No entanto, PPC 30 funcionou melhor para este estudo.</li>
	<li>MEFs, incube por 18 h a 37 ° C e 5% de CO2. Nota: Para o experimento, visualização dos cromossomos em células mitóticas escapar o ponto de verificação do conjunto de eixo ocorreu 18 h após a detenção do ciclo celular com nocodazole.</li>
</ol>5. visualização dos cromossomos de retardamento
<ol><li>Visualize os fibroblastos embrionários de rato (MEFs) usando um sistema de microscópio confocal de disco girando equipado com uma câmara ambiental e uma imersão de óleo, 63 x da lente objetiva.<ol>
<li>Use o comprimento de onda de excitação de 488 nm e emissão de comprimento de onda de 450 nm para aquisição de imagens do canal GFP.</li>
		<li>Usar um sistema de microscópio confocal de disco giratório com a capacidade dos estágios de varredura motorizadas, Z-Piezo insere, incubação de palco-top e recuperação de fluorescência direta após o clareamento de foto para esta técnica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um dia antes da imagem, a câmara ambiental poder ligar e aquecer a câmara inteira a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>Poder liga para o suporte do microscópio, câmera, unidade de rotação de disco, iluminador, laser de argônio, computador e palco motorizado.</li>
	<li>Deixe o sistema aquecer por 3 min; Inicie o laser de argônio, girando a chave de ignição. Mude o interruptor de alavanca para laser de argônio de "standby" para "executar a laser".</li>
	<li>Lançar o software de aquisição e processamento de dados.</li>
	<li>Iniciar o controlador de CO2 para a incubadora de estágio superior e definir a concentração de CO2 em 5%. Isso deve ser feito antes do início das imagens.</li>
	<li>Remova o vidro tampa septado da incubadora e lugar no palco para visualização. Visualize as células através de uma lente de objetiva de 63 x óleo imersão (NA1.4).</li>
	<li>Ver através das lentes oculares, focar a imagem e identificar uma célula em fase de esgotamento (NEBD) envelope nuclear.</li>
	<li>Inicie o apropriado do laser (488 nm laser de argônio para visualizar Histone2B-GFP).</li>
	<li>Abra a janela de controle de aquisição e definir o tempo de exposição para o canal GFP. Identifica uma célula que está no NEBD.<ol>
<li>Manualmente determinar a parte superior da célula alvo e plano focal de fundo e insira o xyz óptico configurações de corte.</li>
		<li>Observá-lo por 20 min; Se não houver lugar a célula através de divisão celular, pare de aquisição de imagem depois de 20 min e passar para a próxima célula que está em NEBD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aproximadamente 1 h por célula é necessário aos cromossomos de atraso de imagem durante a mitose em PP2A-B56γ-células que escaparam do saco. Para obter dados para um filme, tire fotos cada 3 min. Nota: células de tipo selvagem prendam e não progresso passado NEBD quando tratados com nocodazole.</li>
	<li>Salve imagens no formato de arquivo zvi para posterior análise.</li>
</ol>6. processamento e análise de imagem
Nota: Execute análise usando qualquer software disponível como Axiovision versão 4.8.2 ou hottie versão 8.2 e processamento de imagem tridimensional. Para este estudo o ImageJ software foi usado.
<ol><li>Abra a sequência de imagens. Se as imagens já estão em um formato de pilha, prossiga para a próxima etapa. Se não, combinar todas as imagens relevantes em uma pilha usando ' imagem &gt; pilhas &gt; imagens para pilha ' na barra de menus.</li>
	<li>Realize todos os ajustes conforme necessário para brilho/contraste e níveis.</li>
	<li>Para adicionar um carimbo de hora para o filme:<ol>
<li>Ir para ' imagem &gt; pilhas &gt; etiqueta... ' na barra de menus.</li>
		<li>Selecione o formato apropriado, o valor inicial de tempo e intervalo de tempo entre cada imagem.</li>
		<li>Marque a caixa 'Preview' e ajuste as configurações de local e formato. Pressione 'Okey' para aplicar o carimbo de hora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para adicionar uma barra de escala para o filme:<ol>
<li>Definir a imagem dimensionamento sob ' análise &gt; definir escala ' na barra do menu.</li>
		<li>No campo 'Distância em pixels', digite um número de pixels, onde a distância é conhecida e no campo 'Distância conhecida' digite a distância. Defina a unidade correta de comprimento para a distância, por exemplo, em µm. imprensa 'Okey' para aplicar a escala para a pilha.</li>
		<li>Ir para ' Analyze &gt; Ferramentas &gt; escala bar... ' para adicionar a barra de escala. Definir o tamanho da barra como 'Largura em µm' e ajustar o restante formatação opções conforme apropriado. Marque a caixa 'Rotular todas as fatias' para adicionar a barra de escala para a pilha inteira.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualize o filme clicando no botão peça triangular no canto inferior esquerdo a borda da janela de imagem. Ajustar a taxa de quadro usando ' imagem &gt; pilhas &gt; animação &gt; animação opções na barra de menus.</li>
	<li>Exportar o arquivo de filme, selecionando ' arquivo &gt; salvar como &gt; AVI... ' e selecione a taxa de quadros e compressão.</li>
	<li>Pressione 'Okey' escolher salvar localização e nome de arquivo. Pressione 'Salvar' para salvar o arquivo de filme.</li>
</ol>

<ol><li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+CIN%3A+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li>
<li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+issues%3A+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li>
<li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li>
<li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+and+cancer%3A+cutting+through+the+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li>
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<li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+phosphatase+2A+B56%CE%B3+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP2A-B56%CE%B3+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362(2014).</li>
<li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26904940">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li>
<li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+%28hPrm1%29+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li>
<li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine%3A+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Ciclo celular controle postos de controle que garantem a segregação do cromossomo precisa evitar aneuploidia e célula transformação 1,2,3. No presente estudo, encontramos essa inativação de PP2A-B56γ resultou em um posto de montagem do eixo enfraquecido. Imagem de célula viva nos permitiu observar a segregação de mis cromossômica durante a mitose em MEFs PP2A-B56γ tratados com nocodazole 9.
<p class="...

O seguinte protocolo, descrevemos um método conveniente para visualizar a segregação cromossômica e progressão mitótica durante o ciclo celular em fibroblastos embrionários de rato usando histona 2B-GFP, BacMam 2.0 rotulagem e imagens de células vivas.
Postos de controle do ciclo celular monitorar a segregação do cromossomo e desempenham um papel importante na manutenção da integridade genética das células 1,2,3. Acumulação de cromossomos mis segregados pode levar à aneuploidia, que é uma marca registrada de mais sólido tumores 4. Daí, deteção de retardamento cromossomos pode ser usada como um método para estudar a instabilidade cromossômica.
Fluorescente etiquetado proteínas podem ser usado para visualizar a segregação do cromossomo ao vivo e cromossômicas atraso mas a geração de mCherry-tag ou proteína H2B-GFP com a tag requer conhecimento substancial do gene entrega e biologia molecular 5. Aqui nós descrevemos o uso do reagente de CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, doravante chamado regente CL-HB, por razões de simplicidade. Este reagente pode ser usado imediatamente e, portanto, elimina as preocupações sobre o vetor de qualidade e integridade. Além disso, este reagente não requer o uso de tratamentos potencialmente prejudiciais ou lipídios e produtos químicos de tintura-carregamento. Ao contrário de etiquetas fluorescentes convencionais, o regente de CL-HB manchas independentemente de função (i. e., potencial de membrana). O regente de CL-HB pode ser simplesmente adicionado às células e incubado durante a noite para a expressão da proteína. O regente de CL-HB não replicar em células de mamíferos e pode ser usado em configurações de 1 laboratório nível de biossegurança (BSL). Também, este transfecção transiente pode ser detectada após incubação durante a noite por até 5 dias, tempo suficiente para efectuar análises de celulares mais dinâmicas.
Alternativamente, anormalidades cromossômicas poderiam ser estudadas por várias técnicas como citometria de fluxo, imuno-histoquímica ou fluorescência em situ hybridization (FISH) 6. Citometria de fluxo pode ser usada para estudar aneuploidia, que pode ser medida com base no conteúdo de DNA e a fase das células no ciclo celular. Apesar de citometria de fluxo pode ser usada para medir a aneuploidia, ele não fornece informações sobre segregação cromossômica de mis. Técnicas de peixes e imuno-histoquímica usam sondas fluorescentes para ligar ao DNA ou cromossomos. Enquanto essas técnicas fornecem um instantâneo do status de uma população de células, eles não permitem célula viva imagem faltando, assim, qualquer informação obtida através da visualização spatiotemporal de citocinese em células específicas, seguido por um período de tempo.
Este protocolo foi utilizado para estudar os cromossomas menos desenvolvidas ou cromossômica mis segregação em nocodazole Tratado rato embrionárias fibroblastos (MEFs) isoladas de PP2A-B56γ-ratos. Além de acima de aplicativo, este protocolo fornece uma ferramenta simples para rotular e visualizar a segregação cromossômica em vários tipos de células, que pode ser usado para estudar a regulação do ciclo celular ou instabilidade cromossômica em células tumorais. Além disso, ele pode também ser usado para estudar a instabilidade cromossômica causada por vários tratamentos com drogas ou para estudar os efeitos do gene nocaute resultando em segregação cromossômica de mis.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de aminoácidos não essenciais (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>EMD Millipore</td><td>MX 1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Caixas de armazenamento de frascos criogênicos</td><td>Fisherbrand</td><td>10-500-28</td><td></td></tr><tr><td>Frascos criogênicos</td><td>Corning/costar</td><td>431416</td><td></td></tr><tr><td>Frascos T75</td><td>Cellstar</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>2 vidro de cobertura bem compartimentado</td><td>Nunc</td><td>155380PK</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Cell Profiler</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Cellometer Vision Trio</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Cell Observer Spinning Disk Sistema de microscópio confocal</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td>Zeiss Cell Observer SD</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Termocientífico</td> série <td></td><td>280</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Sanyo soluções comerciais</td><td>MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Classe II Gabinete de segurança biológica</td><td>The Baker Company</td><td>SterilGard</td><td></td></tr><tr><td>Software Axiovision</td><td>Zeiss</td><td>Ver.4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>Ver. 1.51r</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Cromossomos devem ser confiável e uniformemente agrupados em células-filhas durante a divisão celular mitótica. Fidelidade de segregação cromossômica é controlada por vários mecanismos que incluem o Checkpoint do fuso de Assembly (SAC). O SAC é parte de um sistema de realimentação complexo que é responsável pela prevenção de um progresso de célula através de mitose, a menos que todos os cinetócoros cromossômicos tem anexado para eixo de microtúbulos. Guarnição cromossómica e cromossomo anormal segregação é um indicador de disfuncional ciclo celular postos de controle e pode ser usada para medir a estabilidade genômica de dividir células. Desregulamentação do saco pode resultar na transformação de uma célula normal em uma célula maligna através da acumulação de erros durante a segregação cromossômica. Implementação do saco e a formação de complexos o cinetócoro estão fortemente regulamentados pelas interações entre quinase e fosfatase, tais como a proteína fosfatase 2A (PP2A). Este protocolo descreve a imagem de célula viva de retardamento de cromossomos em fibroblastos embrionários de rato isolados de ratos que tinham um nocaute de subunidade reguladora PP2A-B56γ. Esse método supera os defeitos do outros ciclo celular controle técnicas de imagem como citometria de fluxo ou imunocitoquímica que fornecem apenas um instantâneo de um estatuto de citocinese células, em vez de uma visualização dinâmica spatiotemporal de cromossomos durante a mitose.

MEFs de tipo selvagem e PP2A-B56γ-ratos foram semeadas em um vidro de tampa de câmara de 2-poço e permitidos anexar. No dia 2, MEFs foram sincronizados usando 0.1% FBS por 24 h. No dia 3, MEFs na mídia com 200 ng/mL nocodazole e regentwere de PPC CL-HB 30 incubados por 18 h em 37° C e 5% CO2. No dia 4, as células foram fotografadas usando um sistema de microscópio confocal de disco giratório (Figura 1). Viver imagem latente da pilha foi ...

Este protocolo descreve um método fácil e conveniente para rotular e Visualizar ao vivo cromossomos em células mitóticas usando Histone2B-GFP BacMam 2.0 label e um sistema de microscopia confocal de disco girando.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

O objetivo geral deste método é marcar e visualizar cromossomos vivos em células mitóticas usando o marcador Histone 2B-GFP BacMam 2.0 e um sistema de microscopia confocal de disco giratório. Este método pode ser usado para visualizar cromossomos mitóticos em células cultivadas para estudar os efeitos de modificações genéticas ou tratamentos medicamentosos na segregação cromossômica. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um método fácil e conveniente para rotular e visualizar cromossomos vivos em células mitóticas.Demonstrando o procedimento de imagem ao vivo estará o Dr. Kazuyo Takeda, que mantém a Instalação Central de Microscopia e Imagem na Divisão de Produtos Virais do Centro de Avaliação e Pesquisa Biológica da FDA. Os fibroblastos embrionários de camundongos, ou MEFs, usados neste experimento são cultivados em uma lamínula com câmara de dois poços a 37 graus Celsius e 5% de CO2 durante a noite, conforme descrito no protocolo de texto. No dia seguinte, sincronizar os MEFs na fase G0/G1 incubando em meio de crescimento DMEM/F12 contendo 0,1%FBS.No dia da rotulagem, prepare uma solução estoque de nocodazol de 1,5 miligrama por mililitro em DMSO. Uma etapa crítica é calcular a quantidade certa de partículas CL-HB por célula para obter marcação suficiente para visualização cromossômica sem toxicidade para as células. Determinamos anteriormente, por experimentos de titulação, que 30 PPC funcionam melhor.Adicione aos MEFs, 200 microlitros de meio de crescimento com 10% FCS, 200 nanogramas por mililitro de nocodazol e reagente CL-HB a 30 partículas por célula. Incube os MEFs a 37 graus Celsius e 5%CO2 por 18 horas. A visualização dos MEFs é realizada usando um sistema de microscópio confocal de disco giratório equipado com uma câmara ambiental e uma lente objetiva de imersão em óleo 63X.Um dia antes da geração de imagens, ligue a câmara ambiental e aqueça toda a câmara a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, ligue o suporte do microscópio, câmera, unidade de disco giratório, iluminador, laser de argônio, computador e platina motorizada. Depois de deixar o sistema aquecer por três minutos, inicie o laser de argônio ligando a chave de ignição.Mude a chave seletora do laser de argônio do modo de espera para o funcionamento do laser. Inicie o software de aquisição e processamento de dados. Inicie o controlador de CO2 para a incubadora superior do estágio e defina a concentração de CO2 em 5% Remova a lamínula com câmara da incubadora, coloque-a no microscópio stage e selecione a lente objetiva 63X de imersão em óleo.Veja através das lentes oculares, focalize a imagem e identifique uma célula no estágio de quebra do envelope nuclear, ou NEBD. Inicie o laser de argônio de 488 nanômetros para visualizar o Histone 2B-GFP. Abra a janela de controle de aquisição e defina o tempo de exposição para o canal GFP.Identifique uma célula que está em NEBD. Em seguida, determine manualmente o plano focal superior e inferior da célula e insira as configurações de seccionamento óptico XYZ. Observe a célula por 20 minutos.É importante estar ciente de que, como nem todas as células passarão por mitose, o progresso mitótico deve ser monitorado ativamente. Se a célula não prosseguir com a divisão celular após 20 minutos, pare a aquisição da imagem e passe para a próxima célula que está no NEBD. Para obter dados para um filme, tire fotos a cada três minutos.Aproximadamente uma hora por célula é necessária para obter imagens de cromossomos atrasados durante a mitose em células PP2A-B56-gama que escaparam do ponto de verificação de montagem do fuso. Salve imagens em formato de arquivo ZVI para análise posterior. A imagem de células vivas foi usada para visualizar o destino de células individuais à medida que progrediam de NEBD por meio da mitose.Após o tratamento com nocodazol, todas as 21 células do tipo selvagem observadas foram interrompidas na metáfase. Em contraste, das 21 células sem PP2A-B56-gama observadas, 16 foram capazes de passar por mitose após o tratamento com nocodazol. Além disso, a segregação cromossômica anormal foi detectada em 13 desses MEFs.Um exemplo de uma célula PP2A-B56-gama submetida a má segregação cromossômica é mostrado neste videoclipe. Uma vez dominada, essa técnica levará de três a quatro dias, dependendo do tratamento celular antes do protocolo de marcação. É importante lembrar que esta é uma transfecção transitória e os sinais podem ser detectados apenas até cinco dias.Este protocolo pode ser usado para responder a perguntas adicionais relacionadas à regulação do ciclo celular, instabilidade genômica e qualidade dos produtos de terapia celular. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode ser usada para estudar imagens ao vivo de cromossomos em uma ampla variedade de linhagens celulares, como linhagens celulares primárias, células-tronco, neurônios e células T imortalizadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular e visualizar facilmente cromossomos vivos em células mitóticas usando o rótulo Histone 2B-GFP BacMam 2 e um sistema de microscopia confocal de disco giratório.

live-cell-imaging-of-chromosome-segregation-during-mitosis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui nós descrevemos um protocolo básico para a imagem e quantificar o tempo de mitose de células vivas de tecidos de mamíferos cultura após transfecção siRNA.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Fonte: Schumacher, D., e Sogaard-Andersen, L. Imagem de Células Vivas por Fluorescência do Ciclo Celular Vegetativo Completo da Bactéria Social de Crescimento Lento Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o uso de imagens de células vivas para rastrear as origens dos cromossomos marcados com fluorescência durante a divisão celular bacteriana. Ela captura a dinâmica da segregação cromossômica usando microscopia de contraste de fase em time-lapse e fluorescência.

Imagem em lapso de tempo da segregação cromossômica em bactérias marcadas fluorescentemente

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Imagem latente da viver-pilha fornece uma riqueza de informações sobre células únicas ou populações inteiras que é inatingível por célula fixa imagem sozinho. Aqui, viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel são descritos.

A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

Aqui, nós apresentamos a imagem latente da viver-pilha que é um método não-tóxico da microscopia que permita investigadores de estudar o comportamento da proteína e a dinâmica nuclear em pilhas vivas do fermento da fissão durante o mitose e o meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

As divisões celulares podem ser visualizadas em tempo real usando proteínas marcadas com cDNAs e microscopia de lapso temporal. Usando o protocolo apresentado aqui, os usuários podem analisar a dinâmica de sincronismo da divisão celular, o conjunto do eixo mitótico, e o cromossomos e a segregação do cromossoma. Os defeitos nestes eventos que seguem a interferência do RNA (RNAi)-knockdown do gene negociado podem ser avaliados e quantificados.

Uso de células de Drosophila S2 para imagens ao vivo da divisão celular

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.

Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

A microscopia de lapso de tempo é uma ferramenta valiosa para estudar a meiose em leveduras em brotamento. Este protocolo descreve um método que combina sincronização do ciclo celular, microscopia de lapso de tempo e depleção condicional de uma proteína-alvo para demonstrar como estudar a função de uma proteína específica durante a segregação cromossômica meiótica.

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

Este protocolo apresenta um método eficiente para obter imagens do neuroepitélio do olho pupal de Drosophila vivo. Este método compensa o movimento do tecido e a topologia irregular, melhora a visualização dos limites celulares por meio do uso de várias proteínas de junção marcadas com GFP e usa um equipamento de imagem facilmente montado.

Vivo-imaging da Drosophila Pupal Eye

Aprenda a rotular e visualizar cromossomos vivos em células em mitose usando Histone2B-GFP BacMam 2.0 e microscopia confocal de disco rotativo. Este método permite estudar a segregação cromossômica em fibroblastos embrionários de camundongo.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

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