Otimizando o uso de um robô de manipulação líquidos para conduzir a uma alta taxa de transferência para a frente química genética tela de Arabidopsis thaliana
30 de abril de 2018
Realizou-se uma tela de alta taxa de transferência de moléculas pequenas sintéticas sobre espécies a planta modelo Arabidopsis thaliana. Este protocolo, desenvolvido para um robô de manipulação de líquidos, aumenta a velocidade das telas de genética de química para a frente, acelerando a descoberta de novas moléculas pequenas, que afetam a fisiologia vegetal.
O objetivo geral deste protocolo é realizar uma triagem genética química de alto rendimento em mudas de Arabidopsis. Com este método, podemos descobrir de forma eficiente e eficaz novas pequenas moléculas que afetam a fisiologia vegetal. Essas descobertas fornecerão a base para novos estudos sobre processos fisiológicos, como a síntese da parede celular.
A principal vantagem dessa técnica é que dezenas de milhares de pequenas moléculas podem ser rastreadas em um curto período de tempo. Embora este protocolo seja projetado para a espécie de planta modelo Arabidopsis, ele pode ser facilmente adaptado a outros organismos, como insetos, microorganismos ou cultura de células. Tivemos a ideia para este protocolo pela primeira vez quando soubemos que o centro genômico da universidade precisava encontrar um lar para um robô de manuseio de líquidos excedentes.
Nós imediatamente nos oferecemos para tirá-lo de suas mãos. Prepare a biblioteca de diluição e o Posicionador Automatizado de Material de Laboratório Multicanal de Lavagem de Pontas ou ALP conforme descrito no protocolo de texto. Carregue manualmente o Stacker 10s conectado ao carrossel do empilhador.
Nos hotéis A a D, primeiro carregue uma caixa de ponteiras de pipeta AP96 P20 na sala um. Em seguida, carregue quatro placas de fundo em V de 96 poços nas salas dois a cinco com duas placas superiores contendo concentrações de estoque da biblioteca solicitada e as outras duas placas inferiores vazias. Além disso, carregue uma caixa de ponteiras de pipeta AP96 P20 na sala seis.
Carregue quatro placas de fundo em V de 96 poços nas salas sete a nove com as duas placas superiores contendo as concentrações de estoque da biblioteca solicitada e as duas placas inferiores vazias. Configure o deck com 300 mililitros de água no reservatório no P3, um banho de 300 mililitros com etanol a 70% no P7, o Tip Loader ALP e o Multichannel Tip Wash ALP. Usando o software operacional do robô de manuseio de líquidos, apresente as ponteiras de pipeta AP96 P20 do Stacker 10 e mova-as para o Tip Loader ALP.
Apresente a Sala Dois do Hotel A e separe todas as quatro placas de fundo em V de 96 poços no convés, colocando as duas inferiores em P4 e P8 e as duas superiores em P5 e P9. Carregue as pontas da pipeta AP96 P20 com o carregador de ponteiras ALP no cabeçote de 96 canais e 200 microlitros. Aspirar 90 microlitros do reservatório de água de 300 mililitros e dispensar na placa de diluição de fundo em V de 96 poços em P4. Repita o passo para a placa em P8. Misture a placa da biblioteca química em P5 aspirando repetidamente e dispensando 15 microlitros três vezes. Além disso, aspire 10 microlitros da placa de biblioteca química em P5 e dispense 10 microlitros na placa de diluição em P4. Misture as soluções da placa em P4 aspirando e dispensando repetidamente 50 microlitros um total de três vezes.
Uma vez misturadas, limpe as ponteiras da pipeta AP96 P20 aspirando e dispensando 70 microlitros de etanol a 70% de P7 e, em seguida, lave-as no Multichannel Tip Wash ALP aspirando e dispensando um volume de água de 110% quatro vezes. Repita essas etapas para o segundo par de placas em P8 e P9. Ao criar a segunda placa de diluição de fundo em V de 96 poços, empilhe as placas P9, P5, P8 e P4 nessa ordem de baixo para cima. Em seguida, coloque a pilha em um ALP estático vazio.
Use P1, P2, P6, P10, P11, P12 ou P13. Repita essas etapas até que a sala cinco do hotel A esteja vazia e, em seguida, inicie o processo novamente ao chegar à sala seis, movendo as novas ponteiras de pipeta AP96 P20 para o carregador de ponteiras ALP e colocando as ponteiras de pipeta AP96 P20 usadas em uma ALP estática vazia. Repita o procedimento até que a sala 9 do Hotel A esteja vazia.
Para prosseguir para o Hotel B, as placas e pontas no convés devem ser recarregadas no Hotel A. Embora o robô possa trabalhar sem supervisão, é necessário reabastecer o reservatório de água após cada ciclo de diluição. Se o ciclo reiniciar com água insuficiente, o robô aspirará o ar e os produtos químicos não serão diluídos. Reabasteça manualmente o reservatório de água de 300 mililitros.
O programa de computador pode incorporar uma pausa detalhando esta mensagem, exigindo que o usuário pressione Continuar antes de realizar a próxima etapa. Repita as etapas de diluição para os três hotéis restantes. Adicione manualmente as sementes ao meio a uma densidade de 0,1 grama por 100 mililitros.
Essa densidade resulta em uma média de 3 a 10 sementes por poço de uma placa de 96 poços. Coloque manualmente quatro placas de fundo plano de 96 poços nas salas um e dois do Hotel A. Coloque uma caixa de ponteiras de pipeta AP96 P250 no Tip Loader ALP, um reservatório de 300 mililitros preenchido com a mistura meio-semente em P3 e um reservatório de 300 mililitros preenchido com 70% de etanol em P7. Usando o software operacional, apresente os Quartos Um e Dois no Hotel A e separe as pilhas de quatro pratos. Coloque uma placa em cada um dos ALPs estáticos vazios e, em seguida, carregue as pontas da pipeta AP96 P250 no cabeçote de 96 canais e 200 microlitros.
Aspire 90 microlitros do reservatório de sementes de 300 mililitros em P3 e distribua-o na primeira placa de fundo plano de 96 poços. Repita este processo até que todas as oito placas contenham a mistura meio-semente. Limpe as pontas da pipeta AP96 P250 aspirando e dispensando 70 microlitros do reservatório de 300 mililitros cheio de etanol a 70% em P7. Lave as pontas no Multichannel Tip Wash ALP aspirando e dispensando um volume de água de 110% quatro vezes e, em seguida, descarregue as pontas em TL1.
Por fim, junte os pratos com a mão. Carregue manualmente uma caixa de ponteiras de pipeta AP96 P250 na Sala Um do Hotel A. Além disso, carregue duas placas de biblioteca de diluição de fundo em V de 96 poços nas Salas Dois, Quatro, Seis e Oito. Carregue duas placas de peneiramento de fundo plano de 96 poços nas salas três, cinco, sete e nove.
Usando o software operacional, configure o deck para conter um reservatório de lavagem de 300 mililitros de etanol a 70% em P7. O reservatório de sementes médias pode ser deixado no convés em P3. Além disso, ligue a unidade do console por meio da conexão do controlador do dispositivo para circular a água pelo Multichannel Tip Wash ALP. Isso será desligado automaticamente no final do protocolo. Apresente a caixa de ponteiras de pipeta AP96 P250 do Hotel A e mova-a para o carregador de ponteiras ALP.
Em seguida, apresente as placas de biblioteca de diluição de fundo em V de 96 poços da Sala Dois do Hotel A para o convés. Coloque uma placa no ALP estático P4 e uma placa no P8. Em seguida, apresente as placas de triagem de fundo plano de 96 poços da Sala Três do Hotel A para o convés. Coloque uma placa no ALP estático P5 e outra no P9. Carregue as pontas da pipeta AP96 P250 com o Tip Loader ALP no cabeçote de 96 canais e 200 microlitros.
Misture a placa de diluição de fundo em V de 96 poços em P4 aspirando e dispensando 50 microlitros três vezes. Em seguida, aspire 10 microlitros desta placa e dispense na placa de triagem de fundo plano de 96 poços em P5. Misture as soluções na placa em P5 aspirando e dispensando 50 microlitros três vezes. Limpe as pontas da pipeta AP96 P250 com etanol aspirando e dispensando 70 microlitros de etanol a 70% do reservatório em P7. Em seguida, lave as pontas no Multichannel Tip Wash ALP aspirando e dispensando um volume de 110% de água quatro vezes.
Repita estas etapas para a segunda placa de biblioteca de diluição de fundo em V de 96 poços e a placa de peneiramento de fundo plano de 96 poços. Empilhe as duas placas de biblioteca de diluição de fundo em V de 96 poços juntas e as duas placas de peneiramento de fundo plano de 96 poços juntas. Mova as placas para os ALPs estáticos.
Em seguida, repita o processo três vezes, adicionando produtos químicos diluídos às placas de peneiramento um total de oito vezes. Por fim, verifique o número de sementes em cada poço das placas de peneiramento por meio de confirmação visual. Suplementar os poços com menos de três sementes por adição de sementes esterilizadas e vernalizadas.
É fundamental garantir que o meio em que as mudas estão crescendo não seque, pois isso resultará em má germinação. As placas contendo mudas devem ser mantidas em alta umidade ou armazenadas em recipientes resistentes à dessecação. Incube as placas de peneiramento de fundo plano de 96 poços por quatro dias em uma câmara ambiental a 22 graus Celsius em um ciclo claro/escuro de 16/8 em um recipiente à prova de dessecação.
Visualize as placas de triagem de fundo plano de 96 poços sob um microscópio de dissecação e registre todos os fenótipos aberrantes para uma investigação mais aprofundada. Exemplos de fenótipos normais e aberrantes são ausência de anormalidades morfológicas visíveis, pêlos radiculares castanhos, raiz atrofiada, raiz severamente atrofiada, mucilagem verde branqueada, germinação incompleta e ausência de germinação. Os fenótipos visíveis por porcentagem são exibidos em um gráfico de pizza.
As plântulas exibiram anormalidades na morfologia radicular, pigmentação, pêlos radiculares e germinação. Também está incluída uma variedade de outras, que incluem a produção de mucilagem verde. Uma vez dominada, essa técnica pode aumentar muito a eficiência e a precisão de grandes telas genéticas químicas diretas.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de esterilizar e vernalizar as sementes, reabastecer o reservatório de água durante as etapas de diluição, garantir que as amostras sejam armazenadas em recipientes resistentes à dessecação e que todas as imagens sejam feitas em placas de fundo plano. Dependendo do processo fisiológico que você está interessado em investigar, essa triagem inicial pode ser seguida por ensaios adicionais para ajudar a determinar o modo de ação de cada produto químico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar um robô de manuseio de líquidos para melhorar a eficiência e a precisão de uma triagem genética química.
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Visão Geral
Este protocolo descreve uma triagem de alta produtividade em genética química direta projetada para plântulas de Arabidopsis. Permite a descoberta rápida de novas moléculas pequenas que influenciam a fisiologia vegetal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Fisiologia Vegetal
- Genética Química
- Triagem de Alta Produtividade
Antecedentes
- Arabidopsis thaliana é um organismo modelo na pesquisa vegetal.
- A triagem de alto rendimento acelera a identificação de compostos biologicamente ativos.
- Este protocolo utiliza um robô de manipulação líquida para maior eficiência.
- Descobertas podem levar a insights sobre processos fisiológicos como a síntese da parede celular.
Objetivo do Estudo
- Realizar uma triagem de alto rendimento para moléculas pequenas que afetem a fisiologia vegetal.
- Fornecer uma base para estudos fisiológicos adicionais.
- Adaptar o protocolo para uso em outros organismos.
Métodos Utilizados
- Telação de alto rendimento de moléculas pequenas sintéticas.
- Uso de um robô de manipulação líquida para automação.
- Telação de dezenas de milhares de compostos em um curto espaço de tempo.
- Aplicação dos resultados a diversos sistemas biológicos.
Resultados Principais
- Identificação de novas moléculas pequenas que afetam a fisiologia vegetal.
- Eficiência demonstrada do protocolo na triagem de grandes bibliotecas de compostos.
- Potencial de adaptação a outros contextos biológicos.
- Alicerce estabelecido para pesquisas futuras sobre processos fisiológicos específicos.
Conclusões
- O protocolo acelera significativamente a descoberta de compostos biologicamente ativos.
- Oferece uma abordagem versátil aplicável a diversos organismos.
- Estudos futuros podem se basear nos achados para explorar mais a fisiologia vegetal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A triagem de alta produtividade em genética química direta permite a investigação rápida do espaço fenotípico em organismos modelo, apoiando a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pipelines de descoberta. A automação da entrega de compostos por meio de robótica de manipulação líquida aumenta a produtividade, reprodutibilidade e escalabilidade, ao mesmo tempo que reduz erros manuais, abordando diretamente o desafio da baixa taxa de acertos em triagens de bibliotecas sintéticas. Esta abordagem acelera a identificação de compostos líderes ao gerar leituras fenotípicas quantitativas e reprodutíveis que orientam decisões de avanço ou interrupção de projetos e a triagem de portfólios na pesquisa pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação sistemática de vias biológicas por meio da descoberta de moléculas de pequeno porte orientada por fenótipos, apoiando a testagem de hipóteses sobre alvos e a validação funcional.
- Valor Operacional: Reduz as taxas de falsos negativos ao triar bibliotecas extensas de compostos de forma eficiente, aumentando a confiança no engajamento do alvo e no mecanismo de ação.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera dados fenotípicos quantitativos e dependentes da dose, adequados para padronização de ensaios e confirmação de hits em telas secundárias.
- Valor Operacional: Garante diluição e transferência reprodutíveis de compostos em formatos de 96 poços, minimizando a variabilidade entre poços e aumentando a confiabilidade dos dados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece um sistema relevante para a doença para avaliar os efeitos de compostos em processos fisiológicos conservados, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Facilita a transição contínua do triagem primária para ensaios de acompanhamento mecanicista por meio de formatos padronizados de placas e saídas compatíveis com armazenamento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir triagens fenotípicas de alto conteúdo que orientam a identificação de compostos líderes e decisões de avanço pré-clínico por meio de avaliação reprodutível e escalonável de compostos.
- Biologia de Descoberta: Apoia triagens sem hipóteses prévias para identificar novos compostos bioativos que afetam a fisiologia vegetal, fornecendo uma base para a elucidação de vias e desmistificação de alvos.
- Triagem: Fornece placas prontas para ensaio com concentrações consistentes de compostos e densidades de plântulas, permitindo avaliação confiável de compostos em grandes bibliotecas.
- Análise: Gera dados fenotípicos quantificáveis (por exemplo, comprimento da raiz, coloração, taxas de germinação) que apoiam análise estatística e priorização de hits.
- Pesquisa Translacional: Estabelece continuidade do descobrimento à validação pré-clínica, associando hits fenotípicos a processos fisiológicos como a síntese da parede celular.
- Reutilização Empresarial: Configurável para múltiplos sistemas de organismos, posicionando o fluxo de trabalho de manipulação líquida como uma plataforma reutilizável em diversas campanhas de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio de triagem fenotípica em larga escala.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de manipulação automatizada de líquidos, minimizando a variabilidade dependente do técnico.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a triagem rápida de dezenas de milhares de compostos, reduzindo o tempo até a identificação de hits e a taxa de desistência nas fases iniciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao gerar dados fenotípicos de alto volume e reprodutíveis para decisões informadas de avanço.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em programação de robôs de manipulação líquida, empilhamento de placas e gerenciamento de ponteiras para garantir a precisão adequada de diluição e transferência.
- Depende do acesso a um robô de manipulação líquida multicanal de bancada com software compatível e posicionadores automatizados de material de laboratório (ALPs) para lavagem e carregamento de ponteiras.
- Necessita padronização entre equipes no preparo de sementes, formulação de meio e condições de incubação para manter a consistência do ensaio entre as execuções.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o protocolo para sistemas não-Arabidopsis, incluindo densidade de sementes, composição do meio e otimização da leitura fenotípica.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de reabastecimento manual de reservatórios durante ciclos de diluição e confirmação visual do fenótipo por microscopia, o que pode limitar a automação completa.
