Induzida por punção neovascularização de Iris como um modelo do rato da Rubeosis Iridis

O objetivo geral deste procedimento é induzir a vasculatura da íris, o que permite a visualização direta in vivo dos processos angiogênicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oftalmologia, particularmente em doenças neovasculares. A principal vantagem dessa técnica é que ela utiliza camundongos albinos para permitir direcionar a visualização dos vasos sanguíneos ao vivo.

Através deste método pode dar uma visão sobre a doença neovascular ocular. Também pode ser aplicado como um modelo geral de angiogênese, como testes para novas terapias angiogênicas. A demonstração visual desse método é crítica, pois a dissecção da íris é desafiadora devido ao pequeno tamanho do olho do camundongo.

Com a prática, no entanto, pode ser dominado. Depois de anestesiar um camundongo P12.5 e prepará-lo para o procedimento, coloque-o na posição de decúbito lateral sob um estereoscópio e confirme se a máscara está bem posicionada. O olho deve preencher o campo de visão.

O foco claro do olho é imperativo. Em seguida, usando uma pequena pinça de amarração na mão não dominante, projete cuidadosamente o olho aplicando pressão para baixo nas pálpebras, dorsal e ventral ao olho. Manter um aperto firme na pálpebra ajuda.

Antes de prosseguir, documente a vasculatura com foto em 40X. Em seguida, use o estereoscópio para localizar o limbo da córnea. O limbo de camundongos albinos BALB/c pode ser facilmente identificado como o plexo vascular circular posterior à córnea.

Agora, na mão dominante, segure uma agulha chanfrada de calibre 30 e use-a para realizar uma pequena punção uveal perto do limite límbico posterior da úvea entre o corpo ciliar e a ora serrata. Faça a punção usando apenas a ponta da agulha e não mais do que metade do chanfro. Evite romper a lente.

A punção deve ser autovedante, mas ainda permitir a injeção intraocular de substâncias do estudo através da ferida. Em seguida, faça uma segunda punção uveal no local oposto do olho. Otimize as punções para ficarem nas posições mais dorsal e ventral.

Repetir as punções uveais nas mesmas duas posições a cada quatro dias até P24.5. E antes de repetir a punção, sempre verifique se há catarata traumática. Depois de enuclear o olho e fixá-lo conforme descrito no protocolo de texto, remova a solução fixadora e lave o olho três vezes com PBS fresco.

Em seguida, coloque o olho em uma superfície lisa e seca com a câmara anterior para cima. Em seguida, insira uma agulha chanfrada de calibre 30 posterior ao limbo para fazer um ponto de entrada. Em seguida, prenda o segmento anterior com uma pequena pinça de amarração e use uma tesoura reta Clayman-Vannas para cortar ao redor do limbo enquanto gira o olho.

O uso de cortes parciais pode facilitar o processo. Quando concluído, o segmento posterior do olho deve ser liberado. Em seguida, posicione o segmento anterior para baixo para expor a lente.

Remova a lente com cuidado, agarrando-a com uma pequena pinça e puxando para cima. Agora, posicione o segmento anterior com a córnea voltada para baixo e com o corte perpendicular ao campo de visão. Em seguida, agarre suavemente o tecido posterior ao corpo ciliar usando uma pequena pinça de amarração na mão não dominante.

Tesoura reta Clayman-Vannas para aparar logo anterior ao corpo ciliar com o objetivo de remover a malha trabecular e isolar a íris. A íris deve então se mover dentro da córnea. Em seguida, use uma pequena pinça de amarração para segurar a córnea e transfira cuidadosamente a ocular anterior para uma placa de 96 poços contendo 200 microlitros de PBS.

Mantenha o aperto na córnea e continue dissecando a íris lavando o tecido com PBS. Se necessário, uma agulha de calibre 30 pode ser usada para ajudar a deslocar a íris. Agora, remova a córnea usando a pequena pinça de amarração.

A íris isolada pode então ser armazenada em PBS a quatro graus Celsius temporariamente até que seja experimentada. Camundongos albinos BALB/c em P12.5 foram submetidos a punções uveais repetidas a cada quatro dias até P24.5, conforme descrito. Devido à transparência da córnea e à deficiência de melanina de camundongos BALB/c, a vasculatura da íris é facilmente visível em filhotes P16.5 e se intensifica ao longo da duração do protocolo.

Em P27.5, os camundongos foram sacrificados e suas íris foram cuidadosamente dissecadas. As punções induziram uma resposta vascular da íris, acionando o sistema de cicatrização de feridas. A imuno-histoquímica foi realizada contra PECAM1.

A coloração resultante mostrou um aumento na vasculatura geral em íris de olhos perfurados em comparação com os controles. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir a angiogênese da íris e isolar com sucesso a íris do rato. Após este procedimento, outros métodos como o QBCR podem ser realizados para responder a questões moleculares e celulares adicionais, como testar a eficácia de substâncias pró-angiogênicas ou antiangiogênicas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem doenças neovasculares por métodos in vivo e não invasivos, usando pequenos roedores como modelo.