Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

O objetivo geral desta técnica analítica é quantificar o etambutol antituberculose nos compartimentos do tecido da lesão pulmonar da tuberculose para determinar se as concentrações de drogas bactericidas estão sendo atingidas. Este método pode responder a perguntas no campo de descoberta e desenvolvimento de medicamentos para tuberculose, determinando se os medicamentos administrados estão atingindo populações bacterianas em concentrações esterilizantes em todos os compartimentos do tecido do granuloma. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a quantificação completa das concentrações de drogas com alto detalhe espacial em estruturas de tecidos e populações de células específicas.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de seccionamento e montagem do tecido são difíceis de aprender devido ao potencial de contaminação do tecido e à natureza frágil das lâminas de membrana. Comece este procedimento com a coleta de tecidos, conforme descrito no protocolo de texto. Para realizar o corte do tecido, primeiro ajuste o criostato para a temperatura de corte desejada.

Transfira a biópsia pulmonar irradiada com radiação gama do armazenamento de 80 graus Celsius negativos para o criostato e deixe por 30 minutos para equilibrar a temperatura do tecido. Usando uma pinça, fixe a biópsia no mandril do criostato usando uma pequena quantidade de adesivo de temperatura de corte ideal para aderir a base do tecido ao mandril. Oriente o tecido de forma que a superfície plana seja a superfície exposta para o corte.

Certifique-se de que a OCT não contamine a superfície do tecido, pois isso pode interferir na análise subsequente da espectrometria de massa. Corte três seções de tecido com 25 mícrons de espessura e monte em lâminas de membrana PET. Toque suavemente a membrana na seção de tecido e remova a seção.

Se muita pressão for aplicada, a membrana fina pode rasgar. Evite o manuseio excessivo da lâmina antes da montagem para não carregar a membrana PET e diminuir a adesão da seção do tecido. Mantenha a lâmina da membrana à temperatura ambiente para permitir a montagem do descongelamento e a adesão bem-sucedida do tecido à membrana.

Remova a lâmina do criostato e deixe-a secar ao ar por três minutos. Se o LCM-LC-MS/MS não for executado imediatamente, sele a lâmina em um pequeno saco hermético e selado e transfira para o armazenamento de menos 80 graus Celsius até que seja necessário para dissecação. Corte uma seção adjacente de 10 a 12 mícrons e descongele a montagem em uma lâmina de vidro padrão para coloração de hematoxilina e eosina.

Seções adicionais podem ser cortadas neste momento para outras colorações histoquímicas desejadas. Remova o saco lacrado contendo a lâmina do armazenamento de 80 graus Celsius negativos e deixe atingir a temperatura ambiente por cinco minutos. Se a lâmina fria for imediatamente exposta à atmosfera do laboratório, o tecido ficará revestido de condensação e a integridade espacial do medicamento poderá ser comprometida.

Ligue o microscópio e o laser. O laser requer de cinco a 10 minutos para aquecer antes que o corte possa começar. Carregue tubos PCR de 0,20 mililitro no suporte.

Depois de remover a lâmina do saco, tire uma imagem óptica da seção de tecido na lâmina PET usando um scanner de mesa. Coloque a corrediça no suporte da corrediça, com o lado do tecido voltado para baixo. Atribua tubos de coleta separados a regiões específicas de granuloma de interesse usando o software do microscópio.

Normalmente, eles serão pulmão, granuloma celular e caseum não envolvidos, mas podem variar dependendo da patologia específica da biópsia do granuloma. Concentre-se no tecido usando a objetiva de microscópio 5X. Essa ampliação deve fornecer uma boa visão geral do tecido que contém áreas de granuloma celular e necrótico.

No software, selecione o tubo designado caseum para movê-lo para a posição sob o tecido. Insira os parâmetros de dissecação desejados. As configurações típicas para uma seção pulmonar de 25 mícrons de espessura são potência do laser 30, velocidade 15 e abertura 35.

No entanto, eles serão diferentes dependendo do microscópio usado e do potencial declínio da potência devido à idade do laser. Selecione a ferramenta Desenho livre e, usando um mouse ou uma caneta touchscreen, contorne a região desejada para dissecação. A área de superfície da região será exibida no software.

Mantenha as regiões selecionadas abaixo de 500.000 mícrons quadrados para facilitar a dissecação. Repita a dissecção até que três milhões de mícrons quadrados tenham sido coletados no total na tampa do tubo. Ocasionalmente, a região dissecada pode permanecer presa à membrana circundante e não cair na tampa de coleta.

Remova essas regiões do total da área de superfície cumulativa selecionando e removendo manualmente no software. Em seguida, selecione a tampa para lesão celular e colete três milhões de mícrons quadrados de tecido usando o mesmo processo. Selecione a tampa para pulmão não envolvido e colete três milhões de mícrons quadrados de tecido usando o mesmo processo.

Observe que o tecido pulmonar não envolvido contém muitos bronquíolos e espaços alveolares. Preste muita atenção para excluí-los das regiões de tecido definidas para dissecção. Remova o suporte da tampa e solte, sele e rotule cuidadosamente cada tubo.

Proteja os tecidos dissecados dos distúrbios do ar circundante. Analise os tecidos dissecados imediatamente ou armazene a 80 graus Celsius negativos e descongele antes do processamento e da análise de LC/MS. Assumindo uma densidade de tecido de um grama por mililitro, prepare o estoque homogeneizado pesando 50 miligramas de tecido controle e adicionando tampão PBS para diluir.

Homogeneizar o tecido batendo o tecido pulmonar e o tampão PBS por cinco minutos a 1750 rpm em um homogeneizador de contas. Em seguida, dilua um miligrama por mililitro de estoques de medicamentos em acetonitrila/água um para um para criar soluções de pico de curva padrão. Determine as concentrações padrão de pico com base no volume do pico e no volume do tecido alvo.

O exemplo ilustrado é para um padrão de 100 nanogramas por mililitro usando um volume de pico de 10 microlitros. Remova os tubos contendo o tecido microdissecado do armazenamento de 80 graus Celsius negativos e deixe atingir a temperatura ambiente por cinco minutos. Adicione 10 microlitros de solução um-para-um de acetonitrila/água e dois microlitros de tampão PBS aos tubos que contêm o tecido microdissecado.

Para tubos de curva padrão e controle de qualidade, adicione 10 microlitros de solução de pico a dois microlitros de homogeneizado pulmonar de controle. Adicione 50 microlitros de solução de extração a cada tubo. Vortex cada tubo por cinco minutos.

Em seguida, sonicá-los por cinco minutos. Em seguida, centrifugue os tubos a 5.000 rpm por cinco minutos para formar um pellet de filme e tecido em cada tubo. Após a centrifugação, transfira 50 microlitros de sobrenadante para uma placa de 96 poços profundos e dilua com mais 50 microlitros de água deionizada em cada poço.

Por fim, execute a análise LC-MS/MS e a validação do método conforme descrito no protocolo de texto. O método LCM-LC/MS foi validado pela primeira vez analisando regiões microdissecadas a laser do homogeneizado de tecido enriquecido com etambutol. Como mostrado aqui, o método foi altamente reprodutível e demonstrou excelente recuperação do medicamento.

As concentrações de etambutol medidas por LCM-LC/MS em múltiplos tecidos pulmonares foram posteriormente validadas por comparação direta com as concentrações determinadas por uma abordagem LC/MS estabelecida. Concentrações equivalentes foram detectadas por ambas as técnicas. As concentrações absolutas de etambutol no parênquima pulmonar não envolvido, na borda da lesão celular e no caseum necrótico foram determinadas por LCM-LC/MS.

Os níveis de esterilização do Mycobacterium tuberculosis foram alcançados em todos os compartimentos da lesão. As concentrações mínimas necessárias para matar 99% dos bacilos replicantes extracelulares e 99% dos bacilos intracelulares em macrófagos são indicadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como microdissecar tecidos e quantificar os níveis de drogas dentro de estruturas de granuloma pulmonar definidas.

Essa técnica permite que pesquisadores no campo da pesquisa de medicamentos antimicrobianos avaliem com precisão e quantitativamente se os medicamentos administrados estão atingindo as populações de patógenos-alvo em concentrações esterilizantes. Essa abordagem tem ampla aplicabilidade a muitos tecidos e estados de doença diferentes.