Isolamento de células endoteliais humanas do cólon Normal e Carcinoma colorrectal - um protocolo melhorado

O objetivo geral deste protocolo de isolamento celular é obter células endoteliais puras e viáveis de pacientes que sofrem de carcinoma colorretal, tanto do tumor quanto do cólon normal correspondente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia tumoral e da angiogênese, como estimar e analisar o impacto do sistema de vasos sanguíneos na tumorigênese colorretal. A principal vantagem dessa técnica é que pode-se ter uma taxa de sucesso relativamente alta na obtenção de células endoteliais humanas puras e viáveis de pacientes com carcinoma colorretal.

Para obter a amostra de tecido de pacientes com carcinoma colorretal, use um bisturi fresco para obter pedaços de tecido que pesam cerca de um grama. Em seguida, use uma pinça estéril para transferir os pedaços de tecido fresco em 40 mililitros de tampão HBSS gelado com antibióticos em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, use uma pinça estéril separada para transferir o carcinoma e o tecido normal sequencialmente de um tubo de centrífuga para outro para lavar 40 mililitros de tampão HBSS gelado com antibióticos quatro vezes.

Para remover toda a gordura, tecido não tumoral ou partes de tecido potencialmente necróticas, use uma pinça estéril e transfira os pedaços de tecido para uma placa de Petri de cultura de células estéreis. Em seguida, adicione três a cinco mililitros do tampão HBSS suplementado com antibióticos para deixar os pedaços de tecido umedecidos. Em seguida, use um bisturi novo para aparar os pedaços de tecido.

Em seguida, use um bisturi com uma lâmina curva para picar o tecido restante em pedaços pequenos. Transfira os pedaços de tecido picados para um tubo de dissociação de tecido cheio de meio de cultura celular pré-aquecido. Dissocie os pedaços de tecido picado usando um dissociador de tecido, juntamente com um kit de dissociação de tumor para tecido humano seguindo as instruções do fabricante.

O primeiro passo crítico é processar e microdissecar corretamente a amostra da cirurgia para obter pedaços de tecido com o tamanho e tipo de tecido corretos. Depois de dissociar os pedaços de tecido, centrifugue-o à temperatura ambiente a 300 vezes a gravidade por um minuto. Em seguida, use uma pipeta sorológica para adicionar 10 mililitros de meio DMEM Low pré-aquecido ao tubo MACS.

Em seguida, despeje a suspensão de células do tubo em um filtro de células com tamanho de poro de 100 micrômetros colocado em cima de um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Pipete mais 10 mililitros de DMEM Low medium no tubo MACS para liberar as células adicionais do tubo através do filtro no tubo da centrífuga. Uma vez que toda a suspensão celular é filtrada, lave o filtro celular com mais 10 mililitros de DMEM Low medium.

Centrifugue a suspensão da célula à temperatura ambiente a 300 vezes a gravidade por sete minutos. Em seguida, rejeitar o sobrenadante assim que a centrifugação terminar. Em seguida, dissolva o pellet celular em cinco mililitros de meio EBM-2-MV suplementado e pré-aquecido com antibióticos no mesmo tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Remova a solução de revestimento do frasco de cultura e transfira a suspensão celular diretamente para um frasco de cultura T-25 mantido a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando a confluência atingir cerca de 80 a 90%, adicione um mililitro de Accutase para separar as células do frasco. Em seguida, deixe as células com a Accutase por 10 minutos.

Em seguida, adicione quatro mililitros de meio EBM-2-MV mantido a 37 graus às células. Em seguida, use um dispositivo automatizado de contagem de células com alcance de 10 a 25 micrômetros para contar as células. A segunda etapa mais crítica são todas as etapas em que as células precisam ser divididas.

A estimativa do ponto de tempo correto requer experiência. Se a divisão for muito cedo, as células morrerão. Se a divisão for tarde demais, as células endoteliais atingirão a senescência ou o crescimento excessivo de fibroblastos será um problema.

Em seguida, centrifugue as células à temperatura ambiente a 250 vezes a gravidade por quatro minutos e expulse o sobrenadante no final da corrida. Em seguida, dissolva o pellet celular em tampão FACS pré-aquecido. Em seguida, adicione os anticorpos de coloração FACS às células.

Misture e incube em seguida em temperatura ambiente por um total de 15 minutos. Após metade desse período de incubação, sacuda o tubo uma vez. Use uma pipeta sorológica para adicionar dois mililitros de tampão FACS à suspensão celular marcada.

Em seguida, centrifugar a suspensão da célula à temperatura ambiente a 250 vezes a gravidade durante quatro minutos e decantar o sobrenadante após o término da centrifugação. Em seguida, adicione dois mililitros de tampão FACS para dissolver o pellet celular e centrifugue a suspensão celular em temperatura ambiente por quatro minutos a 250 vezes a gravidade. Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de meio EBM-2-MV suplementado com antibióticos.

Em seguida, transfira as células para o instrumento de classificação FACS. Identifique as células triplo-positivas e deixe-as semear na placa de cultura de 24 poços preenchida com meio EBM-2-MV fresco e pré-aquecido. Cultive as células pelas próximas 48 horas e depois renove o meio.

Continue trocando o meio a cada dois dias até que a confluência atinja 90 a 100% em cinco a 10 dias. Em seguida, expanda a população de células de acordo com a placa de cultura desejada. Em seguida, colher uma vez atingida a confluência e prosseguir para a caracterização.

Primeiro, a amostra tumoral obtida é dissociada e semeada em uma placa de cultura de células. As células não aderentes são lavadas e as células aderentes são cultivadas até 80 a 90% de confluência antes da classificação FACS. Em seguida, a análise FACS é feita para identificar a população do tumor viável imunomarcado e células endoteliais normais.

Para fazer isso, a marcação tripla específica de anticorpos acoplados ao fluorocromo das células endoteliais normais e tumorais é feita para ser classificada por meio de FACS. Uma média de 3,6 e 5,6% de toda a população de células classificadas são células tumorais e endoteliais normais, respectivamente. Em seguida, para identificar a expressão dos marcadores de células endoteliais, as células endoteliais normais e tumorais obtidas são submetidas à imunocitoquímica.

As imagens aqui mostram células endoteliais normais e tumorais CD31-positivas. Em seguida, o RNA é isolado da população de células endoteliais CD31-positivas e submetido a RT-qPCR para identificar os outros marcadores específicos das células endoteliais. A partir do gráfico, a expressão de marcadores de células endoteliais, como CD105, VE-caderina e fator de von Willebrand, também é detectada, mas falta expressão de marcadores de populações de células potencialmente contaminantes, indicando pureza das culturas de células endoteliais isoladas.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente três semanas se for executada corretamente. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque requer experiência com culturas de células endoteliais primárias para estimar quando e em quais proporções as células podem ser divididas ou processadas posteriormente para a análise de classificação FACS. As implicações dessa técnica se estendem à terapia do carcinoma colorretal, pois as culturas de células podem ser usadas para identificar mecanismos de resposta ao tratamento de tumorigênese ou resistência no carcinoma colorretal.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando lemos vários relatos na literatura apontando para problemas com o estabelecimento de células endoteliais realmente puras e viáveis de tumores sólidos humanos. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de microdissecção ou processamento de tecidos para a análise de classificação FACS ou posterior divisão de células endoteliais requerem experiência para estimar o ponto de tempo correto. Ao tentar este procedimento, é importante primeiro estabelecer uma rede cooperativa funcional com cirurgia, patologia e registro de tumores.

Além disso, você deve ser treinado em exercícios para trabalhar com culturas de células endoteliais primárias, pois essas células são frágeis. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células endoteliais do carcinoma colorretal humano e do cólon normal correspondente.