Name: Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Aprenda a analisar perfis de mineralização em vesículas de células ósseas humanas hFOB 1.19 e Saos-2 usando microscopia eletrônica de transmissão e microanálise de raios-X. Este método auxilia pesquisadores a compreender processos de mineralização óssea.

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MK e ASK executadas operações manuais e LB preparou desenhos e fez o filme. ASK escreveu o manuscrito, LB escreveu o roteiro e MK preparou a mesa. SM, RB e SP ler criticamente a tabela, o script e o manuscrito. Os autores gostaria de agradecer a Hanna Chomontowska pela sua excelente assistência com Ultramicrotomia bem como Szymon Suski e Henryk Bilski pela excelente assistência com análise TEM-EDX. Os autores gostaria de agradecer o dr Patrick bosques para correção profissional de língua inglesa e Barbara Sobiak para gravar as instruções.
Este trabalho foi apoiado pela concessão N N401 140639 do Ministério da ciência e do ensino superior polonês ao perguntar, por subvenções do centro nacional de ciência, Polónia 2016/23/N/NZ4/03313 LB e 2016/23/N/NZ1/02449 para MK, UE FP7 projeto BIOIMAGINE : BIO-imagem latente em investigação, inovação e educação, GA n. º 264173 e pelos fundos estatutários do Instituto Nencki Instituto de Biologia Experimental, polonês Academia de Ciências.

1. cultura e tratamento da pilha
<ol><li>Coloque todo o material necessário, sob a capa de fluxo laminar e esterilizá-los sob luz UV. Os meios de cultura são: uma mistura 1:1 de presunto é mídia F12 e DMEM com 2,5 mM L-glutamina suplementado com 100 penicilina U/mL, 100 U/mL estreptomicina, 0,3 mg/mL G418 e 10% de soro Fetal bovino (FBS) (v/v) para antígeno grande do T de feto humano hFOB 1.19 SV40 transfectadas osteoblastos e meio de 5A McCoy com 1,5 mM L-glutamina suplementado com 100 penicilina U/mL, 100 U/mL Estreptomicina e 15% FBS (v/v) para as células humanas osteossarcoma Saos-2.</li>
	<li>Cultura de células hFOB 1.19 34 ° c numa atmosfera de 5% de CO2 e células Saos-2 a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO2. Transferência de culturas de células, células de 1.19 ou Saos-2 ou hFOB, da incubadora para o bairro de fluxo laminar e mudar o médio a 10 mL de meio de cultura fresco com FBS.</li>
	<li>Incubar as células sem estimuladores (células de descanso) ou estimulá-los com 50 µ g/mL ácido ascórbico (AA) seguido de 7,5 mM β-glicerofosfato (β-GP), preparado anteriormente em água ultrapura e filtrada através de filtros de seringa 0,22 µm. Adicione os estimuladores de tubos de plástico microcentrifuga sobre a superfície do meio de cultura. Suavemente agitar o prato de cultura e incubar durante 7 dias.</li>
</ol>2. detecção de minerais de cálcio
<ol><li>Lave as culturas de células com salina de tampão fosfato (PBS: 125 mM de NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1mm KH2PO4, pH 7,0).</li>
	<li>Adicionar 5 mL de 2% (g:100 mL) AR-S em PBS, pH 5,0 e incubar as placas durante 30 min manchar os minerais.</li>
	<li>Lavar 3 vezes com PBS. Cuidadosamente adicionar PBS para a parede de prato, não tente destruir os minerais.</li>
	<li>Observar minerais cálcio sob um microscópio invertido e tirar fotos.</li>
</ol>3. visualização das sondas sob luz UV
<ol><li>Para lisados celulares, trate as culturas de células, ou descansando ou estimulada por 7 dias, de acordo com a digestão de colagenase protocolo24.</li>
	<li>Coletar o meio de culturas de células e lavar as células com PBS.</li>
	<li>Digeri as células com 3 mL de 500 colagenase U/mL em uma solução de 0,25 M de sacarose, 0.12 M NaCl, 0,01 M KCl e buffer de 0,02 M Tris-HCl, pH 7,45, a 37 ° C por 3 h.</li>
	<li>Raspar as células mecanicamente, transferi-los para tubos de plástico microcentrifuga e passá-las 10 vezes através de uma seringa de U 1 mL 40 com 0,5 × 16 de agulha.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 500 × g por 5 min.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e suspender o centrifugado em 500 µ l de linfa de cartilagem sintética (SCL, 100 mM de NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glicose, sacarose 63mm, 16,5 mM Hepes, pH 7,4).</li>
	<li>Transferir a hidroxiapatita (HA), fluorapatita (FA) e chlorapatite (CA) pós de garrafas em transiluminador de UV com uma espátula e utilizar como controles.</li>
	<li>Transferir os lisados celulares dos tubos de plástico com pontas de plástico e coloque cuidadosamente o transiluminador UV.</li>
	<li>Tire fotos sob visível e UV luz.</li>
</ol>4. preparação de sondas de temperatura-EDX
<ol><li>Preparação de minerais para a coloração negativa<ol>
<li>Suspender a 2,5 mg de produzido sinteticamente minerais HA, CA e FA25 em 500 µ l de água deionizada e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 por 1h.</li>
		<li>Tirar grades Formvar/carbono 300 Mesh Ni da caixa com pinça antiestática, coloque em um prato de porcelana multi bem e soltar 10 µ l de suspensões HA, CA e FA nas grades.</li>
		<li>Seca as amostras por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de descansar e estimulou as células para a incorporação de 26<ol>
<li>Coletar o médio das culturas de células e lavar as células com o meio de dessensibilização fisiológicos (PD) (125 mM de NaCl, 5 mM KCL, 10mm NaHCO3, 1mm KH2PO4, glicose 10 mM, 20 mM HEPES, pH 7,4).</li>
		<li>Fixe as células com 5 mL de uma mistura de 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) de glutaraldeído em tampão de fosfato de sódio de 100 mM, pH 7,2, por 1h à temperatura ambiente sob a coifa.</li>
		<li>Lavar as células com 5 mL de tampão de fosfato de sódio de 100 mM e com cuidado, remova o tampão após a lavagem.</li>
		<li>No quarto escuro, o postfix as amostras com 2 mL de tetróxido de ósmio (g:100 mL) 1% em tampão de fosfato de sódio de 100 mM, pH 7,2, por 20 min em temperatura ambiente sob a coifa.</li>
		<li>Remover o tetróxido de ósmio e utilizá-lo.</li>
		<li>Lave as células com 5 mL de tampão de fosfato de sódio de 100 mM.</li>
		<li>Então, desidrata-se as amostras em alíquotas de 5 mL de uma série de solução gradual do etanol à temperatura ambiente: 25% (Vol.) por 5 min, 50% (Vol.) por 10 min, 75% (Vol.) por 15 min, 90% (Vol.) por 20 min. Finalmente, usar etanol absoluto duas vezes e incube por 30 min e 12 h.</li>
		<li>Mecanicamente, raspar as células desde os plástico Petri pratos de cultura, coletar em tubos de plástico microcentrifuga e centrifugar as amostras a 130 x g por 1 min.</li>
		<li>Remover os sobrenadantes e suspender as células em 1 mL de uma mistura de resina de LR White e etanol absoluto em uma relação de volume de 1:2.</li>
		<li>Misture bem o conteúdo dos tubos de vidro antes do uso e incube por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 130 x g por 1 min.</li>
		<li>Remover os sobrenadantes e repita a etapa anterior usando 1 mL de uma mistura 1:1 de resina LR White e etanol absoluto.</li>
		<li>Misture bem e incube por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 130 x g por 1 min.</li>
		<li>Remova os sobrenadantes.</li>
		<li>Finalmente, adicionar 1 mL de resina pura LR White para as amostras de duas vezes e incubar por 1h à temperatura ambiente em tubos de plástico.</li>
		<li>Coloque 500 µ l de cada amostra em cápsulas de gelatina. Nota: As amostras são etiquetadas usando uma pequena folha de papel e um lápis para que a resina não destrói os rótulos.</li>
		<li>Fechar as cápsulas de gelatina, coloque-os em tubos de plástico microcentrifuga e centrifugar a 130 x g por 1 min em um rotor basculante.</li>
		<li>Remova as cápsulas dos tubos de plástico usando uma bomba de vácuo.</li>
		<li>Mover as amostras para o forno e polimerizar a 56 ° C por 48 h.</li>
		<li>Prepare os blocos montá-los no suporte e apará-los para a pirâmide.</li>
		<li>Colocar o suporte a ultramicrotome, anexar a faca Ultra 45° de diamante e preenchê-lo com água desionizada; Lembre-se de limpar a lâmina de bolhas de ar incidentais.</li>
		<li>Então corte seções (700 Å) usando a faca de diamante para o banho de água desionizada.</li>
		<li>Definir as sobras usando cílios bovina e lugá-los no lado brilhante da Formvar/carbono 300 malha grade Ni e secá-las.</li>
		<li>Prepare o acetato de uranilo 2.5% (Vol.) em etanol absoluto no escuro sob uma coifa. Manter o acetato de uranilo em um recipiente de chumbo e lembre-se de não pegar o sedimento.</li>
		<li>No quarto escuro, counterstain as grades de apatites sintéticos e amostras de células com 2,5% (Vol.) acetato de uranilo em etanol por 20 min em temperatura ambiente sob a coifa.</li>
		<li>Lavar as grades em etanol a 50% (Vol.), em seguida em água desionizada e secar em temperatura ambiente por 24 h. Finalmente, coloque as grelhas na caixa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. TEM EDX-análise
<ol><li>Imagem latente TEM por um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) equipado com microanálise de raios x dispersiva energia gama completa (EDX) sistema e 11 Megapixel câmera<ol>
<li>Prepare-se para a observação de minerais e células um titular de berílio. Use ferramentas antiestáticas.</li>
		<li>Remover o par de parafusos e levantar a placa de berílio e a arruela de berílio longe do resto do retentor.</li>
		<li>Monte a grade, lado brilhante, no suporte.</li>
		<li>Cuidadosamente coloque a arruela de berílio e placa de berílio e Dane-se firmemente os parafusos de fixação.</li>
		<li>Coloque o suporte para a câmara de vácuo e ligue a bomba de vácuo.</li>
		<li>Depois de um vácuo é alcançado, delicadamente, encaixe o suporte da câmara de imagem e ligue o feixe.</li>
		<li>No monitor fluorescente, defina os parâmetros de abertura do microscópio. Realizar correção de astigmatismo de imagem; definir o zoom, foco e quadro; e tirar fotos TEM em uma ampliação de 50, 000 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagem latente do tronco e microanálise de raios-x para análise espectral e composição<ol>
<li>Insira o detector de raios-x (EDX) energia dispersiva na microscopia eletrônica (tronco) de imagens câmara de varredura transmissão.</li>
		<li>Ajuste a nitidez da imagem no modo de foco.</li>
		<li>Tirar fotos de haste em uma ampliação de 15, 000 X.</li>
		<li>Selecione um ponto da amostra para microanálise de raios-x e coletar espectros.</li>
		<li>Obter dados, somando todos os pesos de atômica para todos os elementos da tabela periódica na amostra (como 100%) e significando o conteúdo de elementos selecionados: Ca, F, Cl e P (como % atômica). Em seguida, calcule os rácios de Ca, F ou Cl de P para cada amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mapeamento de íon<ol>
<li>Selecione elementos como cálcio, flúor, cloro e fósforo para fazer o mapeamento de íon e executar mapas EDX dos elementos selecionados nas amostras.</li>
		<li>Obter dados indicando a localização dos elementos analisados: Ca, F, Cl e P (como % atômica) e calcular a localização co (em %) do Ca, F ou Cl com P para cada amostra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.

No jornal atual, descrevemos os protocolos de coloração, identificação de luz UV de fluorapatita AR-S e TEM-EDX em vitro imagem de MVs lançados pela mineralização de células e de minerais produzidos por MVs. É possível abordar todos os métodos mencionados acima, seguindo algumas etapas de solução de problemas comuns. A fim de obter resultados óptimos, vários passos críticos devem ser realizados com cuidado. Primeiro, é melhor adicionar AA (que é ácida) seguido por β-GP (que é alcalino) para preservar o ...

Osso é um tipo de tecido conjuntivo composto de duas partes: orgânico (células e fibras colágenas) e mineral (compostos de cálcio e fosfato). Os principais componentes minerais nos ossos são apatites1. Diferentes tipos de células competentes de mineralização no osso (osteoblastos), dentes (odontoblastos) e cartilagem (condrócitos) regulam os passos iniciais da mineralização através da produção de proteínas da matriz extracelular (ECM) e liberando a matriz vesículas (MVs) (Figura 1). MVs são vesículas de diâmetro de nm de 100-300 que acumulam cálcio e fosfato, facilitando a nucleação de apatita e posteriormente vincular a colágeno2,3. Em seguida, MVs desintegrar-se para liberar apatites para o meio extracelular. Os apatites continuam a crescer em contato com as fibras de colágeno e formam a matriz óssea. A mineralização é sustentada pela oferta constante de Peu e Ca2 + no meio extracelular. Alguns dados publicados recentemente apoiar nosso modelo4,5. Tecidos moles não mineralize sob condições fisiológicas. No entanto, calcificação ectópica pode ocorrer sob condições patológicas como calcificação vascular3. Células vasculares que adquirem o fenótipo de osteoblastos podem produzir MVs que induzem a nucleação de apatites e iniciar a mineralização nas camadas da parede medial e da íntima dos vasos sanguíneos. Desde calcificação ectópica se assemelham a endocondral normal mineralização3, compreender os mecanismos moleculares da mineralização das células ósseas e condrócitos devem fornecer algumas pistas sobre gravidez ectópica calcificação dos tecidos moles que são formada.
O desenvolvimento dos tecidos esqueléticos é regulado por diversas enzimas, fatores de crescimento e promotores ou inibidores de mineralização. A ação antagonista de tecido-inespecíficos da fosfatase alcalina (TNAP) (Figura 1) e ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesterase eu (NPP1), juntamente com ankyrin (ANK), controla a concentração de pirofosfato inorgânico (PPeu) 6. PPeu, um potente inibidor da formação de HA, é hidrolisado por TNAP; NPP1 hidrolisa trifosfatos de nucleotídeos para formar PPeu enquanto ANK exporta-PPeu da célula para o ECM. A proporção de Pi/PPi pode regular apatita formação7,8 , com possíveis consequências patológicas9.
A membrana de MV é rico em proteínas de transporte de íons que facilitam a precipitação inicial do cálcio e fosfato dentro os MVs durante o processo de nucleação (Figura 1). O transportador de fosfato 1 (PiT) ajuda a incorporar Peu gerados no espaço perivesicular para o MVs10,11. Anexinas podem estar envolvidas na ligação e transporte de Ca2 + e no processo de Biofísica que inicia a mineralização na MV lúmen12,13. Favorecemos a hipótese, sugerida anteriormente, para mineralização dentro de vesículas intracitoplasmática de nucleação interna de apatita dentro o MV antes de sua propagação na ECM14,15. Modelagem em vitro confirmou a indução de Ca2 +/ peu complexos formação em proteoliposomes feitas de PS e AnxA516. Isso pode indicar que a acumulação de Ca2 +, Peu, AnxA5 e PS complexos em balsas lipídicas de membranesrepresent microvilli-como o núcleo de nucleação (NC) de apatita dentro Mvs anexinas e TNAP também possuem ligação de colágeno capacidades que podem ser úteis na colocação de MVs ao longo de fibras de colagénio e, para estimular a propagação da mineralização em ECM. Fetuin A e osteopontin (OPN)17, são conhecidos como inibidores da formação de apatita que pode abrandar a propagação de mineralização no cadafalso colágenas. Nucleação e propagação são eventos distintos, o primeiro anterior a último, e ambos podem ser relevantes para o processo de mineralização patológica.
Para descobrir como a química de complexos de fosfato de cálcio pode alterar mineralização fisiológica e calcificação ectópica, é necessário identificar os minerais produzidos por células. Apatites são um grupo de cálcio e fosfato contendo minerais com cristal geral unidade célula fórmula Ca10(PO4)6X2, onde X = Cl, F, OH. Eles são classificados como segue18: fluorapatita (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 e hidroxiapatita (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.
A escolha de linhas de células osteoblast para induzir a formação de minerais é crucial, pois cada linha celular apresenta um perfil distinto de mineralização. Neste relatório, nós comparamos a nucleação de minerais por dois modelos de célula selecionada humana de mineralização: células osteoblásticas hFOB 1.19 e osteossarcoma Saos-2 células. Osteossarcoma-derivado de células são comumente usadas como modelos osteoblásticas e Saos-2 células têm preservado o caráter osteoblástica mais maduro19 enquanto células indiferenciadas hFOB fetal humano são amplamente utilizadas como um modelo para o normal osteoblástica diferenciação de20. Seus perfis de mineralização foram analisados por métodos diferentes: coloração vermelho de alizarina-S (AR-S), ultravioleta (UV) luz visualização, imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão, energia dispersiva raio-x (EDX) de microanálise quantificação da e íon mapeamento. A vantagem da temperatura-EDX sobre alternativas técnicas utilizadas em estudos anteriores é que dá resultados quantitativos e qualitativos de substituição iônica em cristais de apatita a4,5,21. O objetivo geral de usar TEM-EDX foi encontrar um método simples para geração de imagens e quantificação da distribuição dos íons Ca, F e Cl em vários minerais de diferentes tipos de células durante estágios distintos do processo de mineralização. Este método tem sido utilizado com sucesso, por exemplo, para monitorar a interação de nanopartículas de zinco com produtos químicos coexistentes e seus efeitos combinados em organismos aquáticos22. Em outro estudo, um photocatalyst cobre em materiais de titânio em solução aquosa foi extensivamente caracterizado por espectrometria de emissão óptica de plasma indutivo (ICP-OES), physisorption N2 (BET), XRD, DRS UV-vis, FT-IR, Raman espectroscopia, TEM-EDX e photoelectrochemical medidas23. Nosso objetivo foi comparar a origem e propriedades de vesículas e minerais em duas linhas de celular para entender o mecanismo que controla a mineralização durante a diferenciação óssea.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg"> Figura 1 . Esquema das etapas iniciais de mineralização em células ósseas envolvendo a síntese de proteínas da matriz extracelular (ECM) e a liberação das vesículas de matriz (MVs) da membrana. MVs acumulam cálcio através da ação de proteínas de ligação de cálcio, anexinas e fosfato, através da ação do transportador de fosfato inorgânico (PiT) seguido pela actividade de tecido não-específica da fosfatase alcalina (TNAP), que dephosphorylates PPeu Peu, facilitando assim a nucleação de apatita. Em seguida, MVs desintegrar-se e liberar apatites para o meio extracelular. A mineralização é sustentada pela oferta constante de Peu e Ca2 + no meio extracelular4,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Presunto' s Mistura de mídia DMEM/F12</td><td>PAA</td><td>E15-813</td><td>1:1, para feto humano hFOB 1.19 SV40 osteoblastos transfectados com antígeno T grande (ATCC CRL-11372)</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A PAA</td><td></td><td>E82312-0025</td><td>médio para células Saos-2 de osteossarcoma humano (ATCC HTB-85)</td></tr><tr><td>Mistura de antibióticos (penicilina/estreptomicina)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>100 U/mL cada</td></tr><tr><td>G-418</td><td>Sigma</td><td>68168</td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>10% para hFOB 1,19 e 15% para Saos-2</td></tr><tr><td>AA</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>50 &micro; g / mL</td></tr><tr><td>&szlig;-GP</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td>7,5 mM</td></tr><tr><td>Bio-Gel HTP Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>130-0420</td><td>para HA</td></tr><tr><td>FA</td><td></td><td></td><td>sintetizado por nós</td></tr><tr><td>CA</td><td></td><td></td><td>sintetizado por nós</td></tr><tr><td>Tampão de fosfato de sódio Na2HPO4 / NaH 2PO4 mistura</td><td>Sigma</td><td>S7907 / S8282</td><td>0,1 M, pH 7,2</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7,0, preparado por nós</td></tr><tr><td>AR-S em PBS</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>0,5 g / 100 mL, pH 5,0</td></tr><tr><td>Colagenase tipo IA</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>500 U / mL</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> SCL <td>preparado por nós</td></tr><tr><td>Água deionizada</td><td></td><td></td><td>produzida por nós</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>POCh</td><td>BA6480111</td><td>absoluto 99,8% e soluções 25, 50, 75, 90%</td></tr> <tr><td>Acetato de uranila em 50% de etanol</td><td>Polysciences Inc.</td><td>21447-25</td><td>0,25 g/10 mL</td></tr><tr><td>PD meio</td><td></td><td></td><td>pH 7,4, preparado por nós</td></tr><tr><td>Mistura de fixação (paraformaldeído/glutaraldeído)</td><td>Sigma</td><td>158127/G-6257</td><td>3%:1%</td></tr><tr><td>Pós-fixação OsO4</td><td>Sigma</td><td>75633</td><td>1%</td></tr><tr><td>LR Resina branca em etanol</td><td>Polysciences Inc.</td><td>17411-MUNC 500g</td><td>1:2, 1:1, 100%</td></tr> <tr><td>Acetona</td><td>CHEMPUR</td><td>111024800</td><td>puro</td></tr><tr><td><forte>Ferramenta</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Criogênico Frascos</td><td>Corning Inc.</td><td>430487</td> Placas de cultura de Petri de <td>plástico de 1,2 mL</td></tr><tr><td></td><td>Falcon</td><td>353003</td> Tubos de plástico de <td>100 mm</td></tr><tr><td></td><td>Falcon</td><td>352096 e 352070</td> Pipetas serológicas de <td>15 e 50 mL</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>e VWR</td><td>357521 e 612-3700</td> Tubos de microcentrífuga de <td>plástico de 1 e 10 mL</td></tr><tr><td>Sigma</td><td></td><td>Z688312 e Z628034</td><td>1,5 mL preto e 2 mL transparente</td></tr><tr><td>Pontas de plástico</td><td>VWR</td><td>613-0364, 613-0239 e 613-1050</td><td>0.1-10 &micro; L natural, 1-200 &micro; L amarelo e 200-1000 &micro; L azul</td></tr><tr><td>Racks de plástico</td><td>Light Labs</td><td>A-7055-Z, A-7053-C</td><td>verde para tubos, laranja para microtubos e azul para sondas TEM</td></tr><tr><td>Laminar Hera Save</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>Filtro KS12</td><td>HEPA (H14 de acordo com DIN EN 1822)</td></tr><tr><td>Incubadoras Hera Cell</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>150</td><td>34&deg; C para hFOB 1,19 e 37&deg; C para Saos-2</td></tr><tr><td>Hotte</td><td>POLON</td><td>WCS-2</td><td>para colorações TEM</td></tr><tr><td>Garrafas de vidro</td><td>SIMAX</td><td>1632414501050 e 1632414501100</td><td>50 e 100 mL</td></tr><tr><td>Tubos de vidro de quartzo</td><td>SIMAX</td><td>638422010100</td><td>&Oslash; 10 mm, L 100 mm</td></tr><tr><td>Bomba</td><td>IBS Integra Biosciences</td><td>VACUSAFE conforto</td><td>para vácuo</td></tr><tr><td>Forno</td><td>Memmert</td><td>UNE 400</td><td>56&deg; C</td></tr><tr><td>Placa multipoços de porcelana</td><td>Rosenthal technik</td><td>229/12</td><td>12 poços</td></tr><tr><td>Copos de vidro</td><td>SIMAX</td><td>632417010025</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Garrafas de vidro</td><td>Pocord</td><td>DIN22</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Caixa de plástico</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td></td><td>para a escuridão</td></tr><tr><td>Snap Fit Cápsulas de Gelatina</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>G3741</td><td>tamanho 1</td></tr><tr><td>Formvar / Carbono 300 Mesh Ni grades na caixa</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>Filme S162N3</td><td>no lado brilhante</td></tr><tr><td>Raspador de células de silício</td><td>Sigma</td><td>SIAL0010-100EA</td><td>tamanho 1,8/25 cm</td></tr><tr><td>Seringa com agulha</td><td>Seringa BogMark</td><td>007</td><td>1 mL 40 U, agulha 0,5 x 16</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Chirana</td><td>CH005L</td><td>Centrífuga de 5 mL</td></tr><tr><td>MPW</td><td>Medical Instruments</td><td>MPW-350R</td><td>130 x g e 500 x g</td></tr><tr><td>transiluminador UV</td><td>UVP</td><td>M-20</td><td>para luz visível e UV</td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>LKB</td><td>NOVA</td><td>700&Aring; seções</td></tr><tr><td>Suporte de bloco</td><td>LKB</td><td>E6711</td><td>forma redonda</td></tr><tr><td>Faca de diamante</td><td>DiATOME</td><td>Ultra 45&deg;</td><td>tamanho 3</td></tr><tr><td>Porta-pestanas</td><td></td><td></td><td>bovino, preparado por nós</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>ROTH</td><td>2855.1</td><td>antiestático para grelhas</td></tr><tr><td>Conjunto de espátulas</td><td>ROTH</td><td>E286.1</td><td>antiestático para pós</td></tr><tr><td><forte>Imagem</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Luz Invertida</td><td>Zeiss com Canon</td><td>AxioObserver Z1 equipado com PowerShot G9</td><td>Contraste de fase, luz transmitida, 20 x objetiva, filtros RGB</td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Transmissão</td><td>TEM Jeol Co. com Oxford Instruments e SiS-Olympus</td><td>JEM-1400 TEM equipado com sistema de microanálise de raios X (EDX) por dispersão de energia INCA de gama completa e ampliação de câmera MORADA G2 de 11 megapixels</td><td>50.000X para TEM e 15.000X para STEM e EDX</td></tr><tr><td>Corpo da câmera e lentes</td><td>Nikon</td><td>Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D </td><td>para gravações de filmes</td></tr><tr><td>Microfone</td><td>MXL Mics</td><td>Tempo</td><td>para gravações de voz</td></tr></tbody></table>

análise de minerais produzidos por hfob 1.19 e saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Este vídeo apresenta o uso da microscopia eletrônica de transmissão com microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX-TEM) para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Estas linhas de celular, após o tratamento com ácido ascórbico (AA) e β-glicerofosfato (β-GP), submetido a completa transdiferenciação celular osteogênico de proliferação de mineralização e produzir vesículas de matriz (MVs) que desencadeiam a nucleação de apatita na matriz extracelular (ECM).
Com base na coloração de vermelho de alizarina-S (AR-S) e análise da composição dos minerais em lisados celulares usando luz ultravioleta (UV) ou em vesículas utilizando imagens TEM seguida por íon mapeamento e quantificação de EDX, podemos inferir que osteossarcoma Saos-2 e osteoblásticas células hFOB 1.19 revelaram perfis distintos de mineralização. SAOS-2 células mineralize mais eficientemente do que as células hFOB 1.19 e produzem maiores depósitos minerais que não são visíveis sob luz UV, mas são semelhantes a hidroxiapatita (HA), em que eles têm mais Ca e F substituições.
Os resultados obtidos com estas técnicas nos permitem concluir que o processo de mineralização difere dependendo do tipo de célula. Propomos que, a nível celular, a origem e as propriedades das vesículas predeterminar o tipo de minerais.

Temperatura-EDX permite obter a imagem em vitro das vesículas de matriz (MVs) lançadas pela mineralização de células e de minerais produzidos por Mvs. os resultados obtidos usando esta técnica demonstram que o processo de mineralização pode proceder de forma diferente em vários tipos de células. As linhas de duas células receberam o mesmo tratamento de transdiferenciação celular osteoblástica, ainda estimulados Saos-2 células mais eficientemente do que hFOB mineralizado ...

Apresentamos um protocolo para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Seus perfis de mineralização foram analisados por alizarina Red-S (AR-S) coloração, visualização de luz ultravioleta (UV), imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão e microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX).

Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Durante as etapas iniciais da mineralização, as células produzem proteínas da matriz extracelular e liberam vesículas da matriz que acumulam cálcio e fosfato para facilitar a nucleação da apatita. Neste relatório, comparamos a nucleação de minerais por dois modelos de células humanas selecionados, células osteoblásticas hFOB 1.19 e osteossarcoma Saos-2. Seus perfis de mineralização foram analisados por diferentes métodos.Coloque todos os materiais sob o laminar e esterilize-os sob luz ultravioleta. Troque o meio para 10 mililitros de meio de cultura fresco com soro fetal bovino. As células em repouso são incubadas sem estimuladores, enquanto as células estimuladas são tratadas com ácido ascórbico e betaglicerofosfato.Primeiro, coloque suavemente o ácido ascórbico até a concentração final de 50 microgramas por mililitro na superfície do meio de cultura para estimular as células. Em seguida, adicione beta-glicerofosfato à concentração final de 7,5 milimolares em meio de cultura para estimular as células. Mexa delicadamente o prato de cultura e coloque-o na incubadora por sete dias.Após sete dias de incubação, lave as culturas de células com solução salina tamponada com fosfato, PBS. Adicione cinco mililitros de vermelho de alizarina 2% e incube a placa por 30 minutos para manchar os minerais. Lave três vezes com PBS.Adicione PBS com cuidado à parede do prato. Tente não destruir os minerais. Observe os minerais sob um microscópio de luz invertida.Colete o meio de culturas de células e lave as células com PBS. Digerir células em repouso ou estimuladas por sete dias com 500 unidades por mililitro de solução de colagenase a 37 graus por três horas. Em seguida, raspe mecanicamente as células.Transfira-os para tubos de microcentrífuga de plástico. Passe-os por uma seringa 10 vezes. Centrifugar as amostras a 500 g durante cinco minutos.Descarte o sobrenadante e suspenda o pellet celular em 500 microlitros de linfa de cartilagem sintética. Transfira os pós de hidroxiapatita, fluorapatita e clorapata dos frascos no transiluminador UV com espátula e use como controle. Transfira os lisados celulares dos tubos de plástico com pontas de plástico e coloque cuidadosamente no transiluminador UV.Suspenda 2,5 miligramas de pós de hidroxiapatita, fluorapatita e clorapatita em 500 microlitros de água deionizada. Incube a 37 graus por uma hora. Pegue as grades Formvar / níquel de carbono da caixa com pinça antiestática e coloque-as em uma placa de porcelana com vários poços.Coloque 10 microlitros da suspensão de hidroxiapatita nas grades. Faça o mesmo para clorapata e fluorapatita. Seque as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente.Prepare as células em repouso e estimuladas para incorporação. Colete o meio das culturas de células. Lave as células em meio de dessensibilização fisiológica.Fixe as células com cinco mililitros de uma mistura de 3% de paraformaldeído e 1% de glutaraldeído em tampão de fosfato de sódio 100 milimolar por uma hora em temperatura ambiente sob a capela de exaustão. Lave as células com cinco mililitros de tampão fosfato de sódio 100 milimolares. Remova cuidadosamente o tampão após a lavagem.Na sala escura, fixe as amostras com dois mililitros de tetróxido de ósmio a 1% em tampão fosfato de sódio a 100 milimolares. Incubar as amostras durante 20 minutos à temperatura ambiente sob a hotte. Remova o tetróxido de ósmio e utilize-o.Lave as células com cinco mililitros de tampão fosfato de sódio 100 milimolares. Em seguida, desidrate as amostras em alíquotas de cinco mililitros de uma série graduada de solução de etanol à temperatura ambiente, 25, 50, 75 e 90% de etanol. Por fim, use etanol absoluto duas vezes e incube por 30 minutos e 12 horas.Raspe mecanicamente as células das placas de cultura. Colete as células em tubos de microcentrífuga de plástico. Centrifugar as amostras a 130 g durante um minuto.Remova os sobrenadantes. Suspender as células numa mistura de resina LR White e etanol absoluto numa proporção de volume de um para dois. Misture bem e incube por 30 minutos em temperatura ambiente.Centrifugar as amostras a 130 g durante um minuto. Remova os sobrenadantes. Repita o passo anterior usando uma mistura de resina LR White e etanol absoluto.Misture bem e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Centrifugar as amostras a 130 g durante um minuto. Remova os sobrenadantes.Adicione resina LR White pura às amostras e incube por uma hora em temperatura ambiente em tubos de plástico. Centrifugar as amostras a 130 g durante um minuto. Remova os sobrenadantes.Adicione novamente resina LR White pura. Coloque 500 microlitros de cada amostra em cápsulas de gelatina. Observe que as amostras são rotuladas com uma pequena folha de papel e um lápis para que a resina não destrua as etiquetas.Feche as cápsulas de gelatina. Coloque as cápsulas em tubos de microcentrífuga de plástico. Centrifugar a 130 g durante um minuto num rotor basculante.Remova as cápsulas dos tubos de plástico usando uma bomba de vácuo. Mova as amostras para o forno e polimerize a 56 graus por 48 horas. Prepare os blocos montando-os no suporte.Coloque o suporte no ultramicrótomo. Anexe a faca de diamante. Encha-o com água deionizada.Lembre-se, limpe a lâmina das bolhas de ar acidentais. Em seguida, corte as seções usando uma faca de diamante no banho-maria deionizado. Defina as sobras usando cílios bovinos.Em seguida, coloque-os no lado brilhante da grade Formvar / níquel carbono e seque-os. Na sala escura, contra-corar as grades de apatitas sintéticas e amostras de células com acetato de uranila 2,5% em etanol por 20 minutos em temperatura ambiente sob capela de exaustão. Lave as grades em etanol a 50%, depois em água deionizada e seque em temperatura ambiente por 24 horas.Por fim, coloque as grades na caixa. Prepare o suporte de berílio para a observação de minerais e células. Use ferramentas antiestáticas.Remova o par de parafusos. Levante a placa de berílio e a arruela de berílio do resto do retentor. Monte a grade, com o lado brilhante para cima, no suporte.Coloque cuidadosamente a arruela de berílio e a placa de berílio. Aperte bem os parafusos de fixação. Coloque o suporte na câmara de vácuo e ligue a bomba de vácuo.Assim que o vácuo for alcançado, insira suavemente o suporte na câmara de imagem e ligue o feixe. No monitor fluorescente, defina os parâmetros de abertura do microscópio. Realize a correção do astigmatismo de imagem.Defina o zoom, o foco, o quadro e tire uma imagem de microscopia eletrônica de transmissão. Mova o detector para a câmara de imagem. Ajuste a nitidez da imagem no modo de foco.Selecione um ponto na amostra para microanálise de raios-X e colete espectros. Selecione elementos como cálcio, flúor, cloro e fósforo para fazer o mapeamento de íons e executar mapas dos elementos selecionados. As células Saos estimuladas mineralizaram com mais eficiência do que os osteoblastos hFOB.Apenas fluorapatitas podem ser observadas sob excitação de luz UV. Os lisados de células HFOB foram mais fluorescentes do que os Saos, sugerindo que as fluorapatitas são mais abundantes nessas células. As células Saos estimuladas produzem mais vesículas contendo minerais em comparação com as células hFOB e as células Saos em repouso.As apatitas sintéticas apresentaram diferentes formas minerais. O procedimento aplicado acima mostrou a presença de vesículas em células hFOB e Saos em condições de repouso e estimuladas. Os pontos vermelhos indicam as distribuições de cálcio, fósforo verde e flúor azul.Sob condições estimuladas, houve uma forte sobreposição entre as distribuições de cálcio e fósforo nas vesículas produzidas pelas células Saos e entre flúor e fósforo nas vesículas produzidas pelas células hFOB. Em conclusão, nossos achados indicam que as vesículas são determinantes chave da nucleação mineral, especialmente no nível celular. A comparação de vesículas liberadas de células Saos-2, que mineralizam com mais eficiência, e vesículas liberadas de células hFOB 1.19 apóiam a hipótese de que as vesículas da matriz são vesículas cheias de minerais.Isso deixa em aberto a questão de saber se a presença de vesículas da matriz é necessária para induzir a nucleação da apatita e como isso pode alterar a mineralização fisiológica para patológica.

analysis-minerals-produced-hfob-119-saos-2-cells-using-transmission

Research

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Chemistry

Química

Aqui, apresentamos um protocolo sobre como determinar a quantidade e distribuição de metais em uma amostra usando fluorescência de raios X síncrotron. Nós nos concentramos nas células aderentes e descrevemos o método de fixação química para preparar esta amostra. Em seguida, descrevemos como montar e obter imagens da amostra usando raios-X síncrotron.

Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation

O uso de tomografia de raios-X por dispersão de energia no microscópio eletrônico de transmissão de varredura para caracterizar distribuições elementares dentro de nanopartículas únicas em três dimensões é descrito.

Tomografia de raios-X de energia dispersiva para 3D Elemental Mapeamento de nanopartículas individuais

Devido à importância e ampla utilização de paládio, ouro e cobalto   metais em equipamentos de alta tecnologia, a sua recuperação e reciclagem constituem um importante desafio industrial. O sistema de recuperação de metal aqui descrito é uma low-cost simples, significa para a eficaz detecção, remoção e recuperação destes metais da mina urbana.

Detecção e recuperação de paládio, do ouro e cobalto Metais da Mina Urbana Usando novos sensores / adsorventes Designados com poros em nanoescala em forma de roda de carroça

O protocolo de fabricação de um microchip de extração em fase sólida assistido por dipolo para a análise de traços de metal é apresentado.

Fabricação de um dipolo-assistida Fase Sólida Extração Microchip para análise de metais traço em amostras de água

Descrevemos um procedimento para a detecção de elementos químicos presentes em situ em células humanas, bem como a sua quantificação em vitro . O método é adequado para qualquer tipo de célula e é particularmente útil para análises químicas quantitativas em células únicas em vitro exposição a nanopartículas de óxido metálico.

In Situ Deteção e única célula quantificação de nanopartículas de óxido de Metal usando análise de microsonda Nuclear

Aqui, vamos mostrar o uso do software de montagem de fluorescência de raio-x, mapas, criado pelo Laboratório Nacional Argonne, para a quantificação dos dados de microscopia de fluorescência. Os dados quantificados que resulta são útil para a compreensão da distribuição elementar e rácios estequiométricos dentro de uma amostra de interesse.

Quantificação dos dados de fluorescência de raios-x usando mapas

Apresentamos um procedimento para geração de imagens em tempo real e análise de composição elementar das partículas boemita em água desionizada por em situ líquido microscopia eletrônica de varredura.

In Situ Caracterização de partículas boemita na água usando o líquido SEM

Nós descrevemos uma configuração de trajetória para realizar mapeamento de microdiffraction fluorescência e raio-x rápida radiografia bidimensional do único cristal ou pó amostras usando Laue (radiação policromática) ou difração (radiação monocromática). Os mapas resultantes fornecem informações sobre tensão, orientação, distribuição de fase e deformação plástica.

Síncrotron Microdiffraction de raio-x e imagem latente de fluorescência das amostras de rocha e minerais

A análise da morfologia, composição e espaçamento da exsolução lamellae pode fornecer informações essenciais para entender os processos geológicos relacionados ao vulcanismo e metamorfose. Apresentamos uma nova aplicação do APT para a caracterização de tal lamelae e comparamos essa abordagem ao uso convencional de microscopia eletrônica e nanotomografia baseada em FIB.

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Apresentado aqui é um protocolo para a cultura celular em membranas de nitreto de silício e congelamento de mergulho antes da imagem de fluorescência de raios-X com uma nanossonda de raios-X criogênico síncrotron. Quando apenas a temperatura ambiente nano-análise é fornecida, as amostras congeladas podem ser mais liofilizadas. Estes são passos críticos para obter informações sobre a composição elementar intracelular.

Cultura celular em membranas de nitreto de silício e criopreparação para a fluorescência de raios-X synchrotron Nano-análise

Fornecemos um esboço geral de métodos quantitativos de microanálise para estimar as ocupações do local de impurezas e seus estados químicos, aproveitando fenômenos de canalização eletrônica sob condições de agitação de raios-elétron incidentes, que extraem informações confiáveis de espécies minoritárias, elementos de luz, vagas de oxigênio e outros defeitos point/line/planar.

Análise quantitativa do local atômico de defeitos funcionais/pontos em materiais cristalinos por Microanálise Aprimorada por Canalização eletrônica

Aprenda a analisar perfis de mineralização em vesículas de células ósseas humanas hFOB 1.19 e Saos-2 usando microscopia eletrônica de transmissão e microanálise de raios-X. Este método auxilia pesquisadores a compreender processos de mineralização óssea.

Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x (Vídeo) | JoVE Journal

Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x

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