Um ensaio de Microarray da proteína para determinação sorológica do antígeno-específicas anticorpo respostas seguintes Clostridium difficile infecção

Este método pode ajudar a otimizar e selecionar imunoterapias clinicamente úteis para a infecção por Clostridium difficile de maneira específica do paciente e elucidar as respostas imunes humanas ao Clostridium difficile. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a quantificação precisa e simultânea de respostas de anticorpos multiisotipos e específicos da cepa aos antígenos de C. difficile. Geralmente, os indivíduos que são novos nesse método terão dificuldades porque é necessária experiência para estabelecer e otimizar um painel de antígenos altamente purificados e configurar a plataforma tecnológica.

A demonstração visual desse método é crítica, pois os tipos de lista metodológica envolvidos na preparação da placa de micro-ondas, impressão de matrizes, um procedimento seguro e a análise de dados exigem atenção aos detalhes. A demonstração de parte do procedimento será feita por Sam Greenwood, um técnico do meu laboratório. Para começar, dilua os antígenos de Clostridium difficile e o tampão de impressão até a concentração ideal.

Em seguida, transfira 10 microlitros de solução de antígeno para uma placa de 384 poços. Cubra a placa com um selo de placa e centrifugue a 300 vezes a gravidade por cinco minutos em temperatura ambiente. Para impressão de microarray, use um queimador de gás portátil para aquecer o PIN de silício três vezes por dois segundos cada.

Em seguida, enxágue o pino de silicone em água limpa três vezes por três segundos cada. Coloque a placa de microarray no cartucho de carregamento de um arrayer. Ejete a bandeja e, em seguida, coloque as lâminas de amino silano na bandeja deslizante e pressione o botão OK para ligar o aspirador.

Certifique-se de que todos os slides estejam protegidos e clique em OK. Retorne a bandeja à origem e feche a tampa. Em seguida, inicie o programa apropriado e vá para Arquivo, Parâmetros de microarray e Abrir. Selecione o arquivo Clostridium difficile para imprimir todos os antígenos em quadruplicado.

Nessa janela, abra a guia Origem para indicar o armazenamento de amostras e a guia Destino para inserir detalhes do microarray. Em seguida, abra a guia Opções para selecionar a ferramenta de lavagem. Na guia Geral de Preferências de Execução, na barra de ferramentas do pacote de aplicativos TAS, selecione Lavar no início da execução e Lavar no final da execução.

Abra a guia Clima e defina o nível de umidade entre 55 a 60%Agora inicie a execução e verifique periodicamente o arrayer para garantir o funcionamento adequado. Após a impressão, coloque cuidadosamente as lâminas impressas em um suporte de lâminas com 16 câmaras de vários poços. Em seguida, adicione 100 microlitros de 5% BSAT a cada bloco.

Cubra as lâminas e incube por uma hora em temperatura ambiente com agitação. Use 120 microlitros de PBST para lavar cada bloco cinco vezes por um minuto cada com agitação. Em seguida, descongele as amostras de soro obtidas de pacientes infectados por C difficile e controles saudáveis no gelo por 20 minutos.

Adicione o diluente de anticorpos comercialmente disponível ao bloco mestre e, em seguida, adicione amostras ao bloco mestre e misture. Descarte o tampão de lavagem e adicione 100 microlitros de cada amostra diluída aos blocos experimentais. Para o bloco de controle negativo, adicione 100 microlitros apenas do diluente de anticorpos.

Em seguida, incube as lâminas por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, use 120 microlitros de PBST para lavar cada bloco cinco vezes por três minutos cada com agitação. Em seguida, adicione 100 microlitros de anticorpo anti-humano de cabra biotinilado diluído em diluente de anticorpos a cada bloco.

Cubra as lâminas e incube por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave. Use 120 microlitros de PBST para lavar cada bloco cinco vezes por três minutos cada com agitação. Em seguida, adicione 100 microlitros de conjugado de estreptavidina SY5 diluído em 5% BSAT, na proporção de um a dois mil para cada bloco.

Cubra as lâminas com papel alumínio e incube por 15 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Lave as lâminas primeiro com 120 microlitros de PBST cinco vezes por um minuto cada e, em seguida, lave-as mais duas vezes por um minuto cada com PBS. Para secar as lâminas, gire-as por cinco minutos a 300 vezes a gravidade.

Ligue o scanner a laser 30 minutos antes da digitalização, para permitir que ele aqueça. Em seguida, coloque a lâmina no scanner com a superfície impressa voltada para cima até que a luz da placa fique verde sólida. Em seguida, pressione o botão Configurações.

Na primeira guia, certifique-se de que a rolagem automática e o código de barras estejam desmarcados. Em seguida, defina o tamanho do pixel como 10, o modo de digitalização como médio, a aquisição apenas para 635, o modo de aquisição para manual, o ganho para 20 e a potência para baixa. Na segunda guia, certifique-se de que o tipo de slide não esteja rotulado.

Na terceira guia, defina a configuração Foco como Foco automático. Pressione o botão de importação de grade para selecionar a lista de matrizes apropriada associada à imagem digitalizada. Em seguida, pressione o botão de localização automática para alinhar a grade aos pontos no slide.

Por fim, pressione o botão Processo de quantificação para medir a intensidade de fluorescência de cada ponto. Em seguida, salve os resultados em um formato apropriado para análise posterior. Neste protocolo, um microarray de proteínas é comparado com ELISA para avaliar a reprodutibilidade entre essas duas técnicas.

A análise do coeficiente de correlação de Spearman mostra concordância significativa entre o microarray e o ELISA para detectar os níveis de IgG, antitoxina A e antitoxina B em amostras de soro. O ensaio de introdução e a reprodutibilidade interensaio do microarray de proteínas são calculados usando as amostras de soro de sete pacientes. As amostras analisadas em duas lâminas de matriz diferentes contra os antígenos Toxina A, Toxina B, SLP001, SLP002, SLP027, Toxina B da Toxina B produzindo apenas a cepa CCUG e pCDTb revelam boa reprodutibilidade.

Um microarray de proteína é realizado para detectar uma resposta de anticorpos específica do isótipo contra as toxinas de Clostridium difficile. As amostras de soro de pacientes e indivíduos saudáveis são usadas para detectar os níveis de IgG e IgA contra a Toxina A, Toxina B, Toxina B de uma cepa que expressa apenas a Toxina B de Clostridium difficile e a forma precursora de um fragmento B da toxina binária. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete horas.

O experimento de controle de qualidade, diferentes parâmetros, como seleção de química de superfície apropriada, tampões de impressão, tampões de bloqueio e diluições de amostras de soro e anticorpos secundários, devem ser avaliados antes de executar as amostras. A impressão de uma matriz de alta qualidade requer um bom entendimento da matriz ou do software para ajustar a impressão dos parâmetros de acordo com o protocolo experimental. É crucial manter o desempenho ideal do arrayer e um ambiente livre de poeira durante todo o experimento.

Essa técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo da imunologia e biologia molecular, em termos de caracterização de respostas imunes humorais à infecção e descoberta de antígenos sorodiagnósticos. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de sangue infectadas e toxinas bacterianas pode ser perigoso. Em geral, no laboratório, a segurança e as precauções padrão devem sempre ser levadas em consideração ao realizar este procedimento.