Name: Toda a montagem em microscopia Confocal para pele da orelha do adulto: um sistema de modelo para estudar a morfogênese Neuro-vasculares de ramificação e distribuição de células imunes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a técnica de montagem completa em microscopia confocal para visualizar a morfogênese de ramificação de nervos e vasos sanguíneos periféricos, além da distribuição de células imunes na pele da orelha de camundongos adultos.

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Agradecemos a K. Gill para a gestão do laboratório e suporte técnico, J. Hawkins e os funcionários dos institutos nacionais de saúde (NIH) facilidade do edifício 50 animais de assistência com cuidados de rato e R. Reed e F. Bernardo para assistência administrativa. Obrigado também a Motegi S. e M. Udey por compartilhar o seu protocolo de dissecação de pele orelha, s. Burns para ajuda editorial e membros do laboratório de células-tronco e biologia Neuro-Vascular para ajuda técnica e discussão pensativo. T. Yamazaki foi apoiado pela sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) NIH-KAITOKU. Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa Intramural de nacional do coração, pulmão e Instituto de sangue (HL005702-11 para Y.M.)

Todos os experimentos nesta seção foram realizados sob aprovação do nacional do coração, pulmão e cuidado do Animal de sangue Institute (NHLBI) e Comité de uso.
1. coleção de pele de orelha de rato adulto
<ol><li>Eutanásia em ratos adultos pela exposição de dióxido de carbono (CO2) em uma câmara fechada e em seguida, confirme a eutanásia por deslocamento cervical. Nota: O experimento segue a diretriz do National Institutes of Health (NIH) para o método de eutanásia.</li>
	<li>Dissecar a orelha da base e coloque-o em um 35 x 10 mm2 placa de Petri contendo 2 mL de Hank está equilibrado sal solução (HBSS). Brevemente, apare os pelos com uma tesoura.</li>
	<li>Descasca a pele posterior e anterior pele fora cuidadosamente da cartilagem intermediárias. Nota: Cartilagem anexa à pele anterior.</li>
	<li>Transferência posterior e anterior pele separadamente para um 24 bem placa contendo 1 mL de gelado fresco 4% paraformaldeído (PFA) em solução salina tampão fosfato (PBS) por poço. Achate a pele anterior e posterior nos 4% PFA.</li>
	<li>Corrigi a pele anterior e posterior com cartilagem a 4 ° C, durante 1 h.</li>
	<li>Lave a pele posterior e anterior por 5 min por 3 vezes em 1 mL de PBS com mistura suave em um misturador à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferi a pele anterior e posterior com cartilagem no fundo de um 35 x 10 mm2 placa de Petri. Corta a região de base, que é dobrada e tem adiposo e tecidos conjuntivos. Descole a cartilagem da pele anterior usando pinça curva bem.</li>
	<li>Cuidadosamente Retire os pelos, tecidos adiposo e tecidos conjuntivos do interior da pele posterior usando uma pinça curva bem. Manter a pele molhada com PBS.</li>
</ol>2. coloração imuno-histoquímica toda a montagem de pele de orelha de rato
Nota: Todas as experiências nas seções a seguir foram realizadas em conformidade com as diretrizes de segurança do laboratório de NIH.
<ol><li>Prepare o tampão de bloqueio. Soro de cabra de calor 10% inactivada de filtro (HIGS) diluído em PBS com 0,2% Tritão tampão de bloqueio X-100 (TX-100), ou 10% de soro de burro (DS) diluído em PBS com 0,2% de tampão de bloqueio TX-100, usando uma unidade de filtro de 0,45 µm.</li>
	<li>Transferência posterior e anterior pele para um 24 bem placa contendo 1 mL de tampão de bloqueio HIGS 10% ou 10% DS buffer bloqueio por bem. Incube a pele por 30 min com a mistura suave em um misturador à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar a solução de anticorpo primário diluindo os anticorpos primários (Tabela de materiais) em tampão de bloqueio (ou 10% HIGS ou 10% DS). Nota: Todo-mout immunohistochemical análise da pele da orelha do adulto com anticorpos para classe de neurônio específico marcador pan-neuronal III β-tubulina (Tuj1, coelho policlonais IgG ou mouse monocloncal IgG2a, diluição de 1: 500 na concentração final de 2 µ g/mL), molécula de adesão de célula endotelial para plaquetas de marcador Pan-endothelial da pilha 1 (PECAM-1, hamster monoclonal IgG, diluição de 1: 300 na concentração final de 3,3 µ g/mL), proteína básica da mielina marcador mielina (MBP, rabbit IgG policlonal, diluição de 1: 200 para o concentração final de 5 µ g/mL) e marcador de células mieloides inflamatória CD11b (Rat IgG2b monoclonal, 01:50 diluição na concentração final de 20 µ g/mL) foi mostrado na Figura 1 e Figura 2. A pele foi incubada com anticorpo conjugado Cy3 para actina de músculo liso α marcador do músculo liso vascular célula (αSMA) juntamente com anticorpos secundários (2.6). Os anticorpos primários testados por nós mesmos foram listados na Tabela de materiais. Vários anticorpos primários derivados de espécies diferentes podem ser misturados em simultâneo.</li>
	<li>Transferi a pele posterior e anterior ao novo poço contendo 150 µ l da solução de anticorpos primários. Incube a pele com suave mistura em uma batedeira a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, transfira a pele anterior e posterior para novos poços em placa de 24 bem ou Aspire o tampão de bloqueio contendo anticorpos primários. Adicione 1 mL de qualquer 2% HIGS diluído em PBS com tampão de lavagem TX-100 0,2% ou 2% DS diluído em PBS com tampão de lavagem de TX-100 de 0,2%. Lave a pele com 3 alterações da reserva lavar cada 15 min com a mistura suave em um misturador à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare a solução de anticorpo secundário (Tabela de materiais). Diluir a anticorpos secundários no buffer de bloqueio (ou 10% HIGS ou 10% DS) e o tampão de bloqueio contendo anticorpos secundários através de 0,22 µm polivinilideno difluoreto (PVDF) membrana seringa filtro ligado a uma seringa de 1 mL de filtro. Nota: Alexa 488 ou 633-conjugados de cabra anticoelho IgG (H + L) ou mouse IgG2a pelo Tuj1, anticabra hamster Alexa 647-Conjugado IgG (H + L) para PECAM-1, Alexa 488-conjugados de cabra anticoelho IgG (H + L) para MBP, e utilizaram-se ratos Alexa 594-Conjugado IgG (H + L) para CD11b com a diluição de 1: 250 para a concentração final de 8 µ g/mL. A pele foi incubada com anticorpo de Cy3-conjugados αSMA (diluição 1: 500 na concentração final de 2-3 µ g/mL) em combinação com estes anticorpos secundários.</li>
	<li>Centrifugue a solução a 13.000 x g por 10 min remover partículas de agregados dos anticorpos secundários do buffer do bloqueio. Nota: Diferentes fluorescentes conjugados anticorpos secundários derivados de espécies diferentes podem ser misturados em simultâneo.</li>
	<li>Transferi a pele anterior e posterior para bem contendo 150 µ l da solução de anticorpos secundários. Embrulhe a placa bem 24 em folha de alumínio para evitar a luz e incubar a pele para 1 h com uma mistura suave em um misturador à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferir a pele anterior e posterior para novos poços em placa de 24 bem ou Aspire a solução anticorpo secundário por pipeta completamente. Adicione 1 mL de tampão de lavagem HIGS 2% ou 2% tampão de lavagem de DS.</li>
	<li>Embrulhe a placa bem 24 em folha de alumínio e lave com 3 alterações da reserva lavar cada 15 min com a mistura suave em um misturador à temperatura ambiente.</li>
</ol>3. a pele da orelha de montagem em Slide
<ol><li>Coloque a pele na parte inferior de um 35 x 10 mm2 placa de Petri. Cuidadosamente Retire os pelos, tecidos adiposo, tecidos conectivos, poeiras e fibras do interior da pele usando pinças curvas bem sob estereomicroscópio com baixa iluminação para minimizar a extensa foto branqueamento. Manter a pele molhada com PBS.</li>
	<li>Transferi a pele para um adesivo de microscópio usando fórceps. Coloque a pele anterior e posterior com o interior voltado para cima no slide. Achate a pele usando fórceps.</li>
	<li>Monte a pele em meio líquido anti-desvaneça-se de montagem para evitar fotobranqueamento e preservar sinais fluorescentes. Certifique-se de que não há bolhas de ar são sobre ou em torno da pele.</li>
	<li>Cobrir com lamela em amostras de pele cuidadosamente e guarde os slides de amostra de pele montado na noite escura à temperatura ambiente para permitir que os meios de comunicação de montagem fiquem firmes. Selar a lamela para o slide com as unhas pintadas e armazená-lo em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>4. Confocal da microscopia
<ol><li>Configure o apropriado lasers para fluorophores. Um microscópio confocal com três fontes de laser (argônio 488 nm, nm DPSS 561 e aqui vai 633 nm) é usado neste experimento.</li>
	<li>Use a ferramenta de varredura sequencial, que excita simultaneamente amostras triplo-manchada, para evitar e reduzir qualquer sobreposição. Nota: Imagens serão tomadas de uma forma sequencial, usando o modo de varredura sequencial.</li>
	<li>Imagem sob um objetivo X 10. Use a ferramenta de exame de telha para capturar a pele de todo o ouvido. Definir Z-pilha e certifique-se que o z-posição cobre toda espessura da pele da orelha.</li>
</ol>

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li>
<li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature%3A+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li>
<li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons%3A+looking+for+innervation+in+all+the+right+places%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749(2014).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Whole+Mount%3A+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick%2C+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540(2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li>
<li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li>
<li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoriasis%3A+what+we+have+learned+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li>
<li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+challenges+of+chronic+wounds%3A+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li>
<li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24615439">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve a imagem de toda a montagem immunonohistochemical de pele de orelha do adulto para a análise das estruturas neuro-vasculares e distribuição de células imunes. Acreditamos que este método tem várias vantagens experimentais aos pesquisadores estudar ramificação morfogênese e a padronização de nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição tridimensional dos componentes da pele, incluindo o cabelo e células do sistema imunológico folículos. Os resultados da imagem podem ser quantif...

Pele é composta por três camadas: epiderme, derme e hipoderme. Ela tem sido usada como um sistema modelo para estudar a manutenção de células-tronco, diferenciação e morfogênese em desenvolvimento, bem como a regeneração tumorigênese e inflamação em adultos. Pele é ricamente vascularizada e inervada tal que o desenvolvimento do sistema vascular e sistema nervoso periférico é bem coordenado.
Nós demonstramos anteriormente uma técnica de imagem de montagem em toda a pele embrionária com múltiplos rotulagem para estudar os nervos periféricos intactos e os vasos sanguíneos, incluindo seus componentes celulares1,2,3, 4: axônios sensoriais, simpáticos axônios, células em nervos Schwann, células endoteliais, pericitos e células de músculo liso vascular (VSMCs) nos vasos sanguíneos. Durante a angiogênese, uma rede capilar primária sofre remodelação vascular intensivo e se desenvolve em uma rede hierárquica de ramificação vascular. Na derme/hipoderme em desenvolvimento, as artérias ramificam ao lado de veias e nervos sensoriais periféricos dão forma então adjacentes às artérias. Depois que a rede vascular hierárquica é completamente coberta com VSMCs, nervos simpáticos se estendem ao longo e inervam os vasos sanguíneos de grande diâmetro1,5,6. Apesar da importância da associação estreita entre os sistemas nervosos e vasculares em desenvolvimento, uma grande questão tem sido a abordar o que acontece com as redes neuro-vascular em diversas situações patológicas em adultos. Uma imagem tridimensional de alta resolução é necessária apreciar a patogênese, juntamente com a morfogênese ramificação anatomicamente reconhecível e padronização.
Morfogênese neuronal e vascular em pele de rato adulto é comumente analisada pela coloração de secção de tecido. Outros estudos utilizaram imagens de toda a montagem da pele para visualizar os nervos periféricos e dos vasos sanguíneos, além dos folículos pilosos, glândulas sebáceas e arrector pili músculos7,8,9. No entanto, a espessura da pele adulta tornou difícil analisar a pele ao longo de toda a sua profundidade.
No presente estudo, nós desenvolvemos uma romance de alta resolução de imagem toda a montagem da pele da orelha do adulto para superar estes desafios. Pele da orelha é prontamente acessível para dissecção e subsequente de imagem de toda a montagem da pele ao longo de toda a sua profundidade. Assim, é um método simples e altamente reprodutível que pode ser aplicado para comparar a arquitetura tridimensional dos sistemas nervoso e vasculares periféricas na pele, com medidas de quantificação abrangente. Demonstrámos que o alinhamento dos nervos periféricos sensoriais e simpáticos com os vasos sanguíneos de grande diâmetro é preservado na pele adulta. O objetivo do presente protocolo é Visualizar ramificação morfogênese e a padronização dos nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição de células imunes a um nível celular em modelos do rato adulto em várias condições, tais como inflamação e regeneração.

<table><tbody><tr><td>10 x Fosfato Tampolado Salino</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, sem Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, com Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>15710</td><td>PFA, fixador, diluído em PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Componente do tampão de bloqueio/lavagem</td></tr><tr><td>Normal soro de burro</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Componente do tampão de bloqueio/lavagem</td></tr><tr><td>Pinças finas curvas</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Pinças curvas</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtro 0,45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>Para filtração</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>Para filtração</td></tr><tr><td>Unidade de filtro de seringa 0,22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>Para filtração</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Meio de montagem anti-desbotamento</td></tr><tr><td>Esmalte para unhas</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>72180</td><td>Para vedação</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics software editor</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, marcador de células endoteliais vasculares, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31)</td><td>anticorpo BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rato IgG2a kappa, marcador de células endoteliais vasculares, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&#945;Anticorpo SMA conjugado com cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Camundongo IgG2a, marcador de células musculares lisas vasculares, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-EphB1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Marcador de células endoteliais venosas policlonais de cabra, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neurônio específico Classe III &#946;-tubulina (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, IgG policlonal de coelho, marcador pan-axonal, anticorpo anti-Tuj1 1:500</td></tr><tr><td></td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Camundongo IgG2a, marcador pan-axonal, anticorpo anti-MBP 1:500</td></tr><tr><td></td><td>IgG</td> policlonal de coelho Abcam <td>AB40390</td>, <td>marcador de mielinização, anticorpo</td></tr><tr><td>anti-tirosina hidroxilase</td> 1:200 <td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Coelho policlonal, marcador de neurônio simpático, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-periferina</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Coelho policlonal, marcador de neurônio periférico, 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD11b</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rato IgG2b, marcador de células inflamatórias (macrófagos),</td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD45</td> 1:50 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rato IgG2b kappa, marcador de células pan-hematopoiéticas, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD3</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>IgG1 de rato, marcador de células imunes, anticorpo 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>IgG2a kappa de rato, marcador de células inflamatórias, anticorpo anti-GFP 1:200</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Policlonal de coelho, anticorpo anti-GFP 1:300</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Policlonal de frango, anticorpo 1:500</td></tr><tr><td>Anti-&#946;-gal</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Policlonal de coelho, anticorpo anti-RFP 1:5000</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Policlonal de coelho, 1:300</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra (H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Anticorpo secundário policlonal de coelho, 1:250</td></tr><tr><td>IgG anti-hamster de cabra (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Anticorpo secundário policlonal de hamster, 1:250</td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra (H + L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Anticorpo secundário policlonal de rato, 1:250</td></tr><tr><td>IgG2a anti-camundongo de cabra Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>Anticorpo secundário IgG2a de camundongo, 1:250</td></tr></tbody></table>

toda a montagem em microscopia confocal para pele da orelha do adulto: um sistema de modelo para estudar a morfogênese neuro-vasculares de ramificação e distribuição de células imunes

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Aqui, apresentamos um protocolo de uma pele de orelha do adulto de toda a montagem de imagem técnica para estudo abrangente tridimensional neuro-vascular ramificação morfogênese e padronização, bem como a distribuição de células imunes a um nível celular. A análise das estruturas anatômicas nervos e dos vasos sanguíneos periféricas em tecidos adultos fornece alguns insights sobre a compreensão da fiação neuro-vascular funcional e degeneração neuro-vascular em condições patológicas como a cicatrização de feridas. Como um sistema modelo altamente informativa, focamos nossos estudos na pele da orelha do adulto, que é facilmente acessível para dissecação. Nosso protocolo simples e reprodutível fornece uma descrição exata dos componentes celulares da pele inteira, tais como os nervos periféricos (axônios sensoriais, simpáticos axônios e células de Schwann), vasos sanguíneos (células endoteliais e células de músculo liso vascular ) e células inflamatórias. Acreditamos que este protocolo irá pavimentar o caminho para investigar as anormalidades morfológicas nos nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a inflamação da pele da orelha do adulto sob diferentes condições patológicas.

Pele de rato adulto orelha posterior (figura 1A) e pele de orelha anterior (figura 1B) foram immunostained com anticorpos αSMA (vermelho), Tuj1 (verde) e PECAM-1 (azul). Pele posterior foi immunostained para estudar a distribuição de neuro-imune usando anticorpos anti-CD11b (vermelho) e MBP (verde), juntamente com Tuj1 (azul) (Figura 2A). Distribuição de CD11b+ células inflamatórias, inclu...

Aqui, descrevemos um método de imagem de toda a montagem de alta resolução da pele de orelha inteira rato adulto, que nos permite visualizar ramificação morfogênese e padronização de nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição de células imunes.

Toda a montagem em microscopia Confocal para pele da orelha do adulto: um sistema de modelo para estudar a morfogênese Neuro-vasculares de ramificação e distribuição de células imunes

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a morfogênese ramificada e a padronização dos nervos periféricos e vasos sanguíneos, bem como a distribuição de células imunes. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da neurobiologia, biologia vascular e imunologia, iluminando anormalidades morfológicas nos nervos periféricos e vasos sanguíneos, bem como inflamação. A principal força dessa técnica é que podemos visualizar os componentes celulares dos nervos periféricos, vasos sanguíneos e células imunológicas na pele em toda a sua profundidade e podemos comparar a arquitetura tridimensional dos sistemas nervoso e vascular.Este método pode fornecer informações sobre as estruturas da neurovasculatura e a distribuição de células imunes em camundongos juvenis a adultos em condições normais e patológicas. Depois de sacrificar camundongos adultos de acordo com o protocolo de texto, disseque a orelha da base e coloque-a em uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros contendo dois mililitros de HBSS. Em seguida, use uma tesoura para aparar brevemente os cabelos.Retire cuidadosamente a pele posterior e anterior da cartilagem intermediária. Transfira cada seção da pele

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós introduzimos um conjunto de montagem imunohistoquímica e microscopia confocal de varredura a laser com vários rotulagem para analisar a formação de uma intrincada rede vascular em pele de rato membro embrionárias.

Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

A matriz extracelular sofre remodelação substancial durante a cicatrização de feridas, inflamação e tumorigênese. Nós apresentamos uma abordagem microscopia de imunofluorescência intravital romance de visualizar a dinâmica de fibrilar, bem como componentes da matriz de malha-like com resolução espacial e temporal alta usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.

Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

Pele de mamíferos contém um diversificado leque de estruturas - como os folículos capilares e terminações nervosas - que apresentam padrões distintos de organização espacial. Analisando a pele como uma montagem plana aproveita a geometria 2-dimensional deste tecido para produzir de espessura total imagens de alta resolução de estruturas da pele.

Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Aqui descrevemos uma nova preparação para imagens de terminais sensoriais lanceolados vivos de terminações paliçadas que inervam os folículos pilosos da pele da orelha de camundongo durante a coloração e descoloração com corantes de estiril piridínio.

Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse pele da orelha

Este protocolo descreve a indução de um modelo de isquemia-reperfusão (IR) em pele de orelha de rato usando íman de fixação. Usando um modelo de imagens intravital custom-built, estudamos nas respostas inflamatórias in vivo pós-reperfusão. A lógica por trás do desenvolvimento desta técnica é ampliar a compreensão de como leucócitos responder a uma lesão IR pele.

Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

O modelo orelha do rato SKH1-hr hr sem pêlos permite a microscopia de fluorescência intravital da microcirculação e indução trombo fototóxico sem preparação cirúrgica prévia no leito microvascular examinado. Portanto, a orelha do rato sem pêlo é um excelente modelo in vivo para estudar as interacções complexas durante a formação do trombo microvascular, evolução de trombos, e trombólise.

Intravital Microscopia e trombo Indução no lóbulo da orelha de um rato calvo

O pintinho é um organismo modelo econômico, acessível e amplamente disponível para uma variedade de estudos. Aqui, uma série de protocolos é detalhada para entender os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e regeneração do ouvido interno das aves.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

O protocolo apresenta uma nova ferramenta para simplificar a obtenção de imagens intravitais usando microscopia confocal invertida.

Abordagem simplificada de imagem intravital para monitoramento de longo prazo da dinâmica do tecido epitelial em um microscópio confocal invertido

Este protocolo, destinado a usuários iniciantes de tecido do ouvido interno de camundongos, detalha de forma abrangente as etapas para o processamento de ouvidos internos de camundongos em diferentes estágios de desenvolvimento para imunocoloração de seção.

Crioseccionamento e imunocoloração do tecido do ouvido interno de camundongos: dos estágios embrionário ao adulto

Aprenda a técnica de montagem completa em microscopia confocal para visualizar a morfogênese de ramificação de nervos e vasos sanguíneos periféricos, além da distribuição de células imunes na pele da orelha de camundongos adultos.

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