Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

O objetivo geral deste procedimento é criar quebras de fita dupla de DNA localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser de 405 nanômetros amplamente disponível e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparo de DNA nessas lesões. Este método pode ser usado para determinar se uma determinada proteína é recrutada para quebras de DNA de fita dupla e delinear as vias de sinalização que regulam seu acúmulo nas lesões de DNA. A técnica usa um sistema de microscópio confocal comumente disponível para induzir localmente danos ao DNA.

Isso permite que praticamente qualquer laboratório estude a cinética da resposta ao dano do DNA. Se estiver monitorando o recrutamento vivo de uma proteína marcada com fluorescência, realize a transfecção transitória ou a seleção de linhagens celulares estáveis que expressam a proteína de interesse, fundidas a um repórter fluorescente. 24 horas antes do experimento de microirradiação, semear 40.000 células U2OS por poço em DMEM 1X contendo 10% FBS, em lâminas de cultura de oito poços, com fundos de polímero de vidro semelhantes a lamínulas de 170 mícrons de espessura.