Name: Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprenda a avaliar a perda de acidez lisossômica no intestino de Caenorhabditis elegans usando o corante cDCFDA. Este método simples e reprodutível auxilia pesquisadores em estudos de autofagia e função lisossômica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer o centro de genética Caenorhabditis para tensões, as ciências naturais e Conselho de pesquisa de engenharia (NSERC) e a Fundação do Canadá para a inovação (TPI) para financiamento. Gostaríamos de agradecer o Dr. Lizhen Chen (departamento de sistemas de célula e anatomia, UT saúde San Antonio) por permitir o uso irrestrito de seus laboratórios para todos os experimentos de c. elegans , bem como Dr. Exing Wang (diretor associado, Optical Imaging Facility UT saúde San Antonio) para obter assistência com microscopia confocal. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Myron Ignatius para fornecer apoio e incentivo para facilitar a gravação do vídeo.

1. mancha e lisossomos intestinais de imagem
<ol><li>Placas de mídia de crescimento nematoide de semente (NGM) OP50
	<ol>
<li>Preparar pratos NGM conforme o protocolo recomendado19 e permitir que as placas fechadas secar por 2 dias à temperatura ambiente.</li>
		<li>Inocular as bactérias OP50 no caldo estéril de caldo Luria (LB) e crescer em um tremendo banho de incubadora ou água a 37 ° C por 36 h ou até que o OD está entre 0,2 e 0,4. Evitar o uso de uma cultura bacteriana com OD > 1 ou OD < 0.2.</li>
		<li>Uma vez que NGM placas são secas, coloque uma gota (~ 30 µ l) de inóculo OP50 no centro da placa e espalhe então a queda em um patch mais ou menos que é 2 x 2 cm de tamanho. Nota: Qualquer inóculo OP50 restante pode ser armazenado a 4 ° C por até um mês.</li>
		<li>Inverter as placas OP50, uma vez que o inóculo secou (cerca de 10 ou 15 min) e então incubar as placas a 37 ° C para 36 h.</li>
		<li>Após 36 h, retire as placas da incubadora e loja a 4 ° C até utilização posterior. Nota: As placas devem ser boas para até 1 mês a 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Completando o cDCFDA para OP50
	<ol>
<li>Para complementar cDCFDA nas chapas OP50, prepare um estoque de trabalho de cDCFDA de 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO). Manter a solução de cDCFDA, protegida da luz e loja a-20 ° C para uso posterior.</li>
		<li>Coloque delicadamente a 100 µ l de solução de cDCFDA de 10mm para a superfície do patch OP50 2 cm x 2 cm, tal que o patch inteiro é uniformemente coberto com cDCFDA. Nota: É muito importante que o patch inteiro de OP50 é coberto com cDCFDA. Se necessário, use até 150 µ l de cDCFDA para cada placa. Também é imperativo que a solução de cDCFDA não se estende para além das fronteiras do patch OP50, desde que qualquer cDCFDA que flui fora o patch OP50 não ser incorporado a comida e resultará em intensidade de coloração reduzida.</li>
		<li>Colocar as placas de OP50 em uma caixa escura na parte superior do banco até que todos da solução cDCFDA é absorvido o patch bacteriano (geralmente cerca de 25 a 30 min).</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração de vermes usando cDCFDA
	<ol>
<li>Uma vez que o cDCFDA completamente tem permeado o patch OP50, lugar não mais de 20 minhocas por placa e incubar as placas invertidas a 20 ° C por um período mínimo de 14 h. Nota: Recomenda-se colocar as placas de cDCFDA em um caixa opaco para minimizar a exposição à luz.</li>
		<li>Para controlar as diferenças de consumo entre experiências e para normalizar os sinais cDCFDA, (recomendado) co mancha com 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ( diflúor) boro (2,5 µ l de uma solução de recém-feitos 1 mM), um corante de amina fraco acidotropic cuja fluorescência é em grande parte não-variante sobre o espectro de pH ácido (consulte Tabela de materiais para nomes comuns de reagentes). Nota: Não mancha worms para menos de 14 h, desde que este pode fornecer a intensidade de coloração inadequada cDCFDA e dar uma falsa interpretação de pH dos lisossomos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar lâminas para microscopia
	<ol>
<li>Coloque duas tiras paralelas de rotulagem fita aproximadamente 3 polegadas separados sobre uma superfície lisa e plana, como um espelho (Figura 1).</li>
		<li>Revestir a superfície do espelho com spray repelente de água e limpe o líquido excedente.</li>
		<li>Derreter a agarose 2% (dissolvido em água destilada H2O) no microondas até completamente liquefeito, em seguida, coloque uma gota de µ l 50 de agarose entre as duas tiras de fita e rapidamente cobrir a gota com uma lâmina de microscópio, tal que o slide é perpendicular às tiras de fita. Depois que a agarose tem solidificado, formando uma almofada circular sob o slide, vire o slide e adicionar 10 a 15 µ l de 5mM de azida sódica (NaN3) sobre a placa de agarose. Nota: NaN3 é um inibidor do citocromo C que, quando usado em baixas concentrações, anestesia reversível vermes para que eles não vão se mover durante a imagem latente.</li>
		<li>Pegar vermes da placa OP50 suplementado com cDCFDA e transferi-los para um prato NGM limpo sem qualquer OP50. Permitir que as minhocas mover-se por alguns segundos permitir que a maior parte da OP50 para ser removido da superfície dos vermes e depois transferir os vermes para a almofada de agarose contendo azida sódica 5 mM.</li>
		<li>Cubra imediatamente o pad de agarose com uma lamela. Certifique-se de colocar suavemente a lamínula sem aplicar demasiada pressão, pois isso pode resultar em estouro de vermes. Nota: OP50 bactérias suplementadas com cDCFDA fluorescem quando visualizadas por microscopia, portanto, é importante limpar os vermes como o melhor possível antes de colocá-los na plataforma de agarose contendo azida de sódio. Se preparando mais de 6 cepas de c. elegans (incluindo N2, controle de tipo selvagem), é aconselhável preparar as amostras em lotes de 6, a fim de assegurar que os vermes não secar na rampa de agarose. Em algumas variedades, a vulva começa a romper-se após longos períodos de tempo devido à pressão da lamínula, portanto é importante planejar de acordo.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia confocal Nota: Alguns microscópios têm um recurso interno que automaticamente aumenta a intensidade de fluorescência para compensar os níveis variáveis de fluorescência. Tais microscópios podem não funcionar bem para vermes manchados com cDCFDA, desde que eles inerentemente irão aumentar a intensidade de fluorescência das amostras de imagem.<ol>
<li>Executar a imagem em um microscópio confocal padrão usando comprimentos de onda de excitação/emissão definidos como 488/530 nm para cDCFDA. Leve o único avião imagens (não Z-stacks) de lisossomos intestinais e usar apenas os lisossomos que estão em foco (intensidade de sinal máxima) para quantificação de intensidade. Nota: Talvez devido a diferenças na disponibilidade de tintura, lisossomos das células intestinais diretamente posteriores da faringe mantêm cDCFDA coloração intensidade independentemente do genótipo ou idade, portanto, tenha cuidado para evitar a imagem de lisossomos nestas células.</li>
		<li>Imagem do slide que contém 2 dia de idade tipo selvagem que N2 vermes primeiro. Enquanto isso, ajuste os parâmetros da imagem latente confocal como potência do laser, pinhole e abertura para assegurar que a cDCFDA intensidade de coloração não é saturado. Nota: Uma vez que essas configurações são definidas, não alterá-los para toda a duração da imagem para esse dia.</li>
		<li>Capturar imagens de 1024 x 1024 pixel de um único avião do intestino (3 a 4 imagens por worm) usando um 60 X lente de ampliação. Nota: O espectro de emissão de cDCFDA em worms renderá um único pico proeminente em 520 nm coincidindo com sua fluorescência relatado espectro20, proporcionando uma leitura de sinal específico que é diferente de autofluorescência intestinal (Figura 3).</li>
		<li>Exporte cru confocal imagem (.lsm) como arquivos. TIFF para cada canal.</li>
		<li>Em seguida, abra o ImageJ e clique em arquivo | Abrir para abrir o arquivo de imagem para ser quantificada. Uma vez que carrega a imagem, use a ferramenta de seleção de forma oval no ImageJ para selecionar uma região de interesse (ROI).</li>
		<li>Depois disso, clique no Analyze | Medida para quantificar a intensidade da fluorescência para o ROI. Selecione 4 – 5 diferentes em foco lisossomos por imagem e calcular a intensidade de fluorescência relativa média de cada região de interesse (ROI).</li>
		<li>Para cada imagem, medir a intensidade de fluorescência de fundo em uma região do intestino entre lisossomos. Subtraia os valores de intensidade de fluorescência de plano de fundo dos valores de intensidade de fluorescência dos lisossomos.</li>
		<li>No total, colete em torno de 30 a 50 individuais valores normalizados para cDCFDA intensidade (animais de 6 a 10) para cada tensão a ser testado. Use esses valores para plotar uma caixa e whisker plot usando qualquer software estatístico adequado. Nota: A coloração pode variar consideravelmente dependendo de fatores como temperatura, tempo de incubação e a saúde geral/idade dos animais que comparações de intensidade de fluorescência só são relevantes no processo de amostras no mesmo experimento coloração. Portanto, é importante processar controles em cada experimento de coloração. Calcular as diferenças estatísticas (t-testes) usando qualquer software estatístico adequado.</li>
		<li>Imagem todas as cepas do mesmo experimento (manchado no mesmo dia) em sequência, tomando cuidado para não alterar nenhum dos parâmetros de imagem.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li>
<li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2758740/">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li>
<li>Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+intracellular+protein-degradation+pathways+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.</a> Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).</li>
<li>Cuervo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+aging%3A+the+importance+of+maintaining+%26%2334%3Bclean%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy and aging: the importance of maintaining &#34;clean&#34; cells.</a> Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).</li>
<li>Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+identifying+effectors+of+alpha-synuclein+misfolding+and+dopaminergic+cell+death+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease.</a> Methods. 53 (3), 220-225 (2011).</li>
<li>Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+amyloid+formation%2C+and+neurodegeneration%3A+a+critical+role+for+molecular+chaperones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?</a> Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10806201">Age-related decline in chaperone-mediated autophagy.</a> J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).</li>
<li>Tonoki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+linking+age-dependent+attenuation+of+the+26S+proteasome+with+the+aging+process%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process.</a> Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).</li>
<li>Squier, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+protein+aggregation+during+biological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and protein aggregation during biological aging.</a> Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enhance+autophagy+and+reduce+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models.</a> Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).</li>
<li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li>
<li>Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+function+and+dysfunction%3A+mechanism+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).</li>
<li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li>
<li>Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+permeabilization+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease.</a> Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+intracellular+proteolytic+systems+change+with+age%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">How do intracellular proteolytic systems change with age?</a> Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10767573">When lysosomes get old.</a> Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).</li>
<li>Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((btn1%2C+the+Schizosaccharomyces+pombe+homologue+of+the+human+Batten+disease+gene+CLN3%2C+regulates+vacuole+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/?report=reader">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+vacuolar+pH+in+yeast+and+identification+of+acidification-defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).</li>
<li>Pringle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+methods+for+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy methods for yeast.</a> Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).</li>
<li>Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Lysosomal+Function+by+the+DAF-16+Forkhead+Transcription+Factor+Couples+Reproduction+to+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).</li>
<li>Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+lysosomal+acidification-The+emerging+role+of+v-ATPase+in+aging+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease.</a> Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).</li>
<li>Kang, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+identifies+ATM+as+a+target+for+alleviating+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence.</a> Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).</li>
<li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-lysosomal+axis+theory+of+aging%3A+accumulation+of+damaged+mitochondria+as+a+result+of+imperfect+autophagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis.</a> Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).</li>
<li>Gerland, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autolysosomes+accumulate+during+in+vitro+CD8%2B+T-lymphocyte+aging+and+may+participate+in+induced+death+sensitization+of+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells.</a> Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).</li>
<li>Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+differential+protein+expression+and+oxidative+modification+of+specific+proteins+in+the+brains+of+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice.</a> Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).</li>
<li>Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+basis+of+lipofuscin%2C+ceroid%2C+and+age+pigment-like+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores.</a> Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).</li>
<li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na%2B%2FH%2B+exchanger+NHX-2+increases+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).</li>
<li>Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+lumenal+chloride+in+the+lysosome+is+critical+for+lysosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Uma variedade de eventos celulares e moleculares contribuem para o envelhecimento, influenciado pela história de vida características e fatores genéticos. Nosso recente estudo22 sugere que o ciclo reprodutivo desempenha um papel importante no controle da aptidão da soma através da regulamentação da dinâmica dos lisossomos pH. Nós mostramos que a proteólise lisossomal mediada é promovido enquanto animais reproduzem-se ativamente por upregulation de transcrição v-ATPase, que por sua vez, garante lis...

A aparência de agregados de proteínas é amplamente aceito para ser uma marca registrada de envelhecimento em pilhas eukaryotic1,2,3e a formação do que é pensado para estar entre os condutores de princípio da senescência celular4 , 5 , 6 , 7. há evidência crescente que, como células de idade catabolismo proteico é prejudicado, levando a um aumento na agregação da proteína. O colapso da proteólise em células de envelhecimento envolve uma imparidade de autofagia8 , bem como a degradação de proteínas mediada por Proteassoma9. Finalmente, oxidação de proteínas irreversível é aumentada em células velhas, prejudicando ainda mais o catabolismo de proteína10.
Autofagia foi inicialmente pensada para ser um processo não-seletivo para degradação em massa de proteínas danificadas, mas estudos recentes têm indicado que autofagia é altamente seletiva para o catabolismo de agregados de proteínas e organelas disfuncionais que não são passível de degradação através de de mecanismos de autorização outros proteína11. Durante o processo de autofagia, proteínas danificadas e agregadas são isoladas em uma vesícula de dupla membrana chamada o autophagosome. Este autophagosome então funde-se com as organelas ácidas chamadas lisossomos, o que leva à degradação do autophagosome carga12. Lisossomos representam o ponto de extremidade da via autophagic e participarem de diferentes processos celulares, tais como a reparação da membrana, controle transcricional e detecção de nutrientes; destacando seu papel centralizado na homeostase celular (revisto em ref. 13). Vários estudos têm demonstrado uma associação entre uma redução dependente da idade na função dos lisossomos e várias de doenças neurodegenerativas13. Consistentemente, restaurando a função dos lisossomos em células mais velhas pode retardar o aparecimento de fenótipos relacionadas ao envelhecimento14,15. Estudos da composição do meio de intralumen sugerem que o colapso da função dos lisossomos em células mais velhas não é devido a uma redução na produção de proteases lisossomais16. Como alternativa, tem sido proposto que perda da acidez intralysosomal, um requisito fundamental da sua actividade enzimática, pode fundamentam a diminuição da proteólise mediada por lisossoma17. Para ser capaz de explorar essa hipótese, é essencial desenvolver protocolos para sondar mudanças dinâmicas no pH dos lisossomos em células vivas de uma forma consistente e replicável e reagentes.
O intestino de c. elegans é o principal tecido metabólico em worms e é um crítico regulador da homeostase sistêmica e vida útil. Temos desenvolvido ensaios para avaliar alterações na acidez do lúmen de lisossomos intestinais de worms para determinar como mediada por lisossoma proteólise contribui para o envelhecimento. Embora sensíveis ao pH fluorophores têm sido utilizados anteriormente em c. elegans para marcar lisossomos intestinais, ainda não houve um esforço para estabelecer um protocolo bem sucedido que pode detectar pequenos aumentos no pH dos lisossomos na vivo18.. Aqui, nós fornecemos um protocolo que pode ser usado para detectar a perda da acidez dos lisossomos em células intestinais de c. elegans usando um protocolo de alimentação simples e conveniente que incorpora um fluoróforo sensíveis ao pH (cDCFDA) OP50 comida.

<table><tbody><tr><td>OP50 (E. coli)</td><td>Centro de</td><td></td> Genética de Caenorhabditis <td>Encomende online em https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>diacetato de 5(6)-carboxi-2',7'-diclorofluoresceína&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Comumente conhecido como cDCFDA</td></tr><tr><td>9-dietilamino-5H-benzo(a)fenoxazina-5-ona e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipirrol-5-il-kappaN(1))metilideno]-2H-pirrol-5-il-kappaN}-N-[2-(dimetilamino)etil]propanamidato)(difluoro)boro</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Comumente conhecido como Lysotracker Microscópio</td></tr><tr><td>confocal vermelho (por exemplo, Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Baixe gratuitamente a partir de https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Caldo em pó</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher</td><td>Scientific S71604</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol em pó</td><td>Sigma</td><td>C3045&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espelho ou outra superfície</td><td></td><td></td><td></td> plana lisa</tr></tbody></table>

avaliação dos lisossomos alkalinization no intestino de viver elegans de caenorhabditis

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

O nemátodo Caenorhabditis elegans (c. elegans) é um sistema de modelo que é amplamente utilizado para estudar a longevidade e os caminhos do desenvolvimento. Tais estudos são facilitados pela transparência do animal, a capacidade de transmitir e reverter ensaios genéticos, a relativa facilidade de gerar proteínas fluorescente etiquetadas e o uso de corantes fluorescentes que podem também ser injetadas no início embrião ou incorporados em seu alimento (e. coli estirpe OP50) para rotular organelas celulares (por exemplo, 9-dietilamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-1 e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Aqui, apresentamos o uso de um corante fluorescente de sensíveis ao pH que manchas lisossomos intestinais, fornecendo uma leitura visual de alterações fisiológicas, dinâmicas na acidez dos lisossomos em worms ao vivo. Este protocolo não mede pH dos lisossomos, mas prefiro visa estabelecer um método confiável de avaliação fisiológicas relevantes variações na acidez dos lisossomos. cDCFDA é um célula-permeant composto que é convertido para o fluorescente fluoróforo 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) após hidrólise por esterases intracelulares. Protonação dentro de lisossomos armadilhas cDCF nestas organelas, onde se acumula. Devido a sua baixa pKa de 4.8, esse corante tem sido usado como um sensor de pH no fermento. Aqui nós descrevemos o uso de cDCFDA como suplemento alimentar para avaliar a acidez dos lisossomos intestinais em c. elegans. Esta técnica permite a detecção de lisossomos alcalinizante em animais vivos,, e tem uma ampla gama de aplicações experimentais, incluindo estudos sobre envelhecimento, autofagia e biogênese dos lisossomos.

cDCFDA manchas de lisossomos em uma maneira dependente do pH, e seu pKa baixo e captação pronta em lisossomos torna um sensor de pH ideal21. cDCFDA intensidade de coloração é inversamente proporcional dos lisossomos pH (ou seja, coloração aumentos de intensidade como pH diminui)18,22. os sinais cDCFDA são consistentemente fracos lisossomos de animais tratados com 20mm de cloroquina, um inibidor da ...

Um guia passo a passo para sondar a perda da acidez dos lisossomos no intestino de c. elegans usando o corante vital sensíveis ao pH 6 - carboxi - 2', 7'-diclorofluoresceína diacetato (cDCFDA)

Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar uma perda relativa de acidez lisossômica nos lisossomos intestinais de C. elegans. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da autofagia, fornecendo indiretamente informações sobre a função lisossômica e a degradação de proteínas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, barata, conveniente e reprodutível.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando observamos a técnica de coloração sendo usada para avaliar a alcalinização vacuolar em leveduras. A demonstração visual deste método é importante porque certas etapas, como adicionar cDCFDA ao alimento OP50 e controlar dois vermes do tipo selvagem de um dia, são críticas. Depois de preparar as placas NGM, deixe as placas secarem em temperatura ambiente por dois dias com a tampa fechada.Em seguida, inocule a bactéria OP50 no caldo Luria estéril. Após a inoculação, deixe o inoculante na incubadora até que a DO esteja entre 0,2 e 0,4. Em seguida, coloque uma gota do inoculante OP50 no centro da placa NGM seca.Em seguida, use um espalhador para espalhar o inoculante em um adesivo de aproximadamente dois por dois centímetros. Aproximadamente após 15 mi

assessing-lysosomal-alkalinization-intestine-live-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Fonte: Le, T. A. N. , et al., Medindo os Efeitos de Bactérias e Produtos Químicos na Permeabilidade Intestinal de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um ensaio baseado em fluorescência para quantificar a permeabilidade intestinal em C. elegans exposto a Pseudomonas aeruginosa. Comparados aos controles alimentados com Escherichia coli, os vermes tratados com patógenos apresentam maior vazamento de fluoróforos para a cavidade corporal, indicando danos na barreira...

Avaliação da permeabilidade intestinal em C. elegans após exposição bacteriana

Este vídeo descreve um ensaio colorimétrico para medição de lactato em lisados celulares usando a enzima lactato desidrogenase. Esta enzima converte lactato em piruvato, juntamente com a conversão de NAD em NADH que reage com corantes de tetrazólio e dá um produto colorido que pode ser medido espectrofotometricamente para quantificar o lactato.

Ensaio Colorimétrico para Quantificação de Lactato em Amostras de Teste

Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Para estudar a relação entre homeostase proteica, estresse e envelhecimento, monitoramos as mudanças no dobramento proteico acompanhando a disfunção proteica, a localização da proteína na célula e a estabilidade proteica nos níveis organismo, celular e proteico, usando o metazoário geneticamente tratável Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Usando Caenorhabditis elegans como um sistema modelo para estudar a homeostase de proteínas em um organismo multicelular

O transparente c. elegans intestino pode servir como uma"em vivo câmara de tecido" para estudar a biogênese de membrana e lúmen apicobasal nível unicelular e subcellular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo descreve como combinar padrão de rotulagem, genética/perda--função de RNAi e abordagens microscópicas para dissecar esses processos em um nível molecular.

O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

O canal excretor de c. elegans é um exclusivo modelo de célula única para a análise visual na vivo de biogênese de membrana de novo polarizada. Este protocolo descreve uma combinação de padrão genético/RNAi e abordagens, adaptávelas para a identificação e caracterização de moléculas dirigindo tubulogenesis unicelulares e apical da membrana e lúmen biogênese de imagem.

O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging

Nós descrevemos uma extração de pequena escala modificada e ensaios colorimétricos de lactato e piruvato no nemátodo elegans do c.. Quando utilizando kits de ensaio comercial, o desenvolvimento técnico da sua sensibilidade e a precisão é importante. Precipitação de proteínas em extração é o passo mais crítico para a determinação quantitativa de metabólitos intracelulares.

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve como medir a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método é útil para a pesquisa biológica básica sobre a saúde intestinal relacionada à interação entre bactérias intestinais e seu hospedeiro e para triagem para identificar agentes probióticos e químicos para curar a síndrome do intestino com vazamento e doenças inflamatórias intestinais.

Medindo os efeitos de bactérias e produtos químicos sobre a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans

O declínio proteostático é uma marca do envelhecimento, facilitando o aparecimento de doenças neurodegenerativas. Delineamos um protocolo para medir quantificadamente a proteostase em dois tecidos elegans caenorhabditis diferentes através da expressão heteróloga de repetições de poliglutamina fundidas a um repórter fluorescente. Este modelo permite uma rápida análise genética in vivo da proteostase.

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

A microscopia de dispersão de Raman estimulada (SRS) permite imagens seletivas e livres de rótulos de moieties químicos específicos e tem sido efetivamente empregada para imagens de moléculas lipídicas in vivo. Aqui, fornecemos uma breve introdução ao princípio da microscopia SRS e descrevemos métodos para seu uso no armazenamento lipídeto de imagem em Caenorhabditis elegans.

Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

O ensino de ciências biológicas pode ser mais estimulante para os alunos por meio do uso da experimentação. Este manuscrito apresenta dois protocolos diferentes, porém complementares, que podem ser utilizados em sala de aula para incentivar os alunos a formular e testar hipóteses relacionadas a dietas hipercalóricas, fome e envelhecimento.

Usando corantes de baixo custo para visualizar o acúmulo de glicogênio e a integridade intestinal em Caenorhabditis elegans

Aprenda a avaliar a perda de acidez lisossômica no intestino de Caenorhabditis elegans usando o corante cDCFDA. Este método simples e reprodutível auxilia pesquisadores em estudos de autofagia e função lisossômica.

Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis

Explorar mais vídeos