Name: Trombose venosa profunda induzida por estase em camundongos monitorado por ultra-sonografia de alta frequência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Aprenda a induzir trombose venosa profunda em camundongos usando o modelo de estase da veia cava inferior e monitore a formação do trombo por ultrassonografia de alta frequência de forma não invasiva.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por um subsídio do coração e derrame Foundation do Canadá e o Morris e Bella Fainman Family Foundation. Os autores gostaria de agradecer sua ajuda técnica com o sistema de imagens de ultra-som VEVO770 Veronique Michaud.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo institucional Animal conta Comissão de McGill University Montreal, QC, Canadá. Todos os equipamentos necessários é listado na tabela eu.
1. murino (C57BL/6J) protocolo de estase de veia cava inferior
<ol><li>Preparação da cirurgia Nota: Esta é uma cirurgia de sobrevivência e, portanto, uma técnica asséptica adequada precisa ser seguido em todos os momentos. Isso inclui certificando-se de todos os materiais estão na mão, limpeza e esterilização de instrumentos antes e entre uso e designando uma área estéril na superfície de trabalho para todo o material estéril.<ol>
<li>Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e materiais em autoclave. Um esterilizador de grânulo de vidro é suficiente para esterilizar dicas de instrumento entre animais, se mais de um procedimento está sendo feito de uma só vez.</li>
		<li>Anestesia os ratos masculinos C57Bl/6 8-10 semanas com uma mistura de 100% oxigênio e 2,5% de isoflurano. Nota: Ajuste o fluxo de oxigênio e isoflurano conforme necessário.</li>
		<li>Confirme anesthetization beliscando a pata traseira do animal entre os dedos com fórceps. Não responde a pitada indica que o animal é anestesiado.</li>
		<li>Administre analgésico de liberação lenta (buprenorfina) através da injeção subcutânea. Dê uma dose de 1 mg de analgésico por 1 kg de peso corporal (1 mg/kg)-ratos.</li>
		<li>Coloque pomada em ambos os olhos do animal para assegurar sem dessecação da córnea para a duração do procedimento.</li>
		<li>Administre 0,2 - 0,5 mL de isotônicos por 10 g de peso corporal por via subcutânea.</li>
		<li>Fixar o animal para a mesa de cirurgia, usando fita cirúrgica. Coloque o animal em posição supina para expor o abdome. Realizar a cirurgia em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia.</li>
		<li>Remova pelos do abdômen do mouse pela aplicação de um creme para 1-2 min.. Limpe a área abdominal limpar com gaze e água destilada, da remoção do cabelo se necessário.</li>
		<li>Como alternativa, remova os pelos do abdômen por fazer a barba com um barbeador elétrico pequeno.</li>
		<li>Esterilize o abdômen com Baxedin (solução de BP de gluconato de clorexidina) antes de fazer as incisões. Aplica álcool levemente com gaze para evitar a perda de calor excessivo causada pela evaporação do álcool.</li>
	</ol></li>
	<li>Exposição da veia Cava Inferior (VCI)
	<ol>
<li>Usando uma tesoura cirúrgica, realize uma laparotomia para abrir a cavidade abdominal.<ol>
<li>Levantar a pele com pinças na parte inferior do abdome e faça uma incisão vertical paralelo para ambos os lados da linea alba. Façam a primeira incisão à esquerda ou à direita do linea alba, dependendo da destreza do operador. A incisão é feita longe da linha média para auxiliar na ultra-sonografia mais tarde.</li>
			<li>Faça uma incisão segunda, horizontal na parte superior do abdômen. Nota: Sobre a penetração no abdómen, a musculatura deve ser "tendas" e penetrou com tesoura cirúrgica para evitar qualquer dano aos órgãos abdominais.</li>
			<li>Repita as incisões verticais e horizontais sobre a camada de músculo abdominal do animal. Certifique-se que tenda a musculatura durante a penetração no abdômen para não danificar os órgãos abaixo. Cuidado: Levante a pele e músculo longe de intestinos e outros órgãos internos ao fazer incisões para não perfurar os.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dobre a pele e o músculo longe da incisão para expor na cavidade abdominal.</li>
		<li>Aplique gaze umedecida com solução isotônica, para os lados da ferida abertura e exteriorizar os intestinos. Aplica pressão para ambos os lados do abdome para auxiliar a exteriorização do intestino. Use movimentos suaves com um aplicador de ponta de algodão para mover os intestinos. Embeba a gaze na solução isotônica e coloque sobre os intestinos exteriorizados.<ol>
<li>Gaze deve ser pre-umedecido antes da sua colocação no tecido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mudar de lado qualquer gordura peritoneal e expor a veia cava inferior entre as veias renais e ilíacas.</li>
		<li>Fazer uma identificação inicial de ramos laterais óbvio. Um ramo lateral aparecerá como menor, mas significativa veia que Ramos longe a veia cava inferior, entre o renais e ilíacas veias. Vasculatura pode variar muito entre ratos. Os ratos podem ter ramificações laterais presentes em um ou ambos os lados a veia cava inferior.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligadura dos ramos laterais Nota: Se ramos laterais estão presentes, o seguinte procedimento para cada um. Se não estiver presente, avance para o passo 4: colocação de sutura inicial sob a veia cava inferior. O site da ligadura da veia cava inferior será imediatamente distal para a veia renal esquerda, independentemente da presença de ramos laterais.<ol>
<li>Realize dissecção romba de cada lado do ramo lateral. Dissecção romba é o processo de abertura repetidamente fórceps rombudo com pressão suave, a fim de romper a fáscia sem danificar vasos circundantes. Atenção: Evite furar ou danificar a veia.</li>
		<li>Levante o ramo e passar uma seção de sutura de seda 6-0 debaixo da veia. Sempre cuide quando levantar ou mover os vasos. É melhor pegar a gordura ao redor dos vasos, caso contrário existe o risco de danificar a nave.</li>
		<li>Usando a pinça de sutura, fazer uma ligadura cirúrgica em torno da filial de lado usando padrão nó cirúrgico subordinação técnica. Ligadura completa é feita para garantir 100% de oclusão da veia. Use pelo menos três lances subordinante para garantir que a ligadura é segura.</li>
		<li>Repita a etapa 1.3 para qualquer restantes ramos laterais.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção da aorta abdominal da veia cava inferior
	<ol>
<li>Realizar dissecção romba próximo a veia cava inferior imediatamente distal da veia renal esquerda. A aorta abdominal é anexada para a veia cava inferior através da fáscia, portanto, realizar a dissecção romba inicial em torno da veia cava inferior e a aorta abdominal. Atenção: Evite furar ou danificar a veia. Não romper nem perfure a qualquer embarcação. Esta é a parte mais crítica do processo, com o maior risco de lesões nos vasos.</li>
		<li>Continue a aplicar uma pressão suave através de dissecção romba até uma janela transparente é feita entre a aorta e a veia cava inferior.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocação de sutura e ligadura da veia cava inferior
	<ol>
<li>Passe uma seção de sutura de seda 6-0 debaixo da veia cava inferior e aorta abdominal.</li>
		<li>Localize a sutura através da janela criada entre a veia cava inferior e a aorta. Use pinça para puxar a sutura e passe-o entre a aorta abdominal e a veia cava inferior. A sutura através da linha cuidadosamente, tentando não puxar/punção da veia cava inferior e a aorta abdominal.</li>
		<li>Fazer uma ligadura cirúrgica em torno da veia cava inferior com pinça de sutura, assegurando uma total oclusão da veia. Mais uma vez, fazer a ligadura imediatamente distal da veia renal esquerda.</li>
		<li>Fazer três lançamentos de sutura para fixar a ligadura. Nota: Também é possível passar a sutura debaixo da veia cava inferior e a aorta antes de separar os dois como uma opção alternativa. Alternativamente, as suturas de Prolene 7-0 podem ser usadas para ligadura dos ramos colaterais e a veia cava inferior.</li>
	</ol></li>
	<li>Fechamento da ferida e cuidados pós-operatórios
	<ol>
<li>Verifique se que a aorta abdominal foi deixada sem interrupções e que todos os ramos laterais têm sido ligados. A veia cava inferior aparecerá dilatação distal do site da ligadura e sem sangue fluxo será visível.</li>
		<li>Coloque toda a gordura peritoneal e os intestinos de volta na cavidade abdominal.</li>
		<li>Feche a ferida, usando pinça de sutura e sutura seda 6-0. Use uma sutura de execução (simples contínua) e certifique-se de que a sutura não será muito apertada. Uma sutura apertada se romper quando o animal acorda e se move em torno de sua gaiola.<ol>
<li>Como alternativa, use grampos PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon ou aço inoxidável para fechar ferimentos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>A camada do músculo abdominal, primeiro usando sutura adequada, amarrando a técnica de sutura.</li>
		<li>Repita a técnica de sutura para a pele e verifique se o fechamento da ferida é suficiente. Nota: Se usar a mesma agulha de sutura e linha para vários animais, esterilize ambos em etanol a 70% antes de cada utilização.</li>
		<li>Retire o animal do gás anestésico e colocá-los numa incubadora de 34 ° C durante pelo menos 30 minutos.</li>
		<li>Novamente, administre 0,2 - 0,5 mL de isotônicos por 10 g de peso corporal por via subcutânea. Fluidos podem ser dado em dias seguintes para manter o peso corporal pré-operatório, se necessário.</li>
		<li>Monitore o animal até recuperação para garantir a cirurgia bem sucedida e avaliar a saúde geral do animal. Atenção: Espero uma postura encurvada ligeira para um procedimento invasivo como este, mas o animal irá se comportar normalmente logo em operação após 30 minutos.</li>
		<li>Coloque o animal em sua própria gaiola e não colocá-lo com outros animais até que se recuperou totalmente.</li>
		<li>Re-administrar analgésico diariamente para até 48 h de pós-operatório.</li>
		<li>Coloque os alimentos no chão da gaiola para o animal tempo em recuperação. Outros cuidados especiais geralmente não é necessário.</li>
		<li>Examinamos o local da ferida para vermelhidão, inchaço, ou quitação e outros sinais de infecção.</li>
		<li>Se necessário, remova suturas após 7-10 dias.</li>
		<li>Realizar eutanásia imediatamente se não for bem sucedida cirurgia (por exemplo, navio significativos danos e/ou sangue perda) ou animal não melhora com cuidados pós-operatórios. Eutanásia é geralmente realizada no pós-operatório de 48 h. Para mais experiências, use Prolene 7-0 para ligate ramos laterais e a veia cava inferior e suturas de Vicryl 5-0 para fechar a cavidade abdominal.<ol>
<li>Realizar eutanásia por anesthetization do animal em uma indução como descrito anteriormente, exceto em 5% de isoflurano. Isto é seguido por asfixia com 100% CO2 enquanto anestesiados.</li>
			<li>Após a confirmação da eutanásia por asfixia (perda de pulsação e respiração não), realize deslocamento cervical para garantir a completa eutanásia.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. protocolo de ultra-som de alta frequência de
Nota: Este protocolo é uma adaptação da senhora Davis Instituto roedor fenotipagem núcleo SOP para ultra-sonografia de alta frequência. Este protocolo é realizado pós-operatório de 24 h, mas pode ser feito mais cedo, enquanto o animal está respondendo bem à cirurgia. O protocolo pode ser realizado a qualquer momento em ratos saudáveis e muitas vezes é feito para comparar o antes e depois da cirurgia.
<ol><li>
Preparação do Animal
	<ol>
<li>Coloque o animal em uma câmara de indução e anestesiar o animal com uma mistura de 100% oxigênio e 2,5% de isoflurano.</li>
		<li>Ligue o monitor de temperatura e frequência cardíaca. Lâmpada de calor posição acima da tabela para manter o animal aquecido durante o procedimento.</li>
		<li>Remover o animal da câmara de indução e aplique o lubrificante de olho para evitar a dessecação da córnea. Posição do animal na plataforma de análise e fixar o tubo anestésico para boca/nariz do animal.</li>
		<li>Ultrasom quente do gel a 37 ° C e colocar o gel no abdômen do animal. O gel de ultra-som é aquecido através de um sistema de aquecimento de água que as bombas de água através de bobinas que são enrolados em torno da garrafa de gel quente.</li>
		<li>Para a medição de frequência cardíaca (se necessário), colocar gel de eletrodo nos 4 eléctrodos da plataforma de análise e corrigir as patas do animal para os plataforma/eletrodos com esparadrapo. Coloque o animal em posição supina para a imagem latente da veia cava inferior. O sistema de imagem de ultra-som inclui uma plataforma de análise que é aquecida e contém eletrodos para monitorar o animal.</li>
		<li>Para medições de temperatura, colocar o gel de eletrodo no termômetro e introduza no recto do animal.</li>
		<li>Ajustar a lâmpada de calor e isoflurano conforme necessário para garantir que o animal é confortável, tem uma respiração entre 30-70 bpm e é mantido a 37 ° C.</li>
		<li>Se necessário, raspe o abdômen do animal ou remover cabelo com creme depilatório. Candidatar-se 1-2 minutos e limpe com gaze e água destilada. Nota: Muito cabelo pode afetar a qualidade das imagens.</li>
		<li>Coloque gaze debaixo ou ao lado do animal para pegar qualquer gel de ultra-som em excesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagem latente do IVC e trombo
	<ol>
<li>Ativar o software de imagem e iniciar um novo estudo.</li>
		<li>Selecione um scanhead apropriado para a imagem latente. O scanhead usado aqui é para órgãos abdominais (frequência: 35 MHz, distância focal: 12,8 mm).</li>
		<li>Grave informações relevantes sobre o animal. Isto pode incluir o animal ID, sexo, peso, data de nascimento, tensão, etc.</li>
		<li>Baixe o scanhead até é comovente o gel de ultra-som do animal.</li>
		<li>Começa a sonda scanhead para começar a 2-D imagens do animal. Neste modo, imagens são apresentadas como duas dimensões, em vários tons de cinza.</li>
		<li>Localize a veia cava inferior e a aorta abdominal, movendo a plataforma do rato ao longo do x - ou y-avião, enquanto também se move o scanhead através de z-plano. Nota: Sangue vasos aparecerá com branco as paredes e o sangue dentro quase preto. A aorta abdominal será pulsam intensamente e têm paredes mais grossas, enquanto a veia cava inferior será têm paredes mais finas e comprimir/expandir facilmente a imagem da tela quando o scanhead é movido para cima e para baixo. O site da ligadura será aparente, como a veia vai ser dilatada e a parede da veia vai chegar a um ponto. Qualquer trombo formado dentro será sólido sob ecografia e não irá comprimir facilmente, como faz a parede da veia. A veia irá comprimir apenas acima da ligadura, onde não há trombo é formado.</li>
		<li>Após localizar a veia cava inferior e o local da ligadura, centralizá-las no ponto focal do ultra-som, a fim de obter a imagem mais precisa.<ol>
<li>Se a imagem for muito escura para ver claramente, ajustar o gel e remover quaisquer bolhas de ar com um aplicador de ponta de algodão.</li>
			<li>Se necessário, incline o scanhead 45° para a esquerda ou direita e reajustar a plataforma animal para ver a veia claramente. Isso é feito se houver interferência com a scanhead. Nesse cenário, a veia precisa ser fotografada em um ângulo de lado para evitar a sutura. Nota: Interferência de imagem geralmente é causada por manchas escuras da pele no animal, na colocação de sutura de ferida pobre ou bolhas no gel ultrasom.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando o software, tirar fotos de todas as estruturas desejadas e fazer medições usando quaisquer ferramentas de medição. Medições comuns incluem a área de seção transversal de trombo ou largura do local da ligadura.</li>
		<li>Altere o modo de imagem de Doppler da onda de pulso para fazer medições de fluxo de sangue. Este modo permite a geração de imagens de fluxo sanguíneo vascular e a medição da velocidade de fluxo, entre outras variáveis.</li>
		<li>Incline a plataforma de análise para abaixar a extremidade posterior do animal.</li>
		<li>Altere a posição/ângulo do scanhead para que ele entrará em contato com o gel em um ângulo de 30° da extremidade posterior do animal.</li>
		<li>Reposicione o animal plataforma e scanhead. Realoca a veia cava inferior e a ligadura, se necessário.</li>
		<li>Fazer medições de fluxo de sangue ao redor do local da ligadura para confirmar a estase e levar todas as imagens desejadas. Medições comuns do fluxo de sangue incluem a velocidade média, velocidade máxima ou velocidade mediana.</li>
		<li>Salve quaisquer medições ou imagens tiradas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperação de limpeza e animal
	<ol>
<li>Levante o scanhead para posição inicial e reposicionar a plataforma animal para sua posição inicial, também.</li>
		<li>Remova o excesso de gel fora o animal com gaze. Fazer isso com cuidado para que a sutura da ferida não vai ser rompida.</li>
		<li>Retire o termómetro do reto do animal e levar o animal fora da plataforma.</li>
		<li>Coloque o animal em sua gaiola e uma incubadora de 34 ° C.</li>
		<li>Monitore o animal até se recuperar. O procedimento é muito menor e não-invasiva. O animal vai acordar rapidamente. Continue a acompanhar o animal no dia seguinte acordo com o ponto 1.6 do presente protocolo.</li>
		<li>Limpe a plataforma animal com gaze e desinfectante.</li>
		<li>Limpe o scanhead limpo com gaze e água destilada. Atenção: Limpar o scanhead muito delicadamente e apenas com água destilada.</li>
		<li>Repita a etapa 2 para o próximo animal.<ol>
<li>Se feito com todas as disciplinas, verificar que todas as imagens e gravações foram salvos. Em seguida, desligue todos os equipamentos e software.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+diagnosed+deep+vein+thrombosis+in+the+general+population%3A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Vasc+Endovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review.</a> Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).</li>
<li>McGuinness, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+labelled+monocytes+by+experimental+venous+thrombi%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi.</a> Thromb Haemost. 85 (6), 1018-1024 (2001).</li>
<li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+thrombus+to+resolve+in+urokinase-type+plasminogen+activator+gene-knockout+mice%3A+rescue+by+normal+bone+marrow-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells.</a> Circulation. 107 (6), 869-875 (2003).</li>
<li>Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+kinetics+of+99mTc+labeled+recombinant+tissue+plasminogen+activator+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits.</a> Ann Nucl Med. 8 (3), 193-199 (1994).</li>
<li>Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+pig+models+of+venous+thrombosis+mimicking+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease.</a> Thromb Haemost. 89 (2), 256-263 (2003).</li>
<li>Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pulmonary+emboli+and+deep+venous+thrombi+with+99mTc-bitistatin%2C+a+platelet-binding+polypeptide+from+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom.</a> J Nucl Med. 41 (6), 1056-1064 (2000).</li>
<li>Wakefield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+thrombosis+prophylaxis+by+inflammatory+inhibition+without+anticoagulation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy.</a> J Vasc Surg. 31 (2), 309-324 (2000).</li>
<li>Robins, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Gas6+contributes+to+thrombogenesis+and+promotes+tissue+factor+up-regulation+after+vessel+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice.</a> Blood. 121 (4), 692-699 (2013).</li>
<li>Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+synthase+is+upregulated+by+Gas6+during+cancer-induced+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis.</a> Blood. 127 (6), 769-777 (2016).</li>
<li>Laurance, S., et al. <a target="_blank" href="http://atvb.ahajournals.org/content/early/2017/04/27/ATVBAHA.116.308925">Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2017).</li>
<li>Diaz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+of+mouse+models+of+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical review of mouse models of venous thrombosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).</li>
<li>Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+venous+thrombosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of venous thrombosis in mice.</a> J Thromb Haemost. 10 (3), 447-452 (2012).</li>
<li>Brandt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+vein+thrombus+formation+induced+by+flow+reduction+in+mice+is+determined+by+venous+side+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Hemorheol+Microcirc%22%5BJournal%5D)">Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches.</a> Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).</li>
<li>Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferior+vena+cava+branch+variations+in+C57BL%2F6+mice+have+an+impact+on+thrombus+size+in+an+IVC+ligation+%28stasis%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model.</a> J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).</li>
<li>Luther, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Effector-Memory+T+Cell+Activation+Regulates+Post-Thrombotic+Vein+Wall+Inflammation+and+Thrombus+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution.</a> Circ Res. , (2016).</li>
<li>Subramaniam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+contributions+of+complement+factors+to+platelet+activation+and+fibrin+formation+in+venous+thrombus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development.</a> Blood. 129 (16), 2291-2302 (2017).</li>
<li>Diaz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombogenesis+with+continuous+blood+flow+in+the+inferior+vena+cava.+A+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model.</a> Thromb Haemost. 104 (2), 366-375 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Existem várias etapas críticas para a formação de trombo venoso bem sucedida usando o modelo de estase. Indução da trombose venosa profunda é mais desafiador em ratos velhos, devido ao acúmulo de gordura em torno da veia cava inferior e a aorta. Idealmente, os ratos submetidos a este procedimento devem ser de 8 - 10 semanas de idade. Deve ter grande cuidado para não induzir dano endotelial na veia cava inferior durante a dissecção romba e ligadura. Além disso, é crucial para manter o animal em uma incubadora de 34 ° C du...

Tromboembolismo venoso (TEV), que é composto de trombose venosa profunda (TVP) e embolia pulmonar, é a terceira causa principal de morte cardiovascular após infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. É uma condição comum que afeta 1-2% da população, com uma incidência anual de 1 em 5001. VTE pode levar a: 1) morte por embolia pulmonar; 2) pós-trombótica síndrome, caracterizada por dor crônica, edema e ulceração; ou 3) hipertensão pulmonar crônica, resultando em significativo compromisso respiratório crônico. TeV é uma doença multi fatorial e pode resultar de estase do fluxo de sangue, danos nas paredes dos vasos, e/ou Estados de hipercoagulabilidade, devido a uma perturbação do equilíbrio entre a coagulação e os sistemas fibrinolíticos, como tem sido descrito há mais de uma centena de anos por Virchow e é conhecido como Tríade de Virchow.
Porque na maioria dos casos, é impossível obter amostras humanas de TVP, pesquisadores desenvolveram modelos animais experimentais de TVP. Vários animais, incluindo rato2rato3, coelho4, porco5, cão6e primatas não humanos7 têm sido utilizados. Os ratos podem ser geneticamente modificados e são os animais mais frequentemente usados para estudar a TVP. No entanto, como em todos os animais, DVT espontâneo não é observado em ratos. Assim, alterações físicas ou químicas da parede da veia são usadas para criar a trombose em ratos. Anteriormente nós usamos o modelo de cloreto férrico para induzir trombose na veia cava inferior (VCI) de ratos8,9,10. Este modelo tem a vantagem de produzir confiantemente trombos oclusivos em poucos minutos e pode ser usado para investigar o papel das drogas anticoagulantes e plaquetária durante TVP aguda. No entanto, é um procedimento de terminal. Assim, para estudar TVP aguda e crônica, o modelo de estase é mais adequado. Neste modelo, formação de trombos é induzida pela interrupção completa do fluxo de sangue na veia cava inferior, um dos fatores na tríade de Virchow para desenvolvimento de TVP. Este modelo pode ser usado para estudar a formação de TVP e resolução, que é uma vantagem em comparação com o FeCl3 modelo11.
Nós desenvolvemos um método não-invasivo para acompanhar a formação de trombos e resolução ao longo do tempo usando um sistema de ultra-som de alta frequência de micro imagem12. Demonstramos anteriormente que medição da trombose venosa por ultra-som correlaciona-se favoravelmente com trombos obtidos patologicamente. Confirmamos em dois estudos subsequentes que medições obtidas com ultra-som se correlacionam com o peso do trombo e área de trombo quantificada por histoquímica9,10. Mais importante, nós mostraram que o ultra-som de alta frequência pode ser usado para monitorar a formação de trombose venosa profunda em ratos12. Ele também pode ser usado para quantificar a resolução do trombo em uma forma não-invasiva.
Aqui, descrevemos o protocolo que permite a formação de trombos, usando o modelo do rato de trombose induzida em estase e como formação de trombos pode ser monitorizada de forma não-invasiva ao longo do tempo usando o ultra-som de alta frequência.

<table><tbody><tr><td>6-0 perma-mão sutura de seda</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica</td><td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>Sutura amarração fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>pinça romba (reta e curva)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Driver</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>seringas de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26G agulhas</td><td>Becton Dickinson & Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VEVO 770 Sistema de Imagem de Alta Resolução</td><td>Visualsonics</td><td>Não é mais vendido</td><td></td></tr><tr><td>SR Buprenorfina</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>Dado à LDI por Microscópio de</td></tr><tr><td>Cirurgia</td> Veterinária <td>Leica Leica</td><td>M651</td><td></td></tr><tr><td>Pomada ocular Systan</td><td>Alcon</td><td>288/28062-0</td><td></td></tr><tr><td>2x2 gaze estéril</td><td>CDMV</td> <td># 104148</td><td></td></tr><tr><td>ponta de algodão Aplicadores</td><td></td><td></td><td>da</td></tr><tr><td>fita cirúrgica hipoalergênica JGH Transpore</td><td>CDMV</td><td>#7411</td><td></td></tr><tr><td>Gel de ultrassom (Aquasonic-100)</td><td>Dufort & Lavigne</td><td>#AKEN4061</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td> da câmara anestésica <td>dispomada de</td></tr><tr><td>isoflurano</td><td></td><td></td><td></td></tr> JGH<tr><td>, mangueiras e equipamentos de administração</td> Removedor de pêlos <td>Dispomed</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofada dura aquecida com água</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>#HHP-2</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de água do aquecedor Gaymar TP500</td><td>MATVET Inc.</td><td>#R-500305</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de aquecimento infravermelho</td><td>electrimat inc.</td><td>#1R175R-PAR</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura retal do rato prope</td><td>emkaTECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água estéril</td><td></td><td></td><td>da JGH</td></tr></tbody></table>

trombose venosa profunda induzida por estase em camundongos monitorado por ultra-sonografia de alta frequência

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Trombose venosa profunda é uma condição comum que afeta 1-2% da população, com uma incidência anual de 1 em 500. Trombose venosa profunda pode levar à morte por embolia pulmonar ou resultados na síndrome pós-trombótica, caracterizada por dor crônica, edema e ulceração, ou em hipertensão pulmonar crônica, resultando em significativa crônica respiratória compromisso. Esta é a mais comum doença cardiovascular após infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral isquêmico e é um desafio clínico para todas as disciplinas médicas, como isso pode complicar o curso de outras doenças como o câncer, doença sistêmica, cirurgia e grande trauma.
Modelos experimentais são necessários para estudar esses mecanismos. O modelo de estase induz o tamanho do trombo consistente e uma quantidade quantificável de trombo. No entanto, é necessário sistematicamente ligate ramos laterais da veia cava inferior para evitar a variabilidade em tamanhos de trombo e qualquer interpretação de dados errôneos. Nós desenvolvemos uma técnica não-invasiva para medir o tamanho do trombo usando a ultra-sonografia. Usando esta técnica, que podemos avaliar o desenvolvimento do trombo e resolução ao longo do tempo, no mesmo animal. Essa abordagem limita o número de ratos necessários para quantificação da trombose venosa consistente com o princípio da substituição, redução e refinamento de animais na investigação. Nós demonstramos que o peso do trombo e análise histológica de trombo tamanho se correlacionam com medição obtidos com ultra-sonografia. Portanto, o presente estudo descreve como induzir trombose venosa profunda em camundongos, usando o modelo de estase de veia cava inferior e como monitorá-lo usando o ultra-som de alta frequência.

Modelo de trombose venosa estase
No modelo de estase, ratos são anestesiados, e é feita uma incisão para expor a veia cava inferior (VCI). A incisão é feita no lado esquerdo ou direito do mouse em vez de uma laparotomia mediana de uma forma que não iria interferir com a sonda de ultra-som. A pele e os músculos abdominais são dobra para expor a veia cava inferior (Figura 1). Primeiro...

O presente protocolo descreve as etapas para obter a trombose venosa, usando um modelo de estase. Além disso, estamos usando um método não-invasivo para medir a formação de trombos e resolução ao longo do tempo.

Trombose venosa profunda induzida por estase em camundongos monitorado por ultra-sonografia de alta frequência

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Os objetivos gerais deste procedimento são induzir trombose venosa profunda em camundongos usando o modelo de estase da veia cava inferior e monitorar os trombos usando ultrassom de alta frequência. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da trombose venosa sobre como um agente farmacológico, gene ou tipo de célula de interesse pode influenciar a formação ou resolução do trombo. A principal vantagem dessa técnica é que tanto a formação quanto a resolução do trombo podem ser quantificadas de forma não invasiva em camundongos.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos investigando como desdenamicar e monitorar de forma não invasiva a formação de trombos na veia cava inferior de camundongos. Para começar, use uma pinça para levantar a pele abdominal inferior de um camundongo C57 preto de oito a 10 semanas de idade. E use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão vertical paralela a ambos os lados da linha alba a partir da linha média.Faça uma incisão horizontal na parte superior do abdômen. Seguido por incisões repetidas através da camada muscular abdominal. Dobre a pele e o músculo para longe da incisão para expor a cavidade abdominal.E coloque gaze umedecida em ambos os lados da ferida. Aplique uma leve pressão em ambos os lados do abdômen para exteriorizar os intestinos na gaze. E coloque uma segunda camada de gaze umedecida sobre o tecido exteriorizado.Sob um microscópio de dissecação, afaste qualquer gordura peritoneal para expor a veia cava interior, ou VCI, entre as veias renal e ilíaca. E localize os ramos laterais do IVC. Usando uma pinça, disseque suavemente ao redor de cada ramo lateral para romper a fáscia sem danificar os vasos circundantes.Em seguida, segure cuidadosamente a gordura ao redor de um galho para levantar a veia. E passe um pedaço de sutura de seda zero de seis traços sob o vaso. Em seguida, use uma pinça de sutura e uma técnica cirúrgica padrão de amarração de nós para fazer uma ligadura cirúrgica com pelo menos três arremessos ao redor do ramo lateral para ocluir completamente o vaso.Como alternativa, use Hemoclips. Para separar a aorta da VCI, dissecar sem corte ao redor e entre os dois vasos imediatamente distal da veia renal esquerda sem danificar nenhum dos vasos. Quando uma janela clara for criada entre os vasos, passe uma seção de sutura de seda zero de seis traços sob a VCI e a aorta abdominal.E use uma pinça para puxar a sutura pela janela. Usando uma pinça de sutura, ligue a VCI com três lances imediatamente distais à veia renal esquerda para oclusão total do vaso. Confirme se a aorta abdominal foi deixada ininterrupta.E que todos os ramos laterais foram ligados. A VCI aparecerá dilatada distal do local da ligadura. E nenhum fluxo sanguíneo será visível.Retorne a gordura peritoneal e os intestinos para a cavidade abdominal. E use uma pinça de sutura e seis pontos de seda zero para fechar separadamente as camadas de músculo e pele com pontos corridos. Em seguida, coloque o animal em uma incubadora de 34 graus Celsius por pelo menos 30 minutos com monitoramento até a recuperação total.Coloque o frasco de gel de ultrassom através das bobinas de um sistema de aquecimento de água para aquecer o gel a 37 graus Celsius. 24 horas após a ligadura, coloque o animal na plataforma de análise. E aplique o gel do eletrodo nos quatro eletrodos da plataforma.Com o animal em decúbito dorsal, fixe as patas nos eletrodos. E insira um termômetro lubrificado no reto. Coloque gaze ao lado do animal para pegar qualquer excesso de gel de ultrassom.Em seguida, aplique o gel na pele exposta. E imagem da VCI de acordo com os protocolos de imagem de ultrassom padrão. Usando um sistema de microimagem de alta frequência, a VCI pode ser identificada na visão longitudinal antes da ligadura.E a velocidade do fluxo pode ser determinada por imagens Doppler de onda pulsada. Imediatamente após a ligadura, é aparente uma diminuição no fluxo sanguíneo. 24 horas após a ligadura, trombos densos podem ser visualizados no interior da VCI por ultrassonografia.A ultrassonografia também permite quantificar a velocidade do fluxo sanguíneo nos vasos. Uso de Doppler colorido antes, imediatamente após e 24 horas após a ligadura. Uma vez dominado, o trombo pode ser induzido em 30 a 45 minutos, dependendo da presença e do número de ramos laterais, se a técnica for realizada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de levar o seu tempo e ser preciso, mas gentil em seus movimentos, pois é relativamente fácil romper os vasos. Após este procedimento, outros métodos, como análise imunofluorescente, histológica ou de citometria de fluxo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o conteúdo celular dos trombos ou para quantificar proteínas específicas de interesse.

deep-vein-thrombosis-induced-stasis-mice-monitored-high-frequency

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A indução eletrolítico de ativação endotelial na superfície interna da Vena Cava Inferior resultados na formação venosa tipo trombo devido à ativação endotelial e parciais a estagnação do sangue, dois componentes da tríade de Virchow.

Eletrolítico Veia Cava Inferior Model (EIM) de trombose venosa

O rato modelo estase completa de veia cava inferior trombose produz quantidades mensuráveis ​​de tecido veia parede e trombo. Ele tem se mostrado útil para avaliar as interações entre a parede da veia eo trombo oclusivo e na avaliação da progressão de aguda a inflamação crônica.

Modelo do mouse completa de Stasis Inferior Trombose da veia cava

Este vídeo demonstra a técnica de microscopia de fluorescência intravital para estudar a formação de trombos em um modelo de camundongo. O camundongo é injetado com um polissacarídeo marcado com fluoróforo para monitorar a circulação sanguínea. Após a iluminação com uma luz de alta intensidade, a indução fototóxica de uma lesão na microvasculatura da orelha leva à formação de um trombo, que é confirmado pela visualização da obstrução no fluxo sanguíneo.

Microscopia de fluorescência intravital para estudar a formação de trombos microvasculares

Fonte: Kim, D., et. al. Imagem fluorescente combinada de infravermelho próximo e microtomografia computadorizada para visualização direta de tromboêmbolos cerebrais. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a visualização de trombos cerebrais em camundongos usando imagens de microtomografia computadorizada (micro-CT). Um modelo de camundongo tromboso cerebral é injetado com nanopartículas de ouro direcionadas à fibrina que atuam como um agente contrastante. O mouse é colocado na cama de uma...

Visualização de um trombo cerebral em um camundongo usando imagens de microtomografia computadorizada

Descrevemos aqui estenose na veia cava inferior como um modelo murino de trombose venosa profunda. Este modelo recapitula a restrição do fluxo de sangue, um dos principais gatilhos de trombose venosa em seres humanos.

Estenose da veia Cava Inferior: um modelo murino de trombose venosa profunda

Uma fístula aortocaval foi criada puncionando a aorta infra-renal murino através de ambas as paredes na veia inferior oca e foi seguida pela criação de um stenosis em seu saída através da ligadura parcial da veia inferior oca. Este modelo reprodutível pode ser usado para estudar a estenose venosa central.

Modelo murino de estenose venosa central usando fístula Aortocaval com estenose de saída

O objetivo deste manuscrito é apresentar um método baseado em sonografia que permita imagens in vivo do fluxo sanguíneo em artérias cerebrais em camundongos. Demonstramos sua aplicação para determinar alterações nas velocidades de fluxo sanguíneo associadas ao vasospasmo em modelos murinos de hemorragia subaracnóide (SAH).

Análise do Vasospasmo Cerebral em um Modelo Murine de Hemorragia Subaracnóide com Ultrassom Duplex Transcranial de Alta Frequência

O presente protocolo descreve um modelo único e clinicamente relevante de doença arterial periférica que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de sinthase de óxido nítrico para induzir gangrena de copulxina em camundongos FVB. A perfusão II intracardiac é então usada para imagens tridimensionais de alta resolução da vasculatura do footpad.

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

Este protocolo descreve um método para monitorar a progressão das alterações morfológicas ao longo do tempo no útero em um modelo induzível de câncer de endométrio em camundongos usando imagens ultrassonográficas com correlação com alterações macroscópicas e histológicas.

Avaliação Ultrassonográfica Não Invasiva da Progressão do Câncer de Endométrio na Deleção Dirigida por Pax8 dos Supressores Tumorais Arid1a e Pten em Camundongos

Este artigo tem como objetivo apresentar um método otimizado para avaliação da trombose venosa em modelo de câncer em camundongos, utilizando clipes vasculares para a ligadura venosa. A otimização minimiza a variabilidade nas medidas relacionadas à trombose e aumenta a relevância para a trombose venosa associada ao câncer humano.

Ensaio de Trombose Venosa em Modelo de Câncer em Camundongos

Alterações no fluxo sanguíneo ovariano durante o período pré-ovulatório são essenciais para a ovulação. A ultrassonografia com Doppler tem sido usada em humanos e animais de grande porte para avaliar a hemodinâmica e a perfusão ovariana. É apresentado um protocolo de aplicação da ultrassonografia com Doppler para avaliação da hemodinâmica ovariana durante as fases pré-ovulatória e periovulatória em camundongos.

Ultrassonografia Doppler para imagens ao vivo e quantificação da função vascular ovariana em camundongos

Aprenda a induzir trombose venosa profunda em camundongos usando o modelo de estase da veia cava inferior e monitore a formação do trombo por ultrassonografia de alta frequência de forma não invasiva.

Trombose venosa profunda induzida por estase em camundongos monitorado por ultra-sonografia de alta frequência

Explorar mais vídeos